Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Artikels soll das Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen (CSCs) aus dem Herzen der erwachsenen Maus zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Zentrifugation Methode, murine CSCs zu isolieren und ausgearbeiteten Methoden für CSC-Kultur, Proliferation und Differenzierung in Herzmuskelzellen.

Abstract

Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität auf der ganzen Welt. Ein wesentliches Ziel der regenerativen Medizin ist der Tote Herzmuskel nach MI wieder aufzufüllen. Obwohl mehrere Strategien verwendet wurden, um den Herzmuskel zu regenerieren, bleibt Stammzell-Therapie einen wichtigen Ansatz für Tote Herzmuskel eines MI Herzens wieder aufzufüllen. Beweise sammeln schlägt das Vorhandensein von resident kardiale Stammzellen (CSCs) in das Erwachsene Herz und ihre endokrine und/oder parakrine Effekte auf die kardialen Regeneration. CSC-Isolierung und deren Charakterisierung und Differenzierung in Richtung Herzmuskelzellen, vor allem Kardiomyozyten bleibt jedoch eine technische Herausforderung. In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache Methode zur Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von CSCs aus dem Herzen der erwachsenen Maus. Hier beschreiben wir eine Dichte Gradienten Methode zur Isolierung von CSCs, wo das Herz durch eine 0,2 % Kollagenase II Lösung verdaut wird. Um das isolierte CSCs zu charakterisieren, haben wir den Ausdruck von CSCs/Cardiac Marker, Sca-1, NKX2-5 und GATA4 und Pluripotenz/Stemness Marker OCT4, SOX2 und Nanog ausgewertet. Wir bestimmt auch die Proliferation Potenzial der isolierten CSCs durch sie in einer Petrischale züchten und die Bewertung des Ausdrucks der Verbreitung Markierung Ki-67. Für die Bewertung der Differenzierung Potenzial des CSCs, wählten wir sieben - zehn - Tage kultiviert CSCs. Wir übertragen sie auf eine neue Platte mit einem Cardiomyocyte Differenzierung Medium. Sie werden in einer Zelle-Kultur-Inkubator für 12 Tage inkubiert, während die Differenzierung Medium alle drei Tage gewechselt wird. Die differenzierte CSCs express Cardiomyocyte-spezifische Marker: Actinin und Troponin ich. So CSCs isoliert mit diesem Protokoll haben Stemness und kardialen Marker, und sie haben ein Potenzial für Proliferation und Differenzierung in Richtung Cardiomyocyte Abstammung.

Introduction

Ischämische Herzkrankheiten, einschließlich Myokardinfarkt (MI), ist eine der Hauptursachen des Todes rund um die Welt¹. Stammzell-Therapie für die Regeneration Tote Herzmuskel bleibt ein wichtiger Ansatz zur Verbesserung der Herzfunktion eine MI Herz^2,3,4,5. Verschiedene Arten von Stammzellen haben, Tote Herzmuskel wieder aufzufüllen und die Herzfunktion eines MI Herzens zu verbessern. Sie können im großen und ganzen in⁶ und Erwachsenen Stammzellen embryonaler Stammzellen eingeteilt werden. In....

Protocol

Gehäuse, Anästhesie und Opfer von Mäusen wurden nach dem genehmigten Protokoll der IACUC von der University of Nebraska Medical Center durchgeführt.

(1) Materialien

1. Einsatz 10 bis 12 Wochen alten C57BL/6J schwarz können auch männliche Mäuse auf der institutionellen Tierhaus für die Isolierung von CSCs. CSCs im Haus gehalten werden von nicht-schwangeren weiblichen Mäusen isoliert.
2. Alle notwendigen chirurgischen Instrumente, einschließlich Chirurgische Scheren, feine Chirurgische Scheren, gebogener Schaft Zange und einer chirurgischen Klinge durch Autoklavieren zu sterilisieren Sie vor der Euthanasie der Maus.
3. CS....

Results

In der vorliegenden Studie werden CSCs von 10 bis 12 Wochen alten C57BL/6J männliche Mäuse Herz isoliert. Hier haben wir eine einfache Methode für CSC-Isolierung und Charakterisierung mit Hilfe von Markern der Pluripotenz präsentiert. Wir stellten auch eine elegante Methode zur Differenzierung der CSC und die Charakterisierung von CSCs, die in Richtung Herzzellen Linie unterschieden. Wir beobachteten eine Spindel Form Morphologie des 2 -, 3-Tage-kultivierte CSCs unter dem Phasenkontrast-M.......

Discussion

Die entscheidenden Schritte dieses CSC-Isolierung-Protokolls sind wie folgt. (1) ein sterilisierter Zustand ist für die Extraktion der Herzen von den Mäusen einzuhalten. Eine Kontamination während der Extraktion des Herzens beeinträchtigen die Qualität des CSCs. 2) Blut muss vollständig entfernt werden, bevor trippelnd Herzens, die durch mehrere Wäschen von ganzem Herzen und dem Herzen Stücke mit HBSS Lösung erfolgt. (3) das Herz-Stück müssen vollständig in einer einzelligen Suspension mit Kollagenase Lösung lysiert werd.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mäuse	The Jackson laboratory, USA	Best.-Nr. 000664
Antikörper:
OCT4-Abcam		ab18976 (Kaninchen polyklonal)	OCT4-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
SOX2	Abcam	ab97959 (Kaninchen polyklonal)	SOX2-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Nanog	Abcam	ab80892 (Kaninchen polyklonal)	Nanog-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Ki67	Abcam	ab16667 (Kaninchen polyklonal)	Ki67-Primärantikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Sca I	Millipore	AB4336 (Kaninchen polyklonal)	Sca I Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
NKX2-5	Santa Cruz	sc-8697 (Kaninchen polyklonal)	NKX2-5-Primärer Antikörper - 1:50 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
GATA4	Abcam	ab84593 (Kaninchen polyklonal)	GATA4-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
MEF2C	Santa Cruz	sc-13268 (Ziege polyklonal)	MEF2C-Primärer Antikörper - 1:50 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Troponin I	Millipore	MAB1691 (Maus monoklonal)	Troponin I-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Actinin	Millipore	MAB1682 (Maus monoklonal)	Actinin-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
ANP	Millipore	AB5490 (Maus polyklonal)	ANP-Primärer Antikörper - 1:100 Verdünnung, Sekundärer Antikörper - 1:200 Verdünnung, in Blockierungslösung
Alex Fluor-488 checken Anti-Kaninchen Life-Technologie		Ref. Nr. A21441
Alex Fluor-594 Anti-Kaninchen-Technologie für Ziegen	Life-Technologie	Ref-Nr. A11012
Alex Fluor-594 Anti-Kaninchen Anti-Ziegen-Technologie	Life-Technologie	Ref.-Nr. A11078
Alex Fluor-488 Checken Anti-Maus Life-Technologie		Ref.-Nr. A21200
Alex Fluor-594 Checken Anti-Ziegen-Life-Technologie		Ref-Nr. A21468
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
Kulturmedium:
CSC Erhaltungsmedium	Millipore	SCM101	Hinweis: Für die CSC-Kultur wurde PBS oder unvollständiges DMEM-Medium zum Waschen der Zellen verwendet
Kardiomyozyten Differenzierungsmedium	Millipore	SCM102
DMEM	Sigma-Aldrich	D5546
Name	Company	Katalognummer	Comments
Cell Isolation Puffer:
Polysaccharose- und Natriumdiatrizoatlösung (Histopaque1077)	Sigma	10771
HBSS	Gibco	2018-03
Kollagenase I	Sigma	C0130
Dispase-Lösung	STEMCELL Technologies	7913
PBS	LONZA	S1226
StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz	Thermowissenschaftlich	A1110501
Andere Reagenzien:
BSA	Sigma	A7030
Normales kontrolliertes Serum	Vektorlabor	S3000
DAPI-Lösung	Applichem	A100,0010	Dapi, Arbeitskonzentration-1 & Mikro; g/mL
Trypanblau	Biorad	145-0013
Trypsin	Sigma	T4049
StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Formaldehyd	Sigma	158127
Triton X-100	ACROS	Cas Nr. 900-293-1
Tween 20	Fisher Sceintific	Lot Nr. 160170
Ethanol	Thermo Scientific
Name	>Unternehmen	<>Katalognummer	Kommentare
<>Gewebekulturmaterialien:
100 mm Petrischale	Thermo Scientific
6-Well-Platte	Thermo Scientific
24-Well-Platte	Thermo Scientific
T-25 Kolben	Thermo Scientific
T-75 Kolben	Thermo Scientific
15 ml konisches Röhrchen	Thermo Scientific
50 mL konisches Röhrchen	Thermo Scientific
40 & Mikro; m Zell-Färbegerät	Fisher Scientific	22363547
100 µ m Zell-Färber	Fisher Scientific	22363549
0,22 µ m Filter	Fisher Scientific	09-719C
10 mL Spritze	BD	Ref Nr. 309604
10 µ L, 200 & Mikro; L, 1000 &Mikro; L Pipettenspitzen	Fisher Scientific
5 mL, 10 mL, 25 mL Einwegpipette aus Kunststoff	Thermo Scientific
Name	Company<	strong>Katalognummer	<>Kommentare
Instrumente
Zentrifugenmaschine	Thermo Scientific	LEGEND X1R Zentrifuge
EVOS Mikroskop	Life-Technologie
Automatisierter Zellzähler	Biorad
Zellzählobjektträger	Biorad	145-0011
Pippte Aid	Thermo Scientific	S1 Pipettenfüller
Name<	strong>Company	Katalognummer	Kommentare
Chirurgische Instrumente:
Chirurgische Schere	Feines wissenschaftliches Werkzeug
Feine chirurgische Schere	Feines Scientific Tool
Kurvenschaftzange	Feines wissenschaftliches Werkzeug
Chirurgische Klinge	Fine Scientific Tool