Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Verhältnis zu den Fragen der Ziel-Effekte und die Schwierigkeit des Einsetzens einer langen DNA-Fragment in der Anwendung von Designer Nukleasen für Genom Bearbeitung, embryonale Stammzellen (ES) Zell-basierte gen-targeting Technologie verfügt nicht über diese Mängel und ist weithin verwendet, um Tier/Maus Genom von großen Deletionen/Insertionen bis hin zu Einzel-Nukleotid-Substitutionen ändern. Vor allem gewünscht Identifizierung von relativ wenigen homologe Rekombination (HR) Veranstaltungen notwendig ES-Klone ist ein wichtiger Schritt, der genaue und zuverlässige Methoden verlangt. Südliche beflecken und/oder konventionellen PCR werden häufig für diesen Zweck genutzt. Hier beschreiben wir die Modalitäten der Verwendung dieser beiden Verfahren HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen aufgetreten in denen endogene Myh9 gen gestört und durch cDNAs Codierung andere Nonmuscle Myosin schwere Kette IIs (NMHC IIs) ersetzt werden soll. Das gesamte Verfahren der Southern blotting umfasst den Bau von Vector(s), Elektroporation, Droge-Auswahl, Ausbau und Lagerung von ES-Zellen/Klone, die Vorbereitung, Verdauung-targeting und Beflecken der genomic DNA (gDNA), die Hybridisierung und Waschen der Wortanzahl und letzten Schritt der Autoradiographie auf die x-ray-Filme. PCR kann direkt mit vorbereitet und verdünnte gDNA durchgeführt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Sonden und Restriktionsenzym (Re-) schneiden Websites für das südliche beflecken und die Primer für PCR sorgfältig geplant werden. Obwohl die Ausführung von Southern blotting ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und PCR-Ergebnisse sind Fehlalarme, die korrekte Identifizierung von Southern blotting und die schnelle Screening mittels PCR erlauben die alleinige oder kombinierte Anwendung dieser Methoden beschrieben in diesem Papier auf allgemein verwendet und Anhörung durch die meisten Labore bei der Identifizierung von Genotypen von ES-Zellen und genetisch veränderter Tiere.
Einleitung
Die Technologie der Gene targeting-HR in murinen embryonaler Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool für sezieren die zellulären Folgen von bestimmten Genmutationen1,2. Die Bedeutung und die Bedeutung dieser Technologie spiegeln sich in der Anerkennung von 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin3,4; Unterdessen stellt es das Aufkommen der modernen Ära von gen-engineering-5. Gene targeting durch HR kann genutzt werden, um praktisch jede Änderung von Punktmutationen bis hin zu großen chromosomale Rearrangements im Genom....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Aufbau des Zielens Construct(s), Sonden für südlicher Fleck und Primer für PCR
- Wählen Sie das erste kodierende Exon (Exon 2) des Gens Myh9 für Störungen oder Einfügung in der Anwendung von Ko/Knock-in hier berichtet.
- Rufen Sie die 5-kb vor- und 5 kb nachgeschaltete DNA-Sequenzen rund um das Myh9 Exon 2 von der genome.ucsc.edu -Website ab.
- Analysieren Sie Einschränkung Verdauung Muster von Enzymen (REs) mit 1 – 2 Schnitten in dieser 10-kb-Region mithilfe von pDRAW Software geeignet RE(s) genomischen DNA für das südliche beflecken zu verdauen zu bestimmen.
Hinweis: Dra ich erfüllt diese Anforderung und ist für den Zwe....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
In diesem Papier wird ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR beschrieben, die genutzt wird, HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen für die Erzeugung von NM II genetischen Austausch Mausmodelle, verwenden ES Zellen-basierten HR-vermittelten targeting-Technologie aufgetreten. Obwohl Southern blotting PCR, sowie traditionelle Gene-targeting-Technologie seit mehreren Jahrzehnten verbreitet haben, muss die erfolgreiche Anwendung von ihnen sorgfältig geplant werden.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Derzeit können Designer Nukleasen für Genom-Bearbeitung noch nicht ES zellbasierte Gene-targeting Technologie aufgrund ihrer Probleme von Ziel-Effekten und Schwierigkeiten beim Einfügen einer langen DNA-Fragment30,31ersetzen. Dieser Bericht enthält als die goldenen Methoden zur Identifizierung von HR Ereignisse in Maus-ES-Zellen, ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR für das Feld. Wir validiert die Zuverlässigkeit dieser Methoden durch die Ana.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit erhielt Unterstützung durch das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (Grants Nr. 31571432), die menschlichen Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) und der Forschung Grundlage der Bildung Bureau Hunan Provinz, China (Grant Nr. 15 K 054).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel-Extraktionskit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA-Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy Vektor | Promega | A1360 | |
| Nuklei-Lyselösung | Promega | A7941 | |
| Proteinfällungslösung | Promega | A7951 | |
| DNA-Denaturierungslösung | VWR | 351-013-131 | |
| DNA-Neutralisationslösung | VWR | 351-014-131 | |
| Fertige DNA-Markierungskügelchen (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Lachs Sperma DNA Lösung | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfersystem, große | Kits Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α 32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Mikrosäulen | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridisierungslösung | Millipore | S4040 | |
| Kodak Röntgenfilm | Z& Z Medizin | 844 5702 |
Referenzen
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
