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Methodenartikel

Bewertung neuroprotektive Wirkung Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extrahieren mit einer vorübergehenden mittlere zerebrale Arterie Okklusion Maus-Modell

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DOI:

10.3791/58454

⸱

9. Dezember 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie modifizieren wir eine vorhandene experimentellen Methode um mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, durch die Schaffung einer mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO) Maus-Modell. Orale Verabreichung von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GR)-Methanol-Extrakt (GRex) nach Schlaganfall Induktion deutlich zurückgegangen insgesamt Infarkt Volumen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe.

Zusammenfassung

Ischämie Reperfusion des zerebralen Blutflusses nach einem Schlaganfall gefolgt führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Die am häufigsten verwendete Tiermodell zur Erforschung von Schlaganfall ist das mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) Modell. Frühere Studien haben verschiedene Infarkt Größen berichtet, auch wenn die gleichen experimentellen Tierarten unter ähnlichen Bedingungen der MCAO verwendet wurde. Daher entwickelten wir eine verbesserte experimentelle Methode um diese Diskrepanz zu beheben. Mäuse wurden MCAO mit einem Filament als Okklusion Material imitieren menschlichen Schlaganfall Bedingungen unterworfen und Filament Dicke wurde optimiert, um mehr reproduzierbare Infarkt Volumen zu schaffen. Mäuse mit einem Methanol behandelten Auszug aus Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex) nach Schlaganfall Induktion zeigte eine deutlich verminderte totale Infarkt Volumen und erhöhte Anzahl der Überlebenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe. Das experimentelles Protokoll erfolgreich geändert und reproduzierbar demonstriert die wohltuende Wirkung von GRex auf ischämischen Schlaganfall.

Einleitung

Schädigung des Gehirns verursacht durch Ischämie und Reperfusion des zerebralen Blutflusses führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Diese Art der Schädigung des Gehirns steigt mit der zunehmenden Verbreitung von zerebrovaskulären Erkrankungen, die durch die Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie Adipositas, Bluthochdruck und Diabetes Mellitus1,2. Die absolute Zahl der älteren Patienten mit Schlaganfall weltweit sprunghaft angestiegen, und die Kosten der medizinischen Versorgung für diese Patienten, die oft mit langfristigen Behinderungen zurückbleiben, ist eine große gesellschaftliche Belastung. Daher sollten sekundäre Behinderungen so weit wie möglich reduzieren die wirtschaftliche Belastung1,2gemildert werden.

Das am häufigsten verwendete Nagetiere Modell der Hirninfarkt ist das mittlere zerebrale Arterie (MCA) Okklusion (MCAO) Modell, in dem die MCA mit einem Silikon-beschichtete chirurgische Box-Filament, Durchblutung, blockieren verschlossen ist verursacht ischämischen Schlaganfall3, 4. mit einem Faden wie Okklusion Material die Kontrolle der Okklusion Zeit und Beständigkeit ermöglicht durch Manipulation der Dauer der Intra-luminalen Filament Einfügung.

Frühere Studien haben gezeigt, dass selbst wenn das gleiche Modell für Nager MCAO benutzt wird, das Gesamtvolumen der Hirninfarkt zwischen Experimente variiert, verursacht geringe Reproduzierbarkeit der Studien. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, haben wir die Dicke der Glühfaden Minze verwendet im Experiment optimiert. Die Ergebnisse einer Vorstudie zerebralen ischämischen und induzierte Infarkt hat gezeigt, dass eine ischämische länger als 60 min die volumetrische Region erlaubt beschädigt Hirngewebe beobachtet und quantifiziert werden.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), auch bekannt als Lakritze, bestehend aus den getrockneten Wurzeln und Wurzelstöcke von Glycyrrhiza Uralensis und G. Glabra. Es wird für verschiedene Zwecke, u.a. als Lebensmittelzusatzstoff und medizinisch5,6,7in der chinesischen und koreanischen traditionellen Medizin eingesetzt.

In einer früheren Studie8, Vorbehandlung mit GR-Methanol-Extrakt (GRex) zeigte eine Anti-apoptotische Wirkung bei MCAO Mäusen einschließlich bedeutende Prävention aus dem Rückgang der Proteinexpression von B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) und Bcl extragroßen (Bcl-xL). Diese Studie wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der herkömmlichen MCAO-Maus-Modell wird gesteigert, Bewertung ihrer Effizienz zu ermitteln, ob Post-Infarkt-Behandlung mit GRex effektiv das Infarkt-Volumen in MCAO-induzierten zerebralen Schäden reduziert.

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Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Pusan National University (Zulassungsnummer, PNU-2016-1087) genehmigt. Eine grafische Übersicht über diese Studie ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Erstellung und Verwaltung von GRex

Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten GR wurde aus einem kommerziellen Pharmaunternehmen gekauft.

  1. 200 g GR in 2.000 mL Methanol und 5 Tage bei Raumtemperatur (25 ° C) inkubieren.
  2. Filtern Sie das Gemisch mit Filterpapier mit 0,26 mm Dicke und 5 µm Porengröße, und entfernen Sie dann den überstand. Der GR-Rückstand 1.000 mL Methanol hinzufügen und erneut filtern.
  3. Kombinieren der zwei Überstände, durch Filterpapier Filtern unter Vakuum zu konzentrieren und dann Installationsprogrammen des Rückstands um GRex zu produzieren.
  4. Lösen Sie der GRex in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), mit physiologischer Kochsalzlösung 0,9 % verdünnen auf und durch einen 0,45 µm-Spritze-Filter filtern. Passen Sie dann die Endkonzentration von DMSO auf < 5 %.
  5. Verwalten Sie GRex (300 mg/kg Körpergewicht) 1 h nach der Reperfusion des MCAO über orale Magensonde. DMSO verdünnt in physiologischer Kochsalzlösung (10 mL/kg Körpergewicht) nur für die normale Gruppe und Kontrollgruppen, bzw. zu verwalten.
    Hinweis: Die Konzentration von GRex verwendet in diesem Experiment wurde entsprechend der Konzentration bestimmt, die durch unsere vorherigen Studie8aktiv war.

(2) Maus-Modell der MCAO

  1. Verwendung männliche C57BL/6 Mäusen im Alter von 6 Wochen und mit einem Gewicht von 22-25 g. alle Tiere mit freiem Zugang zu standard Chow, Wasser und Haus bieten, sie in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur (22 ± 1 ° C) und ein 12 h hell/dunkel-Zyklus.
    1. Teilen Sie die Mäuse in Gruppen von jeweils sechs Mäuse, die Schein-betrieben Normal, Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen bestehen soll.
    2. Operieren Sie MCAO (Modifikation der Methode von Koizumi Et al. 9) über die Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen mit einem Stereo-Mikroskop.
  2. Inhalation Anästhesie in den Mäusen mit 2 % Isofluran 70 % N2O und 30 % O2zu induzieren. Anästhesie ist als ausreichend angesehen, wenn die Maus reagiert nicht auf mechanischen Reiz auf seinen Schweif angewendet wird. Pflegen Sie die Körpertemperatur der Mäuse auf 36,5 ± 0,5 ° C mit einem Körper Temperatur-Holding Decke mit einem Thermometer verbunden.
  3. Entfernen Sie die Haare auf der Brust und Hals der Mäuse durch das Rasieren gefolgt von Verwendung von Haarentfernungs-Creme, desinfizieren der Operationsstelle Haut mit Betadine Scrub abwechselnd mit Alkohol für zwei Mal und dann machen Sie einen Schnitt von ca. 2 cm lang mit chirurgischen Klinge in der Mitte des Halses. Isolieren Sie sorgfältig die linke gemeinsame Halsschlagader (LCCA), äußere Halsschlagader und der Zweig der inneren Halsschlagader aus den umliegenden Bindegewebe.
  4. Verbinden Sie die äußere Halsschlagader und die gemeinsame Halsschlagader mit einer chirurgischen Naht (4: 0 Seide Naht, Hälfte Haken Knoten), um die Durchblutung vorübergehend zu blockieren in der inneren Halsschlagader, während des Betriebs.
  5. Legen Sie eine Silikon beschichteten Nylon-Naht (8: 0 Monofile, 11 mm lang) durch der inneren Halsschlagader auf den Ursprung des linken MCA. Die Zähflüssigkeit des Silikon-beschichteten Teils des Fadens auf einen Bereich von 0,10-0,12 mm.
  6. Messen Sie den Rückgang der relative zerebralen Blutflusses (rCBF) in der MCA mit einem Laser-Doppler-Durchflussmesser. MCAO wird bestätigt, wenn der rCBF auf < 20 % der ruhenden Zustand Werte während des gesamten ischämischen gehalten wird.
  7. Die eingefügte Filament, das Blutgefäß für 2 h zu beheben, während die zerebrale Arterie verschlossen ist, und dann vorsichtig zurückziehen des Fadens um die Durchblutung für 22 h der Reperfusion wiederherzustellen. Naht der Haut durch Nähen an 5 Orten (3: 0 Seide Naht, zwei halbe Anhängevorrichtungen Knoten) und lassen jede Maus aus der Narkose erwachen.
  8. Führen Sie im Bereich "normal" einen Schein-Vorgang nach dem gleichen Verfahren über (bis 2,4), mit folgender Ausnahme. Verbinden Sie die gemeinsame Halsschlagader und Naht die eingeschnittenen Muskel und Haut.

3. Messung des Volumens von beschädigten Hirngewebe

  1. Nach der Euthanasie der Mäuse für Hirnschäden Messung mit CO2 Einatmen Gehirne Verbrauchsteuern die Maus 24 h nach Beginn der MCAO mit Iris chirurgische Schere und abgewinkelte Zange.
    1. Nach dem Entfernen der Kopf mit einer Schere, machen Sie einen Einschnitt in der Mittellinie Haut des Kopfes, über die Haut aus dem Schädel zu kippen.
    2. Brechen Sie das Scheitelbein mit abgewinkelten Pinzette, Dura abziehen egal, zur gleichen Zeit, und dann das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel zu isolieren.
  2. Schnitt die ausgeschnittenen Gewebe in Abschnitte (1 mm dick) mit einer Maus Gehirn Matrix und dann färben die Abschnitten 17 min in einer Lösung von 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid (TTC).
  3. In den Abschnitten 10 % Formalin für mindestens 2 h zu beheben und dann sie mit einer Digitalkamera fotografieren. TTC werden beobachtet, um tragfähige Gewebe rot zu färben, während die nekrotischen Bereiche weiß werden.
  4. Analyse und Quantifizierung der Hirninfarkt Bereich jedes Abschnitts mit ImageJ.

4. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Cresyl violette Färbung der histologischen Abschnitte

  1. Einschläfern Sie die Mäuse für die histologische Untersuchung von CO2 Inhalation und Durchspülen sie Transcardially mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 10 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA). Das Gehirn mit dem gleichen Verfahren wie oben (3.1) zu isolieren und das Gehirn in 10 mL 30 % Saccharose über Nacht Tauchen.
  2. Das Hirngewebe in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten und koronal in 15 µm dicke Abschnitte mit einem Kryostat schneiden. Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern, gefolgt von Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Cresyl violett.
  3. Tauchen Sie den Objektträger in 80 % Ethanol für 1 min, gefolgt von Färbung Hämatoxylin Lösung für 5 min.
    1. Folien in 1 % Säure Alkohol zweimal tauchen, Tauchen in gesättigten Lithiumcarbonat Lösung für 30 s, waschen mit Wasser aus dem Wasserhahn für 30 s, und dann Gegenfärbung in Eosin-Lösung für 30 s.
    2. Die Folien in Leitungswasser abspülen, Einweichen in 95 % und absoluten Ethanol nacheinander.
    3. An der Luft trocknen der Folien, in Xylol mindestens 10 min lang klar und befestigen Sie dann die Eindeckmittel mit Deckgläsern.
  4. Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer für mindestens 1 h, gefolgt von Eintauchen in 50 % igem Ethanol über Nacht mit Chloroform verdünnt.
    1. Färben Sie die Folien mit 0,1 % Cresyl violett für 10 min im Ofen 40 ° C trocken.
    2. Tauchen in 95 % igem Ethanol für 30 min, dann entwässern in absoluten Ethanol für 2 Mal.
    3. Deaktivieren Sie 2 Mal in Xylol für 5 min, dann montieren Sie mit Eindeckmedium nach Lufttrocknung.
  5. Beobachten Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die histologischen Veränderungen, die nach MCAO-induzierten Hirnverletzung.

5. statistische Analyse

  1. Die experimentellen Ergebnisse als Mittel ± Standardabweichung Express und bestimmen die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukey post Hoc Analyse anhand einer Datenanalyse-Software.
  2. Legen Sie die statistische Signifikanz bei einem p-Wert < 0,05.

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Ergebnisse

Im Bereich Schein betrieben "normal" ist kein Hirninfarkt beobachtet, während in der Kontrollgruppe eine relativ breite Palette von Schadstellen beobachtet wird. Bei den Mäusen wird verabreicht 300 mg/kg GRex in der MCAO-Model-Gruppe, eine statistisch signifikante Reduktion im beschädigten Bereich (Abbildung 2) beobachtet.

Die histologischen Veränderungen sind durch ischämische Gehirn Abschnitte mit...

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Diskussion

Mit der zunehmenden Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie chronischem Bluthochdruck, Diabetes und Hyperlipidämie, die wichtigsten Risikofaktoren für einen Schlaganfall sind geworden Schlaganfall-Prävention und Behandlung ein wichtiger Bereich der medizinischen Forschung12, 13. Defizite in Sprache und Bewegung nach einem Schlaganfall sind stark korreliert mit dem Grad der Beschädigung des Gehirns Gewebe14 und führen zu einer schlecht...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Nicht anwendbar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., KoreaGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitatives FilterpapierAdvantecFilterpapier Nr. 2Qualitatives Filterpapier
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD8418-250MLDimethylsulfoxid (DMSO)
Spritzenvorsatzfilter (0,45 &Mikro; m)SigmaCLS431220Spritzenvorsatzfilter (0,45 &Mikro; m)
StereomikroskopLeicaM50Stereomikroskop
Stereomikroskop NikonSMZ745Stereomikroskop
Laser DopplerMoor InstrumentmoorVMS-LDFLaser Doppler
Anästhesie Tischhalterung mit N2O& O2 Durchflussmesser-SystemHarvard Appratus34-1352Anästhesie-Tischhalterung mit N2O& O2 Flowmeter System
Homöothermisches ÜberwachungssystemHarvard Appratus55-7020Homöothermisches Überwachungssystem
Digitalkamera CanonEos-M2Digitalkamera
KryostatLeicaCM3050SKryostat
MikroskopCarl ZeissZeiss AxioMikroskop
DatenanalyseSystat Software Inc.SigmaPlot Version 12Datenanalyse
DatenanalyseNIH BildBildJDatenanalyse
MausdiätDoo Yeol BiotechStandard NagetierfutterMausdiät
IsofluranJOONGWAEA02104781Isofluran
IsofluranTROIKAAISOTROIKA 100Isofluran
Seidennaht (4-0 Schwarze Seide) AILEESK47510Seidennaht (4-0 Schwarze Seide) 
Seidennaht (3-0 Weiße Seide) Baekjae57Seidennaht (3-0 Weiße Seide) 
Nylon-Naht (8-0 monofil) AILEENB825Nylon Naht (8-0 monofil) 
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)SigmaT8877-25G2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
Formalin (Formaldehydlösung)JUNSEI69360-1263 20KGFormalin (Formaldehydlösung)
Hämatoxylin (Harris Hämatoxylin)YD DiagnostikEasyStainHämatoxylin (Harris Hämatoxylin)
Eosin (1% Eosin Y-Lösung)MUTO PURE CHEMICALS3200-2Eosin (1% Eosin Y-Lösung)
Cresylviolett (Acetat)SigmaC5042-10GCresylviolett (Acetat)
Paraformaldehyd Sigma-AldrichP6148-1KGParaformaldehyd 
SaccharoseJUNSEI31365-0350 1KGSaccharose
Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT)Scigen4583Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT)
Trennmesser Fine Science Tools10055-12Trennmesser
#4 PinzetteFine Science Tools11241-30#4
Pinzette #5 PinzetteFine Science Tools11254-20#5 Pinzette
#6 PinzetteFine Science Tools11260-20#6 Pinzette
#7 Feine PinzetteFine Science Tools11274-20#7 Feine Pinzette
Chirurgische SchereFine Science Tools14001-12Chirurgische Schere
Extra feine Bonn SchereFine Science Tools14084-08Extra feine Bonn Schere
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Referenzen

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