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Methodenartikel

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

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DOI:

10.3791/58467

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20. November 2018

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1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Zusammenfassung

Im Verhältnis zu den Fragen der Ziel-Effekte und die Schwierigkeit des Einsetzens einer langen DNA-Fragment in der Anwendung von Designer Nukleasen für Genom Bearbeitung, embryonale Stammzellen (ES) Zell-basierte gen-targeting Technologie verfügt nicht über diese Mängel und ist weithin verwendet, um Tier/Maus Genom von großen Deletionen/Insertionen bis hin zu Einzel-Nukleotid-Substitutionen ändern. Vor allem gewünscht Identifizierung von relativ wenigen homologe Rekombination (HR) Veranstaltungen notwendig ES-Klone ist ein wichtiger Schritt, der genaue und zuverlässige Methoden verlangt. Südliche beflecken und/oder konventionellen PCR werden häufig für diesen Zweck genutzt. Hier beschreiben wir die Modalitäten der Verwendung dieser beiden Verfahren HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen aufgetreten in denen endogene Myh9 gen gestört und durch cDNAs Codierung andere Nonmuscle Myosin schwere Kette IIs (NMHC IIs) ersetzt werden soll. Das gesamte Verfahren der Southern blotting umfasst den Bau von Vector(s), Elektroporation, Droge-Auswahl, Ausbau und Lagerung von ES-Zellen/Klone, die Vorbereitung, Verdauung-targeting und Beflecken der genomic DNA (gDNA), die Hybridisierung und Waschen der Wortanzahl und letzten Schritt der Autoradiographie auf die x-ray-Filme. PCR kann direkt mit vorbereitet und verdünnte gDNA durchgeführt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Sonden und Restriktionsenzym (Re-) schneiden Websites für das südliche beflecken und die Primer für PCR sorgfältig geplant werden. Obwohl die Ausführung von Southern blotting ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und PCR-Ergebnisse sind Fehlalarme, die korrekte Identifizierung von Southern blotting und die schnelle Screening mittels PCR erlauben die alleinige oder kombinierte Anwendung dieser Methoden beschrieben in diesem Papier auf allgemein verwendet und Anhörung durch die meisten Labore bei der Identifizierung von Genotypen von ES-Zellen und genetisch veränderter Tiere.

Einleitung

Die Technologie der Gene targeting-HR in murinen embryonaler Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool für sezieren die zellulären Folgen von bestimmten Genmutationen1,2. Die Bedeutung und die Bedeutung dieser Technologie spiegeln sich in der Anerkennung von 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin3,4; Unterdessen stellt es das Aufkommen der modernen Ära von gen-engineering-5. Gene targeting durch HR kann genutzt werden, um praktisch jede Änderung von Punktmutationen bis hin zu großen chromosomale Rearrangements im Genom der Maus ES Zellen6,7-Ingenieur. Es ist bekannt, dass vor der Entstehung der sogenannten Genome editing-Tools, die Generation von einer gen-Knockout-Maus die Anwendung der Gene-targeting Technologie ES Zellen8,9,10erforderlich. In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden mehr als 5.000 gen gezielt Mäuse durch diesen Ansatz für die Modellierung menschlicher Erkrankungen oder studieren gen Funktionen11produziert. Eine genomweite Ko Anstrengung hat sich etabliert für die Verteilung von gen-targeting Vektoren, gezielte ES Zellklonen und live Mäuse an die wissenschaftliche Gemeinschaft2,12,13,14 , 15. zweifellos, ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting-Technologie hat stark erweiterte unser Verständnis der Funktionen von Genen in physiologische oder pathologische Kontext gespielt.

Weil HR ist eine relativ seltene Ereignis in Säugetier-Zellen16,17, die wichtig und nächster Schritt nach soll gen gezielt in murinen Embryonische Stammzellen zahlreiche ES Kolonien zur Identifizierung von ein paar Klone mit Mutationen aus analysieren Mit dem targeting Vektor-18Std. Die gold Methoden zur Identifizierung von HR-Veranstaltungen gehören südliche beflecken und PCR19,20. Die Vorteile der Ansätze beinhalten, dass Southern blotting richtig gezielte ES-Klone zu identifizieren und erlaubt es den Forschern, die Struktur der gen ausgerichtete Veranstaltung, wie eine Überprüfung der eine einzelne Kopie Einfügung des Konstrukts, analysieren während einer PCR-basierte Strategie ermöglicht eine schnellere Screening für HR Veranstaltungen21,22. Obwohl diese Methoden Nachteile, wie z. B. haben, dass sie sind zeitaufwendig und können Fehlalarme, die kombinatorische Nutzung von ihnen ist weithin akzeptiert und angewendet, indem die meisten Labore bei der Identifizierung von HR-Veranstaltungen, insbesondere in ES-Zellen für Erzeugung genetisch geändert Tiere.

Drei Isoformen von Nonmuscle Myosin II (NM II) bei Säugetieren, jeweils bestehend aus zwei identischen NMHC IIs die durch drei verschiedene Gene (benannte Myh9, Myh10 und Myh14) und zwei Paare von Lichterketten, kodiert sind gekennzeichnet als NM II A, II B und II-C23. Frühere Studien haben gezeigt, dass mindestens der Isoformen von NM II A und II B sind wesentlich für Maus Entwicklung, da die in Vivo -Ablation von diese Isoformen embryonalen Tödlichkeit24,25,26führt. Um dieses Problem zu umgehen und erhalten neue Einblicke in die Isoform-spezifischen Funktionen der NM II A und II B in den späteren Stadien der Maus Entwicklung, ein genetischer Austausch war ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting Technologie, Strategie erzeugen Sie eine Reihe von Maus Modelle27. Im Zuge der Ermittlung der gewünschten ES-Klone, Southern blotting und PCR-Methoden wurden eingesetzt, und diese erwies sich als effiziente und zuverlässige27,28.

Dieses Papier soll eine detaillierte Beschreibung der südlichen Beflecken und PCR, einschließlich der Gestaltung von targeting, Vector(s), Wortanzahl, und Primer und die Durchführung von Experimenten sowie die Analyse der Ergebnisse durch die Identifizierung von HR-Ereignis veranschaulicht Vorkommen in ES-Zellen für die Erstellung von genetischen Austausch NM II Maus Modelle und repräsentative Daten. Die Protokolle der beiden hier vorgestellten Methoden können auch für die Ermittlung der Genotypen von genetisch veränderten Zellen oder Tieren angenommen werden.

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Protokoll

1. Aufbau des Zielens Construct(s), Sonden für südlicher Fleck und Primer für PCR

  1. Wählen Sie das erste kodierende Exon (Exon 2) des Gens Myh9 für Störungen oder Einfügung in der Anwendung von Ko/Knock-in hier berichtet.
  2. Rufen Sie die 5-kb vor- und 5 kb nachgeschaltete DNA-Sequenzen rund um das Myh9 Exon 2 von der genome.ucsc.edu -Website ab.
  3. Analysieren Sie Einschränkung Verdauung Muster von Enzymen (REs) mit 1 – 2 Schnitten in dieser 10-kb-Region mithilfe von pDRAW Software geeignet RE(s) genomischen DNA für das südliche beflecken zu verdauen zu bestimmen.
    Hinweis: Dra ich erfüllt diese Anforderung und ist für den Zweck ausgewählt.
  4. Wählen Sie ein 4 kb-Fragment unmittelbar oberhalb des Myh9-Exon 2 als linken Homologie Arm (LHA) und eine 1,7 kb Fragment unmittelbar nachgeschalteten Sequenz als richtige Homologie Arm (RHA); Wählen Sie eine 1 kb-Fragment 5' stromaufwärts von der LHA als die linke Sonde (LP) für Southern blotting und ein 1,2 kb-Fragment 3' stromabwärts von der RHA als die richtige Sonde (RP), anhand der obigen Analyse.
  5. Verwenden Sie ein primer3 Programm, um die vorwärts und rückwärts Primer für die vier DNA-Fragmente mittels PCR Verstärkung zu entwerfen. Entwerfen Sie ein paar Zündkapseln mit der forward Primer wohnte in der Nähe von Terminal 3' eine Auswahl Neomyocin Widerstand Markergens (P1) und die rückwärts-Primer befindet sich etwas außerhalb der RHA (P2).
    Hinweis: Diese Primerpaar wird verwendet zur Identifizierung von gezielten ES-Klone durch PCR-29.
  6. Einen 129Sv-BAC-Klon für Maus Myh9 gen-Locus durch den Besuch der Website bacpac.chori.org zu finden (Anmerkung: isogenen DNA wird bevorzugt). BAC-DNA mit einem Kit geeignet zur Reinigung von großer Stücken von DNA nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren.
    Hinweis: Gereinigtes BAC-DNA wird als Vorlage für PCR Verstärkung verwendet werden.
  7. Zeichnen Sie eine schematische Darstellung der Ausrichtung Konstrukte, Sonden und Grundierungen, diese Informationen zusammenzufassen.

2. Generation des Zielens, Construct(s) und Sonden für südlicher Fleck und die Vorbereitung der Zündkapseln für PCR

  1. Bestellen Sie die oben beschriebenen PCR-Primer und lösen sie in einer Konzentration von 20 µM.
  2. Die Homologie Arme und Sonden durch PCR in eine Reaktionslösung einschließlich 1 µL vorwärts- und 1 µL reverse Primer, 1 µL BAC DNA zu verstärken (50 ng) als die Vorlage, 5 µL Puffer für Pfu und 1 µL der Pfu Ultra als die DNA-Polymerase , und H2O bis 50 µL. die PCR in einer PCR-Maschine unter folgenden Bedingungen durchzuführen: 95 ° C für 3 min; 95 ° C für 30 s; 60 ° C für 30 s; 72 ° C und 1 kb/min; 30 Zyklen; zu guter Letzt 72 ° C für 10 Minuten.
  3. PCR-Produkte mit einem PCR-Bereinigung-Kit nach dem Protokoll des Herstellers zu reinigen und die DNA-Fragmente mit 40 µL H2O. Digest die gereinigten PCR-Produkte mit vordefinierten REs in eine Reaktionslösung mit 5 µL 10 X Puffer für REs eluieren , 2,5 µL RE1 und 2,5 µL RE2 und der eluierten DNA, bei 37 ° C für 2 h laufen eine 1 % DNA-Gel zum Ziel DNA-Bänder zu trennen, das Gel mit dem Ziel DNA unter UV-Licht, Verbrauchsteuern zu reinigen die Ziel-DNA-Fragmente aus dem Gel verwenden, eine DNA-Gel Extraction Kit nach zum Protokoll des Herstellers und eluieren die DNA-Fragmente mit 40 µL H2O.
  4. Klonen der Homologie Arme und Ersatz Ausdruck Kassette(n) in den MpNTKV-LoxP-Vektor nach der Reihenfolge der die verstärkte und gereinigten RHA, LHA und Ersatz Ausdruck Kassette(n) befreit andere Vektoren, die endgültige Ausrichtung zu erhalten Construct(s). Klonen Sie DNA-Fragmente der verstärkten und gereinigten Sonden in den T-easy-Vektor.
  5. Bestätigen Sie die Nukleotidsequenzen der geklonte DNA-Fragmente durch Sequenzierung27,28.

3. Vorbereitung des Zielens, Construct(s), die Elektroporation von ES-Zellen und die Verstärkung der ES-Klone

  1. Bereiten Sie jedes targeting Konstrukt mit einem Plasmid Maxiprep Kit nach dem Protokoll des Herstellers. Linearisieren jedes Konstrukt Plasmid von mit ich nicht in einer 400 µL Reaktion einschließlich 40 µL 10-fach Puffer für nicht ich, nicht ich 10 µL, 100 µg DNA, zu verdauen und H2O bis 400 µL bei 37 ° C über Nacht.
  2. Reinigen Sie die linearisierte targeting Construct(s).
    1. Extrahieren die verdauten Reaktionslösung 1 X mit ein gleiches Volumen von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) und Zentrifuge bei einer Kraft von 2.000 X g für 10 Minuten.
    2. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5-mL-Tube, überstürzen Sie sich die DNA mit 2,5 x Ethanol und 0,1 x 3M Natriumacetat (pH 5,2) (Volumen-Verhältnis) und bei einer Kraft von 2.000 X g für 10 min zentrifugieren.
    3. Entfernen Sie das überstand, waschen die DNA pellet-1 X mit 1 mL 75 % Ethanol, und bei einer Kraft von 2.000 X g für 5 min zentrifugieren.
    4. Den Überstand zu entfernen und das DNA-Pellet für 5 min an der Luft trocknen.
    5. Lösen Sie die linearisierte DNA-Pellet in sterilen Tris-EDTA (TE)-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 µg/µL.
  3. Mix 50 µg jedes linearisierten targeting Konstrukt mit 0,5 x 107 ES-Zellen. Führen Sie die Elektroporation bei 320 V und 250 µF.-Platte die elektroporiert ES-Zellen auf Gerichte mit Neo-resistente MEF-Feeder.
  4. Nach 24 h wechseln Sie zu ES Zelle Medium mit 400 µg/mL G418 und 200 µM Ganciclovir und Kultur für 4 – 5 Tage mit einer täglichen mittleren Änderung weiter. Medikamenten-resistenten ES-Klone in 48-Well Platten abholen.
    Hinweis: Normalerweise werden vier 48-Well-Platten pro Konstrukt verwendet.
  5. Duplizieren Sie die 48-Well-Platten.
    Hinweis: Ein Satz der Platten ist konserviert, und der andere Satz dient zur genomischen DNA-Vorbereitung.

4. Vorbereitung der genomischen DNA und die Verdauung mit Restriction Enzyme(s)

  1. Bereiten Sie gDNAs von ES-Zellen mithilfe eines kommerziellen Kits (genomische DNA-Reinigung-Kit) mit geringfügigen Änderungen vor.
    1. Medien aus der Zellkultur ES entfernen und Hinzufügen von 500 µL Kerne Lyse-Lösung, einschließlich RNaseA, direkt in die Vertiefungen zu die Zellen zu lösen.
      Hinweis: Die Zelle lysate kann bei-80 ° C gelagert oder sofort behandelt werden.
    2. Pipettieren nach oben und unten mehrmals, um die Zellen vollständig lysiert und übertragen Sie sie auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
    3. Fügen Sie ein Drittel des Volumens der Proteinlösung Niederschlag, der 1,5 mL Tube, kräftig vortexen 20 s, kühlen die Proben für 5 min auf Eis, und dann, bei einer Kraft von 2.000 X g für 5 min. Transfer der Überstand in ein anderes sauber 1,5 mL Tube Apart Zentrifugieren Ning ein gleiches Volumen von Isopropanol; Mischen Sie vorsichtig die Lösung. (Beachten Sie, dass weiße fadenförmige Stränge in diesem Moment gesehen werden können.) Bei einer Kraft von 2.000 X g für 1 min Zentrifugieren; verwerfen Sie den überstand.
    4. Waschen der gDNA Pellet mit 1 mL 70 % igem Ethanol bei Raumtemperatur, Zentrifuge bei einer Kraft von 2.000 X g für 1 min, Aspirieren des Überstands vorsichtig und dann an der Luft trocknen gDNA Pellet für 3 min.
    5. GDNAs mit 100 µL DNA Rehydratationslösung auflösen und dann brüten bei 65 ° C für 1 h oder bei 4 ° C über Nacht.
    6. Speichern der gDNAs bei 2 – 8 ° C.
  2. Digest gDNAs mit RE Dra I. eingestellt bis eine 30 µL Verdauung Reaktion predesigned, durch das Mischen von 3 µL 10-fach Puffer für Dra I, 3 µL Dra I, 10 µg gDNAs/Probe und H2O bis zu 30 µL, und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  3. Überprüfen Sie die Vollständigkeit der Verdauung durch DNA-Gel, 5 µL der verdauten Reaktion, zu analysieren und fügen Sie dann die 3 µL 10 x DNA Loading Puffer für den nachfolgenden Schritt.

(5) Southern Blotting und PCR-Identifikation

  1. Southern Blot screening
    1. Die verdaute gDNAs durch Elektrophorese und Übertragung auf eine Membrane zu trennen.
      1. Bereiten Sie eine 1 % Agarose-Gelelektrophorese-Gel mit Interkalation Bromid (EB), laden Sie die Proben aus Schritt 4.3 und eine 1 kb-Leiter und laufen Sie das Gel über Nacht mit einer niedrigen Spannung (30 – 40 V).
      2. Nehmen Sie das Gel und machen Sie ein Foto mit einem DNA-Gel-Imaging-System nach der Elektrophorese. Überprüfen Sie, ob verdaut und getrennten gDNAs ein Abstrich-wie Bild anzeigen.
      3. Einweichen Sie das Gel in ein Tablett mit 0,2 N HCl-Lösung und schütteln Sie sie vorsichtig für 20 min bei Raumtemperatur.
      4. Übertragen Sie das Gel auf DNA Denaturierung Lösung und schütteln Sie sie vorsichtig für 20 min bei Raumtemperatur.
      5. Wechseln Sie das Gel in DNA-neutralisierende Lösung und schütteln Sie sie vorsichtig für 20 min bei Raumtemperatur.
        Hinweis: Das Gel ist anfällig für Brüche nach diesem Schritt, so dass es vorsichtig umgegangen werden muss.
      6. Verwenden Sie der schnellen abwärts Transfersystem, um die DNA aus dem Gel auf die Membran übertragen. Montieren der TurboBlotter und befleckende Stack entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
        Hinweis: 10 X oder 20 X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) Lösung dient als Puffer übertragen. 3 h Übertragung reicht in der Regel 95 % der gDNAs von Gel auf Membran übertragen; eine längere Zeit der Übertragung ist jedoch harmlos.
      7. Die Membran herausnehmen und waschen Sie es mit 2 X SSC für 1 min, absorbieren die Flüssigkeit mit Gewebe, und dann die DNA mit der Membran mit einer UV-Vernetzer zu vernetzen.
        Hinweis: Die Membran kann bei 4 ° C eine Woche aufbewahrt werden.
    2. Beschriften Sie die DNA-Sonden mit Radioaktivität.
      1. Reinigen Sie die Sonde Plasmide mit einem Miniprep Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
      2. Freigabe der DNA Fragmente der Sonden aus dem Plasmid-Vektor von EcoR Verdauung in eine Reaktionslösung einschließlich 5 µL Puffer für EcoR I, 2 µL EcoR ich Enzym, 20 µg Plasmid DNA und H2O bis 50 µL , 2 h.
      3. Führen Sie eine 1 % DNA-gel für die Trennung von der Sonde DNA-Fragmente aus dem Vektor und reinigen Sie die DNA-Fragmente der Sonden mit den DNA-Gel Extraction Kit nach dem Protokoll des Herstellers zu.
      4. Messen Sie mit 1 µL DNA-Lösung, DNA-Konzentration der Probe DNA-Fragmente mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 260/280 nm.
      5. 40-ng der Sonde DNAs in der 1,5 mL Tube mit 45 µL TE-Puffer vorbereiten, Kochen für 3 min, kurz drehen und legen Sie dann die Tube(n) für 2 min auf Eis.
      6. Die Röhrchen mit Ready-to-Go DNA Kennzeichnung Perlen der Hitze denaturiert Sonde DNAs hinzufügen (-dCTP), Pipettieren rauf und runter zu mischen, 5 µL [α32P] dCTP hinzufügen und dann bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
      7. Reinigen Sie die beschrifteten Prüfspitzen mit G50 Microcolumns gemäß den Anweisungen des Herstellers zu, und dann messen Sie die Radioaktivität von einem Szintillationszähler (optional).
    3. Hybridisieren Sie die Membrane(s) mit den markierten Sonden.
      1. Prehybridize der Membran.
        1. Prewarm die Hybridisierung Lösung bei 42 ° C für 30 min. Mix 20 mL vorgewärmte Hybridisierung Lösung mit 200 µg von gekochtem Lachs Samenzellen DNA in ein 50-mL-Tube.
        2. Legen Sie die Membran in der Hybridisierung-Röhre. Die Hybridisierung Röhre die gemischte prehybridization Lösung hinzufügen. Legen Sie sie in den Ofen Hybridisierung (Satz Rollen und die Temperatur bei 42 ° C) und lassen Sie die Prehybridization für 30 min gehen.
      2. Hybridisieren Sie die Membran mit den beschrifteten Wortanzahl.
        1. Nehmen Sie die Hybridisierung Röhre und gießen Sie die prehybridization Lösung in ein 50 mL-Tube; Hinzu kommen die denaturierten Sonde (beheizt bei 100 ° C für 3 min) ab Schritt 5.1.2.7 Rohr und Mischung sanft.
          Hinweis: Reduzieren Sie induzierenden Bläschen.
        2. Die gemischte Lösung zur Hybridisierung Röhre zurück und führen Sie die Hybridisierung bei 42 ° C über Nacht.
    4. Waschen Sie die Membrane(s) um nonhybridized Sonden zu entfernen.
      1. Legen Sie die Membrane(s) in ein Fach mit 1 x SSC + 0,1 % SDS und sanft bei 55-60 ° C für 10 Minuten schütteln.
      2. Übertragen Sie der Membrane(s) auf ein Tablett mit 0,5 x SSC + 0,1 % SDS und sanft bei 55-60 ° C für 10 Minuten schütteln.
      3. Überprüfen Sie die Radioaktivität auf die Membrane(s) mit ein tragbarer Geigerzähler um zu entscheiden, ob eine dritte Reinigung erforderlich ist.
    5. Setzen Sie die Radioaktivität auf der Membran zu Röntgenfilme.
      1. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der gewaschenen Membrane(s).
      2. Entfalten die Membrane(s) mit Plastikfolie und fix It/Sie in der Exposition-Kassette.
      3. Setzen Sie die Membran, zwei Blätter von Röntgenfilm in einem dunklen Raum.
      4. Legen Sie die Belichtung Kassette bei-80 ° C, Nacht oder länger.
    6. Entwickeln Sie die Filme um die Ergebnisse zu visualisieren. Prüfen Sie, ob ein entsprechende ES Klon der gewünschten mit der gezielten Rekombination oder nicht, nach den Größen der DNA-Bands durch die Sonden erkannt ist.
    7. Rehybridize die gleichen Membran von einer anderen Sonde nach Abstreifen der verwendeten Sonde nach folgendem Verfahren: die verwendeten Membran herausnehmen, waschen Sie es 1 X mit sauber H2O und inkubieren Sie es dann in Ringel-Lösung (55 % Formamid, 2 % SSPE, 1 % SDS, H 2 (O) bei 65 ° C mit sanft schütteln für 1 – 2 h.
  2. PCR-Identifikation
    1. Durchführen Sie PCR-Kennung des gewünschten ES-Klone in einer 50-µL-Reaktion-Lösung einschließlich 5 µL 10 X PCR Puffer, 2 µL 50 mM MgSO4, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL vorwärts Grundierung 20 µM, 20 µM-rückwärts-Primer 1 µL , 1 µL der High-Fidelity-Platin Taq, gDNAs (~ 100 ng), und H2O bis 50 µL.
    2. Verwenden Sie die folgenden Reaktionsbedingungen PCR: eine erste Denaturierung bei 94° C für 3 min 30 Zyklen der Denaturierung bei 94° C für 30 s, Glühen bei 60° C für 30 s und eine Erweiterung bei 68° C 132 s und einer dritten Stufe 68° c für 10 min.
    3. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Elektrophorese in 1,0 % Agarose.
    4. Klonen der PCR-Fragmente mit ihrer erwarteten Größe in den T-easy Vektor und Sequenz, die das Vorhandensein einer Teilsequenz des Vektors Ziel zu bestätigen.

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Ergebnisse

In diesem Papier wird ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR beschrieben, die genutzt wird, HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen für die Erzeugung von NM II genetischen Austausch Mausmodelle, verwenden ES Zellen-basierten HR-vermittelten targeting-Technologie aufgetreten. Obwohl Southern blotting PCR, sowie traditionelle Gene-targeting-Technologie seit mehreren Jahrzehnten verbreitet haben, muss die erfolgreiche Anwendung von ihnen sorgfältig geplant werden...

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Diskussion

Derzeit können Designer Nukleasen für Genom-Bearbeitung noch nicht ES zellbasierte Gene-targeting Technologie aufgrund ihrer Probleme von Ziel-Effekten und Schwierigkeiten beim Einfügen einer langen DNA-Fragment30,31ersetzen. Dieser Bericht enthält als die goldenen Methoden zur Identifizierung von HR Ereignisse in Maus-ES-Zellen, ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR für das Feld. Wir validiert die Zuverlässigkeit dieser Methoden durch die Ana...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit erhielt Unterstützung durch das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (Grants Nr. 31571432), die menschlichen Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) und der Forschung Grundlage der Bildung Bureau Hunan Provinz, China (Grant Nr. 15 K 054).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BAC CLONEBACPAC Resources Center (BPRC)bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct KitQIAGEN12462
QIAquick Gel-ExtraktionskitQIAGEN28704
QIAquick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi KitQIAGEN12963
PfuUltra High-Fidelity DNA-PolymeraseAgilent600382
T-easy VektorPromegaA1360
Nuklei-LyselösungPromegaA7941
ProteinfällungslösungPromegaA7951
DNA-DenaturierungslösungVWR351-013-131
DNA-NeutralisationslösungVWR351-014-131
Fertige DNA-Markierungskügelchen (-dCTP)VWR27-9240-01
UltraPure SSC, 20xThermo Fisher15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418Thermo Fisher10131035
Lachs Sperma DNA LösungThermo Fisher15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High FidelityThermo Fisher11304029
Not IThermo ScientificER0592
Dra IThermo ScientificER0221
EcoR IThermo ScientificER0271
GanciclovirSigmaG2536
Whatman  TurboBlotter Transfersystem, großeKits Fisher Scientific09-301-188
[α 32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 MikrosäulenGE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I HybridisierungslösungMilliporeS4040
Kodak RöntgenfilmZ& Z Medizin844 5702

Referenzen

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