Summary
हम विधानसभा, संचालन का वर्णन है, और प्रवाह के तहत, जबकि वास्तविक समय में छवि कवक फिल्म गठन के लिए डिजाइन एक तंत्र की सफाई । हम भी प्रदान करते है और मात्रात्मक एल्गोरिदम पर चर्चा का अधिग्रहण छवियों पर इस्तेमाल किया जाएगा ।
Abstract
oropharyngeal कैंडिडिआसिस में, जीनस Candida के सदस्यों और मौखिक श्लैष्मिक सतह पर बढ़ने का पालन करना चाहिए, जबकि लार प्रवाह के प्रभाव के तहत । जबकि प्रवाह के तहत विकास के लिए मॉडल विकसित किया गया है, इन प्रणालियों के कई महंगे हैं, या इमेजिंग की अनुमति नहीं है जबकि कोशिकाओं के प्रवाह के तहत कर रहे हैं । हम एक उपंयास तंत्र है कि हमें छवि के विकास और प्रवाह के तहत Candida albicans कोशिकाओं के विकसित करने के लिए और वास्तविक समय में अनुमति देता है विकास किया है । यहां, हम विधानसभा और इस प्रवाह तंत्र के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल विस्तार, साथ ही साथ डेटा उत्पंन कर रहे है कि ठहराव । हम दरों है कि कोशिकाओं को देते है और स्लाइड से अलग है, साथ ही समय के साथ स्लाइड पर बायोमास का एक उपाय निर्धारित करने में सक्षम हैं । इस प्रणाली दोनों किफायती और बहुमुखी, सस्ती benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के कई प्रकार के साथ काम कर रहा है, और विस्तारित इमेजिंग समय के अंय प्रवाह प्रणालियों की तुलना में सक्षम है । कुल मिलाकर, इस प्रवाह के तहत कवक प्रजातियों के उच्च फिल्म विकास पर अत्यधिक विस्तृत वास्तविक समय की जानकारी प्रदान कर सकते है कि एक कम प्रवाह प्रणाली है ।
Introduction
Candida albicans (सी. albicans) मनुष्यों की एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ है कि मौखिक श्लैष्मिक सतहों सहित कई प्रकार के ऊतकों को संक्रमित कर सकते हैं, oropharyngeal कैंडिडिआसिस के कारण और प्रभावित व्यक्तियों के लिए जीवन की एक कम गुणवत्ता में जिसके परिणामस्वरूप1। फिल्म गठन सी albicansके रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है, और कई अध्ययनों के गठन और c. albicans के समारोह पर किया गया है2,3,4, 5, जिनमें से कई स्थैतिक का उपयोग कर आयोजित किया गया है (कोई प्रवाह) इन विट्रो मॉडल । हालांकि, C. albicans पालन और मौखिक गुहा में लार प्रवाह की उपस्थिति में विकसित करना चाहिए । कई प्रवाह प्रणालियों के लिए लाइव सेल इमेजिंग6,7,8,9,10के लिए अनुमति विकसित किया गया है । इन विभिंन प्रवाह प्रणालियों विभिंन प्रयोजनों के लिए डिजाइन किया गया है, और इसलिए प्रत्येक प्रणाली अलग शक्तियों और कमजोरियों है । हमने पाया है कि albicans के लिए उपयुक्त प्रवाह प्रणालियों के कई महंगे थे, आवश्यक परिसर गढ़े भागों, या प्रवाह के दौरान छवि नहीं किया जा सकता है और इमेजिंग करने से पहले बंद कर दिया था । इसलिए, हम प्रवाह11के अंतर्गत C. albicans फिल्म गठन का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास प्रवाह तंत्र विकसित की है । हमारे प्रवाह तंत्र के डिजाइन के दौरान, हम इन प्रमुख बातों का पालन किया । सबसे पहले, हम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता के बिना (हमें उत्परिवर्ती उपभेदों और unmodified नैदानिक आसानी से अलग से अध्ययन करने की अनुमति) के लिए वास्तविक समय में फिल्म के विकास और विकास के कई पहलुओं को मात्रा में सक्षम होना चाहता था । दूसरा, हम सभी भागों चाहता था कि कोई संशोधनों को थोड़ा के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो (यानी, कोई कस्टम निर्माण), दूसरों को और अधिक आसानी से हमारी प्रणाली विश्राम की अनुमति है, और आसान मरंमत के लिए अनुमति दी । तीसरा, हम भी काफी उच्च प्रवाह दर पर विस्तारित इमेजिंग बार के लिए अनुमति देना चाहता था । अंत में, हम चाहते थे, प्रवाह के तहत सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न कोशिकाओं की अवधि के बाद, नई कोशिकाओं को शुरू करने के बिना एक विस्तारित समय पर फिल्म विकास की निगरानी करने में सक्षम हो.
इन बातों का नेतृत्व हमें दो विकसित करने के लिए-कुप्पी पुनर्संचारी प्रवाह प्रणाली 1 चित्रामें सचित्र । दो कुप्पी हम दो चरणों में प्रयोग विभाजित करने के लिए अनुमति देते हैं, एक लगाव चरण है कि सेल से ड्रॉ-वरीयता प्राप्त लगाव कुप्पी, और एक विकास चरण है कि सेल मुक्त मीडिया का उपयोग करता है के लिए नई कोशिकाओं के अलावा बिना फिल्म विकास जारी है । इस प्रणाली को माइक्रोस्कोप के लिए एक मशीन चैंबर के साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, स्लाइड के साथ और यह पूर्ववर्ती टयूबिंग (2 से 5, चित्रा 1) मशीन के अंदर रखा जा रहा है, और अंय सभी घटकों के बाहर एक बड़े माध्यमिक कंटेनर में रखा माइक्रोस्कोप. इसके अतिरिक्त, एक संलग्न तापमान जांच के साथ एक चूल्हा सरगर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगाव कुप्पी में कवक कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । के रूप में यह पुनर्संचारी है, इस प्रणाली के प्रवाह के दौरान सतत इमेजिंग में सक्षम है (३६ से अधिक हो सकता है एच शर्तों के आधार पर), और सबसे मानक सूक्ष्मदर्शी, ईमानदार या उल्टे benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित पर इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम विधानसभा, संचालन पर चर्चा, और प्रवाह तंत्र की सफाई, साथ ही साथ कुछ बुनियादी ImageJ मात्रात्मक एल्गोरिदम प्रदान करने के लिए एक प्रयोग के बाद वीडियो का विश्लेषण ।
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Protocol
1. प्रवाह तंत्र को इकट्ठा
- configure सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध के अनुसार चित्रा 1 में विचार के साथ नीचे चर्चा के साथ भागों ।
ध्यान दें: सुविधा के लिए, प्रवाह तंत्र दो पक्षों में विभाजित है, हरे रंग की ओर (मीडिया कुप्पी के लिए स्लाइड के सब कुछ ऊपर), और नारंगी पक्ष (स्लाइड के मीडिया कुप्पी के लिए सब कुछ बहाव) ।- सुनिश्चित करें कि प्रवाह तंत्र के सभी हवा तंग करने के लिए लीक को रोकने, मीडिया कुप्पी के एकमात्र अपवाद के साथ है (1 चित्रा, 1) । यह पूरा करने के लिए, किसी भी पुरुष के लिए प्लंबर टेप लागू करने के अलावा स्पंदन (पीडी) और 2 µm फिल्टर बोतल (अमेरिकन प्लान) है, जो प्लंबर टेप के रूप में रबर गैसकेट उंहें वाटरप्रूफ रखने की आवश्यकता नहीं है को छोड़कर कोडांतरण से पहले ।
- हर कंटीले फिटिंग है कि सामांय ऑपरेशन के दौरान सकारात्मक दबाव में है पर कान clamps लागू करें (यानी, पंप के बहाव) ।
- एक एक या जी के साथ वाल्व स्थानों लेबल करने के लिए रंग कोडित लैब टेप का प्रयोग करें (संलग्नक और वृद्धि के लिए क्रमशः), पंप स्थान, स्लाइड कनेक्शन स्थानों, और ०.२ µm फ़िल्टर कनेक्शन.
- ट्यूबिंग की लंबाई निर्धारित प्रवाह प्रणाली और माइक्रोस्कोप के बीच की दूरी के आधार पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए, ध्यान में रखते हुए कि सभी प्रवाह तंत्र बहाव पंप की कुप्पी (नारंगी पक्ष के बहुमत) माध्यमिक रोकथाम में होना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि सभी मीडिया स्लाइड तक पहुंचने सही तापमान पर हो जाएगा के रूप में स्लाइड (और अधिमानतः बुलबुला जाल) के ऊपर अतिरिक्त टयूबिंग के लगभग 1 मीटर जोड़ें, के रूप में ।
- स्लाइड करने के लिए काफी संभव के रूप में बंद के रूप में बुलबुला जाल प्लेस, अधिमानतः एक प्रयोग के दौरान मशीन चैंबर के अंदर (बुलबुले अक्सर टयूबिंग दीवार के साथ फार्म); हालांकि, ध्यान रखें कि यह काम करने के लिए एक शूंय से जुड़ा होना चाहिए ।
- सुनिश्चित करें कि अमेरिकन प्लान और ०.२ µm डिस्पोजेबल फिल्टर के बीच टयूबिंग के बारे में ०.५ मीटर लंबा है ।
- प्रत्येक मीडिया कुप्पी के लिए एक लगभग 2 सेमी चुंबकीय हलचल बार जोड़ें ।
- के रूप में कार्य करने के लिए टयूबिंग clamps के कुछ फार्म प्राप्त बंद वाल्व (hemostats इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
- उपयोग में आसानी के लिए, एक autoclavable टोकरी में प्रवाह तंत्र रखें । यह हरे रंग की ओर और नारंगी पक्ष की आसान जुदाई की अनुमति देने के लिए एक बड़ा एक में एक दूसरे छोटे टोकरी के लिए उपयोगी हो सकता है ।
- अनुलग्नक कुप्पी के लिए, एक 4 मिमी ड्रिल बिट का उपयोग कर, रबर डाट में एक अतिरिक्त छेद ड्रिल थर्मल जांच को समायोजित करने के लिए (एक और छेद के माध्यम से जाने के लिए नहीं ध्यान रखना) । बंदरगाहों के माध्यम से टयूबिंग प्राप्त करने के लिए, चिमटी के माध्यम से टयूबिंग धक्का; एक बार के माध्यम से, यह जगह में पकड़ करने के लिए टयूबिंग दबाना, और फिर चिमटी वापस बाहर खींच ।
नोट: यदि यह रबर डाट करने के लिए अतिरिक्त छेद जोड़ने के लिए संभव नहीं है, एक व्यापक मुंह एक चार बंदरगाह पेंच टोपी के साथ पेंच बोतल कुप्पी और रबर डाट के स्थान पर काम कर सकते हैं ।
- एक बार प्रवाह प्रणाली पूरी तरह से इकट्ठा किया गया है, दोनों हरे और नारंगी पक्ष विकास कुप्पी के वाल्व बंद करो । सिकुड़नेवाला पंप के निर्माता के निर्देश के अनुसार जांच करने के लिए कुर्की कुप्पी टयूबिंग और एक एेसे सिलेंडर के साथ पानी का उपयोग करें ।
2. एक प्रयोग करें
- प्रयोग से पहले दिन, शुरू पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए माइक्रोस्कोप मशीन कक्ष हीटिंग, और एक कवक तनाव की एक रात संस्कृति तैयार (प्रतिदीप्ति की आवश्यकता नहीं है) ।
- एक बाँझ सुरक्षा कैबिनेट में एक का उपयोग घटकों और पंप, और जगह इकट्ठा ।
- बुलबुला जाल और प्रवाह तंत्र से तापमान की जांच निकालें और इन सुरक्षा कैबिनेट में जगह है ।
- सुलझाना और टयूबिंग का आयोजन, यदि आवश्यक हो ।
- आटोक्लेव प्रवाह तंत्र, हलचल सलाखों सहित, 30 मिनट के लिए बाँझ सुनिश्चित करने के लिए; जब समाप्त हो, तो, सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण ।
- बबल ट्रैप, तापमान जांच, और सभी एकल उपयोग घटकों (स्लाइड को छोड़कर) जैसा चित्र 1में दर्शाया गया है अनुलग्न करें ।
- ०.२ µm फ़िल्टर (चित्रा 1, 11) के लिए, एक "अनुकूलक" के रूप में बनाने के लिए 1 मिलीलीटर सिरिंज से गोताख़ोर निकालें. इस अंत में अमेरिकन प्लान से ट्यूबिंग बल, और वृद्धि कुप्पी के लिए अग्रणी टयूबिंग के लिए ०.२ µm फ़िल्टर देते हैं ।
- लागू करें स्लाइड एडाप्टर के कंटिया चारों ओर सिलिकॉन वैक्यूम तेल (ध्यान रखना नहीं अंदर पर किसी भी तेल पाने के लिए) से पहले इसे जोड़ने, के रूप में इस प्रणाली में हवा लीक को रोकने में मदद करता है ।
- 1% (डब्ल्यू/वी) खमीर निकालने, 2% (डब्ल्यू/वी) peptone, और 2% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज (YPD) के १०० मिलीलीटर के साथ लगाव कुप्पी भरें, और YPD के २०० मिलीलीटर के साथ विकास कुप्पी भरें । सुनिश्चित करें कि हरे रंग की ओर टयूबिंग प्रत्येक कुप्पी में मीडिया तक पहुंचता है ।
- सुनिश्चित करें कि सभी वाल्व खुले हैं । एक वैक्यूम करने के लिए बुलबुला जाल देते हैं, और हरी पक्ष बुलबुला जाल के बहाव ट्यूबिंग करने के लिए पंप कनेक्ट ।
- ३.३ मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर द्रव पंप पूरी तरह से हरे रंग की ओर भरने के लिए, तो वितरण और लगभग 1-2 मीडिया के मिलीलीटर-क्योंकि मिलीलीटर की पहली जोड़ी अक्सर मृत कोशिकाओं या यादृच्छिक मलबे होते है त्यागें । सुनिश्चित करें कि टयूबिंग के हरे रंग की ओर मीडिया से भर जाता है, और आगे बढ़ने से पहले कोई बुलबुले बुलबुला जाल के बहाव है ।
- चैनल स्लाइड और YPD के साथ जलाशय भरें, ध्यान नहीं बुलबुले परिचय लेने ।
- प्रवाह तंत्र के लिए स्लाइड कनेक्ट, और नारंगी पक्ष के बारे में ०.५ मीटर की एक बफर बनाने के लिए और अधिक तरल पदार्थ पंप । इस backflow की स्थिति में स्लाइड में भूलवश फँसाने वाली हवा को रोकने के लिए है.
- माइक्रोस्कोप के लिए परिवहन के लिए प्रवाह उपकरण तैयार करें: क्लैंप प्रवेश और बुलबुला जाल के आउटलेट बंद कर दिया, और हरे और नारंगी पक्ष लगाव कुप्पी वाल्व बंद दबाना । सुनिश्चित करें कि पीडी और अमेरिकन प्लान के लिए पेंच टोपियां तंग कर रहे है के रूप में वे autoclaving के दौरान ढीला कर सकते हैं ।
- परिवहन आसान बनाने के लिए टयूबिंग से पंप डिस्कनेक्ट । फिर चूल्हा सरगर्मी सहित सभी घटकों, माइक्रोस्कोप के पास एक द्वितीयक कंटेनर में ले जाएँ ।
- इमेजिंग के लिए प्रवाह उपकरण तैयार करें ।
- चूल्हा सरगर्मी करने के लिए तापमान जांच संलग्न और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए लगाव कुप्पी हीटिंग शुरू करते हैं । ३०० rpm पर मीडिया हिलाओ और पूरे प्रयोग के लिए इस बनाए रखने के ।
- माइक्रोस्कोप पर स्लाइड माउंट, और यदि आवश्यक कसकर इसे सुरक्षित टेप का उपयोग करें ।
- एक निर्वात को बुलबुला जाल देते हैं (अभी तक दबाना पूर्ववत नहीं).
- चित्र 1पर इंगित स्थान पर प्रवाह उपकरण के लिए पंप कनेक्ट करें ।
- ३.३ मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर पंप शुरू, यह लगभग 5-10 एस के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर बुलबुला जाल प्रवेश हटाने/
- अनुमति पंप चल जारी रखने के लिए, जबकि लगाव कुप्पी ऊपर तपता है । एक बार मीडिया प्रवाह प्रणाली भर में परिचालित है, सामांय ऑपरेशन के लिए जांच करें ।
- पंप के ऊपर में हवा टपक के लिए फिटिंग की जाँच करें (कुछ बुलबुला गठन सामान्य है), या द्रव बहाव बाहर रिसाव कर.
- जांच करें कि विकास मीडिया कुप्पी, पीडी, और अमेरिकन प्लान सभी प्रवेश ट्यूब से टपकाव का मीडिया रहे है (यदि नहीं, यह एक भरा फिल्टर, या एक मजबूत कान दबाना संकेत सकता है) ।
- माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, चैनल स्लाइड पर संलग्न या रोलिंग कोशिकाओं के लिए जाँच करें. कोशिकाओं की एक अत्यधिक संख्या में सेट अप के दौरान संक्रमण का संकेत हो सकता है, या कि polytetrafluoroethylene (PTFE) बुलबुला जाल की झिल्ली की जगह की जरूरत है ।
- एक बार जब लगाव कुप्पी और मशीन कक्ष दोनों ३७ ° c में हैं, कवक कोशिकाओं के काफी रातोंरात संस्कृति लगाव कुप्पी करने के लिए जोड़ने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं/
नोट: µ l में जोड़ने के लिए वॉल्यूम इस सूत्र का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता:
- acclimate करने के लिए कक्षों की अनुमति दें करने के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें ।
- दोनों हरी और नारंगी पक्ष लगाव कुप्पी वाल्व खोलने जबकि दोनों विकास कुप्पी वाल्व को बंद करने के लिए कोशिकाओं के प्रवाह शुरू करते हैं ।
- लगभग 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए कोशिकाओं स्लाइड तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं, और प्रारंभिक माइक्रोस्कोप के ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुमति (इस समय की आवश्यकता हो सकती है हरी पक्ष टयूबिंग की लंबाई के आधार पर समायोजित किया जा सकता है) । इस समय के दौरान, एक ही इमेजिंग पिछले प्रयोगों में इस्तेमाल किया मापदंडों को माइक्रोस्कोप समायोजित करें । यदि यह पहला भाग है, तो निंन चरणों का पालन करें:
- एक कम आवर्धन हवा उद्देश्य के लिए स्विच ।
- किसी अनुलग्न कक्ष या छोटे नवोदित कक्ष पर ढूँढें और फ़ोकस करें.
- Köhler रोशनी के लिए संघनित्र कॉंफ़िगर करें, तो darkfield के लिए स्विच ।
- ३०० ms के लिए एक्सपोज़र समय निर्धारित करें ।
- एक छोटे से सेल मंद अभी तक स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि के खिलाफ दिखाई (एक नवोदित बेटी सेल के लिए लगभग 7-8 की पृष्ठभूमि अनुपात के लिए एक संकेत एक उचित मूल्य है) जब तक रोशन तीव्रता समायोजित करें । नोट/भविष्य के प्रयोगों के लिए रोशन तीव्रता को चिह्नित करें ।
- configure सॉफ्टवेयर एक छवि प्राप्त करने के लिए 2 घंटे से अधिक हर 2 मिनट
- अनुलग्नक चरण के लिए छवि प्राप्ति प्रारंभ करें । लगभग 5 और 10 मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि ध्यान बनाए रखा गया है के बाद वापस जांच करें । यदि नहीं, तो अगली छवि प्राप्त करने के तुरंत बाद फ़ोकस समायोजित करने का प्रयास करें ।
- अनुलग्नक चरण समाप्त होने के तुरंत बाद, फ़ाइल सहेजें, और फिर दोनों अनुलग्नक कुप्पी वाल्व बंद करते समय हरी और नारंगी पक्ष वृद्धि कुप्पी वाल्व खोलें । किसी भी वाल्व मशीन चैंबर के अंदर हैं, तो मंच टक्कर नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
- चूल्हा सरगर्मी से थर्मामीटर जांच हाल चलाना ।
- चूल्हा सरगर्मी से लगाव कुप्पी निकालें और अपनी जगह पर वृद्धि कुप्पी के स्थान पर रखें ।
- configure सॉफ्टवेयर एक छवि प्राप्त करने के लिए हर 15 मिनट पर 22 ज और विकास चरण के लिए छवि अधिग्रहण शुरू करते हैं । फिर से ध्यान केंद्रित आवश्यक नहीं होना चाहिए, लेकिन यह अत्यधिक के लिए कुछ ही घंटों के बाद प्रवाह उपकरण की जांच की सिफारिश की है ।
- पंप के ऊपर में हवा टपक के लिए फिटिंग की जाँच करें (फिर से कुछ बुलबुला गठन सामान्य है), या द्रव बहाव से बाहर टपक
- जांच करें कि विकास मीडिया कुप्पी, पीडी, और अमेरिकन प्लान सभी मीडिया टपकाव का है (यदि नहीं, यह एक भरा फिल्टर, एक सख्त कान दबाना, या एक कंटीले फिटिंग पर एक रोकना संकेत सकता है अगर कोशिकाओं flocculate इस्तेमाल किया जा रहा है) ।
- अमेरिकन प्लान में द्रव स्तर की जांच करें । यदि मीडिया की बोतल के ऊपर आ रहा है (फ़िल्टर के ऊपर से ऊपर १.५ सेमी), दोनों screwcaps कस (उंहें ढीला नहीं है, के रूप में इस कुप्पी दबाव में है) । यदि वे आगे नहीं कस जाएगा, प्रयोग जारी (हालांकि यह एक रिसाव में परिणाम हो सकता है), और अगले सफाई के बाद पीडी और अमेरिकन प्लान पर रबर गैसकेट की जगह ।
- जब विकास चरण अधिग्रहण समाप्त हो गया है, फ़ाइल को बचाने, और फिर हरी और नारंगी पक्ष लगाव कुप्पी वाल्व जो नारंगी पक्ष पर दबाव विज्ञप्ति के रूप में एक शोर कर सकते है खोलो । हरे रंग की ओर दोनों मीडिया कुप्पी से आ ट्यूबिंग पर खींचो जब तक वे मीडिया के ऊपर कम से अधिक कई सेंटीमीटर हैं । एक उच्च गति पर पंप भागो (लगभग १०० मिलीलीटर/या पंप पर तेजी से आगे बटन पकड़) टयूबिंग, जो बहुत आसान सफाई करता है से सभी मीडिया को दूर करने के लिए । जब खाली, पंप से प्रवाह उपकरण डिस्कनेक्ट, और यह माइक्रोस्कोप से हटा दें ।
3. साफ प्रवाह उपकरण
- सभी गैर-autoclavable घटकों (एकल उपयोग घटकों, बबल ट्रैप, और तापमान जांच) को निकालें, और 30 मिनट के लिए प्रवाह तंत्र को आटोक्लेव करें । उपयोग किए गए एकल उपयोग घटकों, ७०% इथेनॉल के साथ साफ जांच, और सेट अलग बुलबुला जाल छोड़ें ।
- बाद autoclaving समाप्त हो गया है, मीडिया को त्यागें, और कुल्ला और अलग मीडिया कुप्पी सेट । फिर बुलबुला जाल से कनेक्ट, सफाई (पुन: प्रयोज्य) के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ibidi चैनल स्लाइड से कनेक्ट, और चित्रा 1में दिखाया स्थान पर पंप करने के लिए प्रवाह प्रणाली से कनेक्ट.
- क्लैंप ऑरेंज साइड विकास कुप्पी वाल्व बंद कर दिया ।
- एक चोंच में पतला ब्लीच के लगभग २०० मिलीलीटर रखें । ब्लीच में रबर डाट प्लेस, और फिर एक उच्च गति से पंप शुरू करने के लिए प्रवाह तंत्र भर में ब्लीच प्रसारित (सभी फिल्टर को छोड़कर) । एक बार ब्लीच से भरा है, क्योंकि एक उच्च गति पर पंप छोड़ने और टयूबिंग तोड़ सकते है पंप बंद करो ।
- 15 मिनट के लिए ब्लीचिंग के बाद, रबड़ डाट को चोंच के ऊपर पकड़ें और पम्प को फिर से प्रवाह तंत्र से ब्लीच को निकालने के लिए शुरू करें ।
- दोहराएं चरण ३.४ और ३.५ दो बार अतिरिक्त पानी के बजाय ब्लीच के प्रवाह प्रणाली कुल्ला करने के लिए । इस समय के दौरान, केवल पानी के साथ फिल्टर साफ है क्योंकि अंय सफाई एजेंटों जीर्णशीर्ण या फिल्टर रोकना होगा ।
- टयूबिंग है कि आम तौर पर ०.२ µm मीडिया फ़िल्टर से कनेक्ट होगा प्लेस (2 µm अमेरिकन प्लान से आ रहा है) के लिए ३.६ कदम से रबर डाट के साथ चोंच पानी में ।
- 20 µm इनलाइन फिल्टर है, जो आम तौर पर कान दबाना के बावजूद आसानी से अलग खींचा जा सकता है के प्रवेश से जुड़ी ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट ।
- एक वैक्यूम फिल्टर कुप्पी और एक स्पेयर 3-होल डाट के माध्यम से टयूबिंग की एक लंबी धारा का उपयोग करने के लिए एक वैक्यूम प्रणाली है कि प्रवाह तंत्र से कनेक्ट कर सकते हैं बनाने के लिए ।
- 20 µm फिल्टर प्रवेश के प्रवेश के लिए इस वैक्यूम प्रणाली कनेक्ट, और निर्वात शुरू; यह रिवर्स दिशा में फिल्टर के माध्यम से पानी खींच, मृत कोशिकाओं को हटा देगा ।
- फिल्टर के माध्यम से पानी की कम से २०० मिलीलीटर खींचो, तो पानी की फिल्टर लाइनों को खाली करने के लिए पानी से टयूबिंग हटा दें ।
- 20 µm फिल्टर से वैक्यूम प्रणाली डिस्कनेक्ट, और अपने सामान्य टयूबिंग के लिए फिल्टर जोड़ने.
4. वीडियो को बढ़ाता है
नोट: सभी फ़ाइलें कार्य करने के लिए टैग छवि फ़ाइल (TIF) स्वरूप में कनवर्ट करने की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, प्रयोगों के बीच तुलना करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सभी छवियों को एक ही माइक्रोस्कोप और इमेजिंग मापदंडों के साथ लिया जाता है, के रूप में ऊपर चर्चा की ।
- डाउनलोड और स्थापित ImageJ अगर पहले से ही स्थापित नहीं है ।
- पूरक मैक्रो फ़ाइल डाउनलोड करें, और इसे ImageJ\macros फ़ोल्डर में रखें ।
- प्रदान किए गए मैक्रो को समायोजित करें:
- ImageJ में पिछले प्रयोग से एक छवि स्टैक खोलें, और वर्तमान कक्षों के साथ एक समय बिंदु का चयन करें ।
- छवि के माध्यम से मेनू का चयन करें । प्रकार | 8-bit "।
- छवि के माध्यम से मेनू का चयन करें । समायोजित करें । थ्रेशोल्ड "। "डार्क बैकग्राउंड" बॉक्स को चेक करें. लाल करने के लिए दाईं ओर ड्रॉपडाउन मेनू सेट करें ।
- कम मूल्य समायोजित करें जब तक सभी कोशिकाओं को ंयूनतम अतिरिक्त शोर के साथ लाल रंग में शामिल कर रहे है (कुछ गैर सेल speckling ठीक है और स्थूल द्वारा संसाधित किया जाएगा) । इस निचले मान का नोट बनाएं ।
- थ्रेशोल्ड विंडो और खुली छवि दोनों को बंद करें ।
- "Plugins के माध्यम से मेनू से चुनें । मैक्रोज़ । संपादित करें "। जब किसी फ़ाइल को खोलने के लिए कहा जाए: "एक फ़ोल्डर स्तर ऊपर ले जाएं", और फिर मैक्रोज़ फ़ोल्डर का चयन करें और प्रवाह फिल्म ठहराव मैक्रो फ़ाइल खोलें ।
- 15 मान "setThreshold (15, २५५);" के सभी इंस्टेंसेस में परिवर्तित करें चरण 4.3.4 में निर्धारित मान के लिए । फ़ाइल सहेजें और इस विंडो को बंद करें ।
- "Plugins के माध्यम से मेनू से चुनें । मैक्रोज़ । स्थापित करें "और फ्लो फिल्म ठहराव फ़ाइल का चयन करें ।
- अब, Plugins के तहत । मैक्रोज़ " मेनू, विभिन्न वीडियो quantifications के लिए छह नए विकल्प दिखाई देते हैं. पूर्ण विश्लेषण चलाएँ और अनुलग्नक और वृद्धि वीडियो फ़ाइलों का चयन करें जब प्राप्त किए गए डेटा पर सभी उपलब्ध विश्लेषण करने के लिए संकेत दिया और स्वचालित रूप से आउटपुट फ़ाइलें उत्पन्न.
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Representative Results
एक सामांय रात भर समय चूक प्रयोग के प्रतिनिधि छवियां ३७ डिग्री सेल्सियस पर वंय-प्रकार C. albicans कोशिकाओं का उपयोग चित्रा 2एक और पूरक वीडियो 1में देखा जा सकता है । छवियों को दृश्यता में सुधार करने के विपरीत बढ़ाया गया है । मूल डेटा का ठहराव किया गया था, और प्रतिनिधि रेखांकन चित्रा 2बीमें देखा जा सकता है । इन रेखांकन उत्पंन करने के लिए, डेटा पहले इमेजिंग क्षेत्र को सामान्यीकृत किया गया (यानी, कुल इमेजिंग क्षेत्र से विभाजित), और टुकड़ी आगे बायोमास के लिए सामान्यीकृत था, जैसा कि ऊपर वर्णित है । इसके अतिरिक्त, अनुलग्नक और टुकड़ी समय के साथ संचई मान दिखाते हैं, बजाय प्रवाह फिल्म ठहराव मैक्रो द्वारा उत्पंन व्यक्तिगत फ़्रेम मानों से । एक बार रेखांकन इस स्तर तक पहुंच चुके हैं, सांख्यिकीय तुलना प्रतिगमन विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है ।
चित्रा 1 : दो चरण परिसंचारी प्रवाह तंत्र की योजनाबद्ध । काली रेखाओं को कनेक्ट करना टयूबिंग इंगित करता है, और ऐरोहेड सामांय ऑपरेशन के दौरान प्रवाह की दिशा इंगित करता है । (क) प्रवाह प्रणाली का एक सामान्य योजनाबद्ध अवलोकन सचित्र है. सुविधा के लिए, प्रवाह प्रणाली एक हरे रंग की ओर (स्लाइड के ऊपर) और एक नारंगी पक्ष (स्लाइड के बहाव) में विभाजित है । बोल्ड संख्या सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध भागों के अनुरूप हैं । लेबल वाल्व के लिए बस टयूबिंग clamps या hemostats के लिए स्थान चिह्नित करने के लिए प्रयोगों के दौरान रखा जाएगा । फ़िल्टर आदेश निम्नानुसार है: 8 – 20 µm इनलाइन फ़िल्टर, 9 – 10 µm इनलाइन फ़िल्टर, 10 – 2 µm फ़िल्टर बोतल (FB), और 11 – 0.22 µm एकल उपयोग डिस्पोजेबल फिल्टर. योजनाबद्ध पैमाने पर नहीं है । (ख) संलग्नक कुप्पी के लिए रबड़ डाट के एक क्लोज़ अप दृश्य, चार घटकों कि बंदरगाहों के माध्यम से पारित: मीडिया आउटलेट, ०.२ µm एयर फिल्टर है कि गैस विनिमय की अनुमति देता है, तापमान की जांच (एक अतिरिक्त छेद ड्रिलिंग की आवश्यकता है), और मीडिया वापसी । (ग) धड़कता भीगा (पीडी) और अमेरिकन प्लान का एक क्लोज़-अप दृश्य, साथ ही प्रत्येक बंदरगाह के लिए इस्तेमाल किया पेंच टोपी विधानसभा. इन बोतलों को हवा तंग समारोह की जरूरत है । पीडी के लिए आउटलेट ट्यूबिंग उचित कार्य के लिए प्रवेश टयूबिंग की तुलना में बोतल में गहराई तक पहुंच जाना चाहिए । FB में ग्रे आयत स्टील फिल्टर का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: Candida albicans वंय प्रकार कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह के तहत हो । (क) microcolonies के प्रतिनिधि darkfield माइक्रोस्कोपी छवियों कि संकेत दिया समय बिंदुओं पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह के तहत फार्म । स्केल बार = १०० µm. (B) प्रतिनिधि छवि ठहराव डेटा । इमेजिंग क्षेत्र के भीतर कुल बायोमास (densitometry विश्लेषण द्वारा निर्धारित), सेल लगाव की संचई दर, और प्रतिशत बायोमास टुकड़ी (टुकड़ी बायोमास को सामान्यीकृत दर) समय पर प्रत्येक तनाव के लिए दिखाए जाते हैं । डेटा n ≥ 3 प्रयोगों के साधन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक वीडियो 1. Candida albicans जंगली प्रकार की कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह के तहत हो । इस समय चूक darkfield माइक्रोस्कोपी वीडियो अनुलग्नक चरण (ऊपरी बाएँ हाथ के कोने में संकेत समय के दौरान सब्सट्रेट करने के लिए WT कोशिकाओं के लगाव से पता चलता है, छवियों हर 2 मिनट का अधिग्रहण), बाद में वृद्धि और विकास के दौरान के बाद विकास चरण (2 ज पर शुरू होता है, छवियों हर 15 मिनट का अधिग्रहण किया) । सेल-सीड मीडिया (1 x 106) का उपयोग अटैचमेंट चरण के दौरान किया गया, जबकि सेल-फ्री मीडिया का विकास चरण के दौरान किया गया । प्रवाह दाएं से बाएं है । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर के रूप में ऊपर उल्लिखित मात्रात्मक समय कवक के फिल्म विकास और विकास के चूक वीडियो की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । प्रयोगों के बीच तुलना के लिए अनुमति देने के लिए यह महत्वपूर्ण महत्व का है सुनिश्चित करें कि इमेजिंग मापदंडों एक ही रखा जाता है । यह सुनिश्चित करना भी शामिल है कि माइक्रोस्कोप Köhler रोशनी के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए स्थापित है (कई गाइड इस प्रक्रिया के लिए ऑनलाइन उपलब्ध हैं) । इमेजिंग मापदंडों के अलावा, प्रवाह तंत्र के साथ काम करते समय ध्यान में रखने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बुलबुला जाल तरल पदार्थ के प्रवाह के दौरान निर्वात के तहत बनाए रखा है महत्वपूर्ण है, ऐसा करने की विफलता के रूप में हवा के लिए नेतृत्व में बुलबुला जाल के माध्यम से निकाला जा रहा होगा । इसी तरह, जब बुलबुला जाल निर्वात के तहत नहीं है (यानी, जब प्रवाह तंत्र परिवहन) दोनों प्रवेश और आउटलेट बंद clamped रहना चाहिए; वरना हवा PTFE झिल्ली के माध्यम से में रिसाव होगा । इस क्लैंप बुलबुला जाल एक बार फिर वैक्यूम के तहत रखा गया है जब तक हटाया जा करने की जरूरत नहीं है । अंत में, यह बहुत संभावित रोकना या लीक के लिए अपने प्रवाह तंत्र की निगरानी महत्वपूर्ण है । सबसे कारगर तरीका है अपने सिस्टम में रोकना के लिए जांच करने के लिए जांच है कि वहां के लगाव या विकास कुप्पी, पीडी, और अमेरिकन प्लान की सुविधा से टपकता मीडिया है । इन से मीडिया अपेक्षाकृत इसी तरह की दरों पर टपकाव का होना चाहिए अगर सब कुछ सुचारू रूप से काम कर रहा है । यदि एक रोकना मौजूद है, तो आप आम तौर पर ट्यूबिंग बस रोकना अधिक कठोर हो जाएगा के ऊपर टयूबिंग के रूप में स्थान निर्धारित कर सकते हैं ।
एक बार डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, हम वीडियो को quantitate करने के लिए अनेक ImageJ मैक्रोज़ प्रदान करते हैं. ये मैक्रोज़ बायोमास का एक माप, और कोशिकाओं को सतह या फिल्म से अलग करने के लिए और संलग्न की दर है, जिसमें शामिल है, फिल्म विकास और विकास के कई मापदंडों का निर्धारण । प्रदान किए गए मैक्रोज़ के विवरण नीचे दिए गए हैं ।
पूर्ण विश्लेषण नीचे सूचीबद्ध सभी विश्लेषण करता है, और स्वचालित रूप से डेटा outputs । यह मैक्रो एक खुली छवि फ़ाइल के बिना निष्पादित किया जा सकता है, जबकि अंय सभी एक खुला वीडियो की आवश्यकता है । जब निष्पादित, यह उपयोगकर्ता एक अनुलग्नक स्टैक फ़ाइल, फिर एक वृद्धि स्टैक फ़ाइल खोलने के लिए संकेत देगा । इसके बाद, यह स्वचालित रूप से छवियों का विश्लेषण करेगा और आउटपुट डेटा फ़ोल्डर जिसमें सभी डेटा तालिकाओं को शामिल किया गया है, जैसा कि नीचे वर्णित है, अनुलग्नक छवि फ़ाइल के रूप में उसी फ़ोल्डर में है । अनुलग्नक काउंटर मैक्रो केवल अनुलग्नक फ़ाइल पर किया जाता है; अन्य सभी विश्लेषण अनुलग्नक और वृद्धि फ़ाइलों का एक श्रेणीबद्ध स्टैक पर किया जाता है । उत्पन्न आउटपुट डेटा फ़ाइलें पाठ फ़ाइलें हैं, लेकिन उपयोग में आसानी के लिए excel में आयात किया जाना चाहिए ।
योग तीव्रता विश्लेषण सक्रिय विंडो के प्रत्येक फ़्रेम का विश्लेषण करेगा । यह चरण 4.3.7 में निर्दिष्ट निचली सीमा के ऊपर है जो प्रत्येक पिक्सेल के लिए सभी धूसर मान जोड़ता है, और प्रति फ़्रेम एक संचई मान outputs । उत्पंन मूल्यों को फ्रेम के भीतर बायोमास वर्तमान के लिए आनुपातिक हैं, ऊपर किसी भी कैमरा संतृप्ति कि तब तक होता है । डेटा तो इमेजिंग क्षेत्र के क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए; यह मैक्रो द्वारा नहीं किया जाता है ।
कवरेज क्षेत्र विश्लेषण उस फ़्रेम के क्षेत्र के लिए सक्रिय विंडो के प्रत्येक फ़्रेम का विश्लेषण करेगा जो कक्षों द्वारा (निचली थ्रेशोल्ड मान के ऊपर) प्रतिशत के रूप में शामिल है.
अनुलग्नक काउंटर प्रत्येक फ़्रेम के बीच अनुलग्न करने वाले सभी कक्षों का योग तीव्रता निर्धारित करने के लिए फ़्रेम घटाव का उपयोग करेगा । इस प्रकार, पहला डेटा पॉइंट उन कक्षों का बायोमास है जो फ़्रेम 1 और 2 के बीच देते हैं; दूसरा डेटा बिंदु फ्रेम 2 और 3, आदि के बीच संलग्न कोशिकाओं के बायोमास है ये डेटा इमेजिंग क्षेत्र के क्षेत्र में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए । आसान पठनीयता के लिए, यह भी रेखांकन से पहले इस मूल्य को एकीकृत करने के लिए उपयोगी है ।
टुकड़ी काउंटर अनुलग्नक काउंटरके रूप में ही काम करता है, लेकिन फ्रेम घटाव रिवर्स, ऐसी है कि यह कोशिकाओं है कि प्रत्येक फ्रेम के बीच अलग की राशि तीव्रता निर्धारित करती है । इन आंकड़ों को भी इमेजिंग क्षेत्र के क्षेत्र में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए, और रेखांकन से पहले एकीकृत । एकीकरण से पहले, इन डेटा आगे योग तीव्रता विश्लेषण में परिकलित पूर्ववर्ती फ़्रेम की कुल योग तीव्रता को सामान्यीकृत किया जा सकता है । इस नए मूल्य कोशिकाओं के अनुपात है कि उस समय बिंदु पर, जो अक्सर अधिक मूल्यवान डेटा है, अलग कोशिकाओं के बायोमास के बाद से बढ़ रही है के साथ बढ़ती हुई फिल्म बायोमास का प्रतिनिधित्व करता है ।
जबकि प्रवाह प्रणाली यहां प्रस्तुत की और निर्माण और अंय प्रवाह प्रणालियों से काम जटिल है, यह कई लाभ प्रदान करता है । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चैनल स्लाइड के हमारे उपयोग से इन फायदों के कई परिणाम हैं । इन स्लाइड के लिए उपलब्ध ऊतक संस्कृति उपचार Candida कोशिकाओं की सतह का पालन करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है । इसके अतिरिक्त, इस चैनल स्लाइड की प्रोफाइल एक पारंपरिक स्लाइड के समान होने के नाते यह आसानी से कम आवर्धन पर संचारित प्रकाश का उपयोग कर ईमानदार सूक्ष्मदर्शी सहित माइक्रोस्कोप प्रणालियों की एक विस्तृत विविधता पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है । माइक्रोस्कोप के इस प्रकार का उपयोग कर हमें darkfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की अनुमति दी, जो बहुत आसान डेटा के ठहराव बनाया, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी की तुलना में (के रूप में वहाँ कोई photobleaching और कम phototoxicity था). पारंपरिक माइक्रोस्कोपी (ऑप्टिकल अनुभाग के बिना), शक्ति रूढ़िवादी है, ध्यान केंद्रित कोशिकाओं से बाहर अर्थ समान आकार12की फोकस कोशिकाओं के रूप में एक छवि के लिए फोटॉनों के समान संख्या में योगदान । इसका मतलब यह है कि, इमेजिंग के हमारे एक विमान के बावजूद, पूर्ण 3 डी बढ़ती फिल्म अभी भी प्रयोग भर में quantified जा रहा है, भले ही उच्च क्षेत्रों ध्यान से बाहर हैं । इस एकल विमान इमेजिंग नाटकीय रूप से कोशिकाओं को phototoxicity क्षति को कम करने का लाभ है, लेकिन इस फिल्म के 3 डी वास्तुकला पर कोई जानकारी प्रदान नहीं करता है । हालांकि, इस प्रवाह प्रणाली भी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए13।
हमारे प्रवाह तंत्र के अद्वितीय दो कुप्पी परिसंचारी सेटअप भी कई फायदे हैं । पहले, कई प्रवाह प्रणालियों की आवश्यकता होती है कि स्लाइड्स कक्षों के साथ पूर्व-वरीयता प्राप्त हों, लेकिन हमारे द्वारा पृथक कक्ष-वरीयता वाले अनुलग्नक कुप्पी के उपयोग से हमें उन कक्षों की छवि और मात्रा को बढ़ाता है, जब वे प्रवाह के अंतर्गत स्लाइड का पालन करते हैं, और हमें लगता है कि यह और क्या होता है < c0 > vivo में। इसके अतिरिक्त, हम पहले के रूप में वे वास्तविक समय में हुई उच्च गति इमेजिंग और छवि आसंजन की घटनाओं के लिए हमारे माइक्रोस्कोप को समायोजित करने में सक्षम है, के रूप में उन्हें तथ्य11के बाद मात्रात्मक करने का विरोध किया. दूसरा, एक सेल मुक्त विकास कुप्पी कि पुनर्वितरित और एक विस्तारित अवधि से अधिक सेल मुक्त बनाए रखा जा सकता है हमें समझने के लिए कैसे अधिक से अधिक 24 ज, एक अवधि है कि आम तौर पर गैर के साथ पूरा नहीं किया जा सकता है के लिए प्रवाह के तहत बढ़ने की अनुमति दी पुनर्संचारण प्रणालियों . हम अभी तक की ऊपरी समय सीमा निर्धारित नहीं किया है क्या हमारे प्रवाह प्रणाली के साथ प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन हम सफलतापूर्वक ३६ ज प्रयोग पूरा कर लिया है; हालांकि, अब प्रयोग, एक रिसाव या भरा फिल्टर का मौका अधिक से अधिक । कई कारकों एक प्रयोग की संभावित अवधि को प्रभावित कर सकते हैं, कोशिकाओं की वृद्धि दर सहित, कैसे चिपकने वाला है, और hyphae गठन की डिग्री, यह मुश्किल एक प्रयोग की अवधि पर एक ऊपरी सीमा को परिभाषित करने के लिए बना रही है । हालांकि, अगर बहुत लंबी अवधि के रूप में प्रस्तुत प्रवाह तंत्र के साथ प्राप्त किया जा सकता से वांछित हैं, फिल्टर एक में लाइन पराबैंगनी (यूवी) नसबंदी बॉक्स के रूप में पहले8वर्णित किया गया है के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । इस नसबंदी बॉक्स भी छवि बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इस प्रवाह तंत्र की अनुमति हो सकती है; हमारी छवि बैक्टीरियल उपभेदों के लिए पिछले प्रयास ०.२ µm फिल्टर के तेजी से कॉलेस्ट्रॉल के परिणामस्वरूप । अंततः, हम यूवी नसबंदी को अपनाने के लिए नहीं चुना है, के रूप में बॉक्स कस्टम गढ़े है, और यह मृत कोशिकाओं recirculat में परिणाम होगा ।
इस प्रवाह प्रणाली का एक और लाभ यह है कि यह काफी सस्ती वाणिज्यिक प्रणालियों के सापेक्ष है, खासकर यदि आप इसके साथ एक खुर्दबीन खरीद की जरूरत है । हमारी प्रयोगशाला में, हम एक बुनियादी संचारित प्रकाश benchtop माइक्रोस्कोप खरीद और एक बड़े मानक संवहन मशीन के अंदर पूरे माइक्रोस्कोप जगह कर रहे थे । केवल प्रमुख आवश्यकता है कि माइक्रोस्कोप एक शटर समारोह होना चाहिए (या तो यांत्रिक या विद्युत) क्रम में समय-चूक माइक्रोस्कोपी करने के लिए.
हालांकि इस प्रणाली बहुमुखी है और कई फायदे प्रदान करता है, यह एक कम प्रवाह विधि है । हमारे प्रवाह तंत्र के समानांतर में कई उपभेदों विकसित करने में असमर्थ है, अंय उपलब्ध प्रवाह प्रणालियों के विपरीत । व्यापक तैयारी और समय की सफाई के कारण, हम केवल दो प्रयोगों एक सप्ताह के प्रदर्शन करने में सक्षम हैं । हालांकि, कई अंय प्रवाह प्रणालियों बल्कि महंगा है, और रोकना हो सकता है जब Candida कोशिकाओं hyphae बनाने की स्थिति के तहत हो रहे हैं ।
इसके अतिरिक्त, इस प्रवाह प्रणाली काफी दूसरों की तुलना में जटिल है, और आपरेशन में रखने के लिए मुश्किल हो सकता है । कई प्रयोगों के बाद, फिल्टर को रोकना शुरू, टयूबिंग पतली पहनना शुरू होता है, और भागों के लिए जंग या ढीला हो शुरू; इस प्रकार इन घटकों को प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है । फिल्टर का उपयोग इस प्रणाली कुछ कवक उपभेदों की वृद्धि की स्थिति के साथ असंगत बनाता है; विशेष रूप से, कुछ भी है कि flocculation लाती तेजी से 20 µm में लाइन फिल्टर रोकना होगा । हालांकि, प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर पर्याप्त अनुभव के साथ, इससे पहले कि वे एक असफल प्रयोग में परिणाम संभावित मुद्दों का पता लगाने के लिए आसान हो जाता है । एक बात है कि प्रवाह तंत्र के हर रोज आपरेशन एक छोटे से सरल बनाने के लिए किया जा सकता है एक मशीनी है एक autoclavable सामग्री (जैसे एल्यूमीनियम या स्टेनलेस स्टील के रूप में) से बाहर बुलबुला जाल आवास की एक प्रतिकृति बनाने के लिए, आप बुलबुला आटोक्लेव करने की अनुमति प्रवाह तंत्र के बाकी के साथ जाल, PTFE झिल्ली और बुलबुला जाल के एडेप्टर घटकों के रूप में autoclavable हैं ।
अंत में, दो चरण परिसंचारी प्रवाह तंत्र यहां प्रस्तुत की छवि के लिए एक अनूठा मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है और इन विट्रो प्रवाह के तहत कवक के फिल्म निर्माण और वास्तविक समय में । जबकि प्रणाली अपनी सीमाएं हैं, यह अत्यधिक अनुकूलनीय है और सबसे सूक्ष्मदर्शी के साथ अच्छी तरह से काम करता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों के प्रवाह तंत्र के डिजाइन में मूल्यवान इनपुट प्रदान करने के लिए डॉ वेड Sigurdson स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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