Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur in Vivo Mikrodialyse Aspartat- und Glutamat Freisetzung im ventralen Hippocampus von epileptischen und nicht-epileptischen Ratten, in Kombination mit EEG-Ableitungen zu analysieren. Extrazelluläre Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat können mit den verschiedenen Phasen der Erkrankung korreliert werden.

Zusammenfassung

Mikrodialyse ist eine gut etablierte Neurowissenschaften-Technik, die die Veränderungen der neurologisch Wirkstoffe diffundieren in das Gehirn zwischenräumlichen Raum mit dem Verhalten und/oder mit das konkrete Ergebnis der Pathologie (z. B. Anfälle korreliert für Epilepsie). Bei Epilepsie zu studieren, ist die Mikrodialyse-Technik oft mit kurzfristige oder auch langfristige Video-Elektroenzephalographie (EEG Überwachung zur Beurteilung von spontanen Anfall Frequenz, Schweregrad, Verlauf und clustering) kombiniert. Das kombinierte Mikrodialyse-EEG basiert auf der Verwendung von mehreren Methoden und Instrumenten. Hier führten wir in Vivo Mikrodialyse und kontinuierlichen Video-EEG-Aufzeichnung auf Monitor Glutamat und Aspartat-Abfluss im Laufe der Zeit in verschiedenen Phasen des natürlichen Verlaufs der Epilepsie in einem Rattenmodell. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht es, die Paarung von Änderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung mit bestimmten Phasen der Krankheitsentwicklung und Fortschreiten. Die Aminosäure-Konzentration in das Dialysat wurde durch flüssige Chromatographie bestimmt. Hier beschreiben wir die Methoden und die Gliederung der wichtigsten eins während in Vivo Mikrodialyse Vorsichtsmaßnahmen sollten-EEG, mit besonderem Augenmerk auf der stereotaktischen Operation, basale und hohe Kalium Stimulation während der Mikrodialyse, Tiefe Elektrode EEG-Aufzeichnung und Analyse der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Aspartat-und Glutamat in das Dialysat. Dieser Ansatz kann angepasst werden, eine Vielzahl von Drogen oder Krankheit testen induzierte Veränderungen der physiologischen Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat im Gehirn. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assay kann es weiter verwendet werden, verschiedene lösliche Moleküle zu testen, bei der EEG-Aufzeichnung zur gleichen Zeit beschäftigen.

Einleitung

Um Einblick in die Funktionsbeeinträchtigung der Glutamat-vermittelte exzitatorischen und GABAergen inhibitorischen Neurotransmission spontane Anfälle im Temporallappen-Epilepsie (TLE) wodurch überwacht wir systematisch extrazelluläre Konzentrationen von GABA¹ und später die Ebenen von Glutamat und Aspartat-² durch Mikrodialyse im ventralen Hippocampus von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten der natürlichen Krankheit Kurs, d.h.während der Entstehung und Progression von Epilepsie. Wir nutzten die TLE Pilocarpin Modell bei Ratten, das die Krankheit sehr genau in Bezug auf Verhalten, elektrophysiologische und histo....

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren von der University of Ferrara institutionelle Animal Care and Use Committee und vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden (Autorisierung: d.m. 246/2012-B) im Einklang mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des 24. November 1986 (86/609/EWG). Dieses Protokoll ist speziell für Glutamat und Aspartat-Bestimmung in Ratte Gehirn Dialysates gemäß EEG Kontrolle der Mikrodialyse Sitzungen bei epileptischen und nicht-epileptischen Ratten erhaltenen angepasst. Viele der hier beschriebenen Materialien können leicht mit denen ersetzt werden, die man in seinem Labor für EEG-Ableitungen oder Mikrodialyse verwendet....

Ergebnisse

Sonde Erholung

Die mittlere Erholung (d. h. die mittlere Aminosäuregehalt im Perfusat als Prozentsatz des Inhalts in ein gleiches Volumen der Durchstechflasche Lösung) war 15,49 ± 0,42 % bei einer Durchflussmenge von 2 μl/min und 6,32 ± 0,64 bei 3 μl/min für Glutamat und 14.89 ± 0,36 % bei einer Durchflussmenge von 2 Μl/min und 10,13 ± 0,51 bei 3 μl/min für Aspartate bei Verwendung der Cuprophane-Membran-Sonde. Wenn die P.......

Diskussion

In dieser Arbeit zeigen wir, wie eine kontinuierliche Video-EEG-Aufzeichnung gepaart mit Mikrodialyse in einem experimentellen Modell der TLE durchgeführt werden kann. Video-EEG-Aufzeichnung Techniken werden verwendet, um die verschiedenen Phasen der Fortschreiten der Krankheit bei Tieren korrekt zu diagnostizieren und die Mikrodialyse-Technik wird verwendet, um die Änderungen in Release Glutamat zu beschreiben, die rechtzeitig auftreten (keine Änderungen für wurden gefunden Aspartate in einer zuvor veröffentlichten Stud.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Kanal zweifach gedrehte Elektrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Führungskanüle	Agn Tho's, Lindigö, Schweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italien	KK2	Material
Super Attack Gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italien	2047420_71941	Material
Imalgen-Ketamin	Merial, Toulouse, Frankreich	221300288 (AIC)	Lösung
Xylazin	Sigma, Mailand, Italien	X1251	Material
Isofluran-Vet	Merial, Toulouse, Frankreich	103120022 (AIC)	Lösung
Altadol 50 mg/ ml - Tramadol	Formevet, Mailand, Italien	103703017 (AIC)	Lösung
Gentalyn 0,1% crm - Gentamycin	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
Simplex Rapid Dental	Cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Vereinigtes Königreich	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu	, Kyoto, Japan	PN1167	Material
Sondenklemmenhalter	Agn Tho's, Lindigö, Schweden	p/n 100 5001	Ausrüstung
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - diazepam	Roche, Monza, Italien	019995063 (AIC)	Material
1 mL Spritze mit 25G Nadel	Vetrotecnica, Padova, Italien	11.3500.05	Material
flexible Fütterungsnadel für Ratten 17G	Agn Tho's, Lindigö Schweden	7206	Material
Grass Technology Gerät	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Ausrüstung (AS40 Verstärker, Stoffkasten, Verbindungskabel, Telefaktor-Modell RPSA S40)
modulare Datenerfassung und  Analysesystem MP150	Biopac, Goleta, Kalifornien, USA	MP150WSW	Ausrüstung
digitales Videoüberwachungssystem	AverMedia Technologies, Fremont, Kalifornien, USA	V4.7.0041FD	Ausrüstung
Mikrodialysesonde	Agn Tho's, Lindigö Schweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
Mikrodialysesonde	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
Blockheizung	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Ausrüstung
Rührer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italien	711	Ausrüstung
Infusionspumpe	Univentor, Zejtun, Malta	864	Ausrüstung
Polyethylen-Schlauch mit feiner Bohrung	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blaue Schlauchadapter	Agn Tho's, Lindigö Schweden	1002	Material
rote Schlauchadapter	Agn Tho's, Lindigö Schweden	1003	Material
2,5 mL Spritze mit 22G Nadel	Chemil, Padova, Italien	S02G22	Material
Fläschchenkappe	Cronus, Labicom, Olomouc, Tschechische Republik	VCA-1004TB-100	Material
	Septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL Septum	Material
Glaseinsatz mit unterer Feder	Supelco, Sigma, Milano, Italien	27400-U	Material
Autosampler-Fläschchen	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien	C4013-2	Material
Smartline Manager 5000 Systemsteuerung und Entgasungseinheit	Knauer, Berlin, Deutschland	V7602	Ausrüstung
Smartline 1000 quaternäre Gradientenpumpe	Knauer, Berlin, Deutschland	V7603	Ausrüstung
spektrofluorometrischer Detektor	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Ausrüstung
chromatogrphische Säule	Knauer, Berlin, Deutschland	25EK181EBJ	Material
chromatogrphische Vorsäule	Knauer, Berlin, Deutschland	P5DK181EBJ	Material
mobile Phasenlösung A	0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,0		Lösung
mobile Phasenlösung B	40 % 0,1 M Natriumphosphatpuffer, 30 % Methanol, 30 % Acetonitril, pH 6,5		Zusammensetzung der
Ringer-Lösung	in mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3 % BSA
Zusammensetzung der Ringer-Lösung	in mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3 % BSA		Lösung
Kochsalzlösung	0,9 % NaCl, ph angepasst auf 7,0		Lösung
Saccharoselösung	10 % Saccharose in destilliertem Wasser		Lösung