Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Abstract

Sezernierten Faktoren, Membran-angebunden-Rezeptoren und ihren Interaktionspartnern sind wichtigsten Regulatoren des Mobilfunkes und Einleitung der Signalisierung Kaskaden während der Homöostase und Krankheit, und als solche therapeutischen Ziele dar. Trotz ihrer Relevanz bleiben diese Interaktion Netze deutlich unterrepräsentiert in aktuellen Datenbanken; Daher müssen die extrazellulären Proteine keine dokumentierten Bindungspartner. Diese Diskrepanz ist vor allem auf die Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Studium der extrazellulären Proteine, einschließlich Ausdruck Funktionsproteine und der schwachen, niedrige Affinität, Protein-Interaktionen, die oft zwischen Zellrezeptoren Oberfläche hergestellt. Diese Methode dient zum Drucken einer Bibliothek von extrazellulären Proteinen in einem Microarray-Format für das Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen beschreiben. Zur Erkennung der schwachen Wechselwirkungen zu ermöglichen, wird eine Methode basiert auf Multimerization des Proteins Abfrage unter Studie beschrieben. Dabei Microbead-basierte Multimerization für erhöhte Multivalenz gekoppelt, ermöglicht die Protein-Microarray robuste Erkennung von transienten Protein-Protein-Interaktionen in hohem Durchsatz. Diese Methode bietet einen schnellen und niedrigen Probe verbraucht-Ansatz zur Identifizierung von jedem extrazelluläre Protein für neue Interaktionen. Protein-Microarray-Druck und screening-Protokoll werden beschrieben. Diese Technologie wird für die Ermittler suchen eine robuste Methode zur Entdeckung von Protein-Interaktionen in den Extrazellulärraum nützlich sein.

Introduction

Die Methode überprüft hier beschreibt das Drucken aus einer Sammlung von extrazellulären Proteine in einem Microarray-Format, gefolgt von einer Methode für das Screening eines Ziels des Interesses gegen diese Bibliothek. Wir haben als ein entscheidender Schritt für die Erkennung von Interaktionen gekennzeichnet durch niedrige verbindliche Affinitäten Protein Multimerization identifiziert. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu verbessern, beschreiben wir ein Protokoll basiert auf Multimerization der Abfrage-Proteins des Interesses mit Microbeads.

Sezerniert und Oberfläche ausgedrückt Zellproteinen (kollektiv extrazellulären Proteine genannt)....

Protocol

1. Generation aus einer Bibliothek von extrazellulären menschliche Proteine

1. Stellen Sie eine Liste der Zelle Oberfläche Rezeptoren oder sekretierten Proteine des Interesses, die Protein-Microarray-Bibliothek zu bauen. Bestimmte Proteinfamilien (z. B. der Immunglobulin-Superfamilie) oder Proteine selektiv ausgedrückt insbesondere Zelle Arten für die Studie ausgewählt werden können.
2. Bestimmen Sie für Oberfläche Zellrezeptoren die Domänengrenzen der extrazellulären (ECD) durch Ermittlung der Signalpeptid und transmembranen Regionen mit Software-Tools. Einige der einschlägigen Werkzeuge, online frei verfügbar, sind in der Tabelle der Materialie....

Results

Eine schematische Darstellung des Workflows für die extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Sobald die Microarray-Folien mit der extrazelluläre Protein-Bibliothek zur Verfügung stehen, kann das Screening des Proteins des Interesses und Datenanalyse innerhalb eines Tages abgeschlossen werden. Viele physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen Membran eingebettet Rezeptoren zeichnen sich durch sehr schwache Bindung stär.......

Discussion

Eine beträchtliche Anzahl von Orphan Rezeptoren bleiben im menschlichen Genom und neuartige interagierenden Partner weiterhin für die extrazellulären Proteine mit bisher charakterisierten Liganden entstehen. Festlegung der Rezeptor-Ligand-Interaktionen in der Human- und Modellorganismen ist wichtig zum Verständnis der Mechanismen, die zelluläre Kommunikation während der Homöostase sowie Dysregulation führt zu Krankheit zu bestimmen, und daher zu informieren, neue oder verbesserte therapeutische Optionen. Erkennung von ex.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrareines Glycerin in MB-Qualität	USB Corporation	56-81-5	Proteinspeicherung
SeptoMark Blockierungspuffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking-Puffer-Microarray-Objektträger
Rinderserumalbumin	Roche	03-117-957-001	Objektträgersteuerung für die Maskenanpassung (optional)
Polypropylen-Multiwell-Platten	Greiner Bio One	82050-678	Proteinlagerung
Polypropylen-Multiwell-Platten	Arrayit	MMP384	Objektträgerdruck
NanoPrint LM60 oder ähnlicher Kontakt Microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60 oder ein ähnlicher Kontakt-Microarrayer	Objektträgerdruck
Mikro-Spotting-Pins	Arrayit	Micro-Spotting-Pins	Objektträgerdruck
ZeptoFOG-Blockierstation	Zeptosens	ZeptoFOG-Blockierstation, 1210	Block-Objektträger nach dem Druck
Magermilchpulver	Thermo Fisher	LP0031	Blocklösung
Objektträger mit Epoxysilan-Beschichtung	Nextrion Objektträger E	1064016	Microarray-Objektträger
Glashalter und Objektträgergestell Set	Wheaton	900303	Objektträgeraufbewahrung
Cy5 Monoreaktivfarbstoff	GE Healthcare	PA23031	Albuminmarkierung
Cy5 Monoreaktivfarbstoff	GE Healthcare	PA25001	Human IgG-Markierung
Pro-Spin Entsalzungssäule	Princeton Trennungen	CS-800	Entfernen Sie den freien Farbstoff
Selbstklebende Aluminiumfolie	Siegel AlumaSeal	F-384-100	Versiegeln Sie Lagerplatten
Polypropylen Kryofläschchen	Corning	430658	Master Fläschchen für die Lagerung von Proteinbibliotheken
Protein A Mikrokügelchen	Miltenyi	120-000-396	Abfrage Proteinmultimerisierung
Human IgG	Jackson Immunresearch	& nbsp; 009-000-003	Irrelevantes IgG für die Markierung von
Protein A	Sigma	P7837	Microarray-Objektträgerblockierung
Hybridisierungsstation, a-Hyb oder ähnliche	Miltenyi	Hybridisierungsstation, a-Hyb oder ähnlich	Automatisierte Microarray-Verarbeitung (optional)
GenePix 4000B Scanner oder ähnlich	Molecular Devices	GenePix 4000B Scanner oder ähnliches	Objektträgerscannen
GenePix Pro oder gleichwertige Datenextraktionssoftware	Molecular Devices	GenePix Pro oder gleichwertige Datenextraktionssoftware	Datenverarbeitung
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technische Universität Dänemark	Online-Software	Vorhersagetool zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Lage von Signalpeptid-Spaltstellen
TMHMM 2.0 Server	DTU Bioinformatics, Technische Universität Dänemark	Online-Software	Vorhersage von Transmembranhelices in Proteinen
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	Online-Software	Ein kombinierter Transmembran-Topologie- und Signalpeptid-Prädiktor
TOPCONS	Online-Software	der Universität Stockholm	Vorhersage von Membrantopologie und Signalpeptiden