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Methodenartikel

Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila

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DOI:

10.3791/58474

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26. September 2018

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Zelle Dissoziation Protokoll für effizient bei geringen Fülle innerhalb des visuellen Systems der Drosophila durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Zellen zu isolieren.

Zusammenfassung

Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen auf eine kleine Anzahl von Zellen erleichtert. Nutzt diese Technologie, um die Entwicklung in dem visuellen System von Drosophila zu untersuchen, die eine Fülle von Zelle-spezifischen genetischen Werkzeuge bietet, liefert einen leistungsfähigen Ansatz für die Bewältigung der molekularen Grundlagen der Entwicklung mit genauen zellulären Auflösung. Für einen solchen Ansatz realisierbar ist es wichtig in der Lage, zuverlässig und effizient bei geringen Fülle im Gehirn Zellen zu reinigen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die effiziente Reinigung von einzelnen zellklonen im genetischen Mosaik Experimente ermöglicht. Mit diesem Protokoll erreichen wir konsequent einen hohen zellulären Ertrag nach der Reinigung mit Fluoreszenz Zelle Sortieren (FACS) (~ 25 % aller markierten Zellen) aktiviert, und erfolgreich Transkriptom-Analysen auf einzelne zellklonen erzeugt durch Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM). Dieses Protokoll ist ideal für die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen zu spezifischen Zelltypen im visuellen System in verschiedenen Stadien der Entwicklung und im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Manipulationen.

Einleitung

Das visuelle System von Drosophila ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Entwicklung und Verhalten. Es umfasst eine stereotype zellulären Architektur1 und eine erweiterte genetische Toolkit zur Bearbeitung von bestimmten Zelle Arten2,3. Die große Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, selbstständig zu verhören Genfunktion in Zelltypen des Interesses mit einzelligen Auflösung, mit genetischen Mosaik Methoden4,5. Wollten wir diese genetische Werkzeuge mit den jüngsten Fortschritten in der nächsten Generation Sequenzierung durchzuführen Zelle typspezifischen transkriptomischen kombinieren und genomische Analysen in einzelne Zelle Klone in genetischen Mosaik Experimente.

Um dies zu erreichen, ist es wichtig, eine robuste und effiziente Methode, um niedrige reichlich Zellpopulationen im Gehirn selektiv isolieren zu entwickeln. Zuvor haben wir ein Protokoll für bestimmte Zelltypen im visuellen System während pupal Entwicklung durch FACS zu isolieren und bestimmen ihre Transkriptom mittels RNA-Seq6entwickelt. In diesen Experimenten wurden die überwiegende Mehrheit der Zellen eines bestimmten Typs (z. B. R7 Photorezeptoren) eindringmittel beschriftet. Mit dieser Methode in genetischen Mosaik-Experimente, wobei nur eine Teilmenge von Zellen des gleichen Typs sind beschriftet, konnten wir genügend Zellen zur Sequenzierung Qualitätsdaten erhalten zu isolieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir versucht, den zellulären Ertrag zu steigern, durch die Verbesserung der Zelle Dissoziation Protokoll.

Unser Ansatz war es, die Gesamtlänge des Protokolls zum Maximieren der Gesundheit der dissoziierten Zellen, Verbesserung der zellulären Gesundheit durch Veränderung der Dissektion und Dissoziation Puffer zu verringern, und reduzieren die Menge der mechanischen Störung des sezierten Gewebes. Wir testeten die verbesserte Protokoll7 mit Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker5 (MARCM), wodurch Generation Single eindringmittel beschriftet Klone von bestimmten Zelltypen, die Wildtyp oder Mutant für ein Gen des Interesses an einer Ansonsten heterozygot fliegen. Wo unter identischen Bedingungen unserer früheren Protokoll konnte nicht genügend Material für RNA-Seq generiert, war das verbesserte Protokoll erfolgreich. Wir reproduzierbar zellulären ertragreich (~ 25 % der markierten Zellen) und hohe Datenqualität RNA-Seq von weniger als 1.000 Zellen7erhalten.

Eine Reihe von Protokollen sind bisher beschrieben worden, um bestimmte Zelltypen in Drosophila6,8,9,10,11,12,13 isolieren , 14 , 15 , 16. diese Protokolle sind vor allem gedacht für die Isolierung von Zellen, die reichlich im Gehirn sind. Unser Protokoll ist optimiert für geringe reichlich Zell-Populationen (weniger als 100 Zellen pro Gehirn) im visuellen System mit FACS für nachfolgende transkriptomischen und genomische Analysen zu isolieren. Mit diesem Protokoll wollen wir bieten eine Möglichkeit, niedrige reichliche Zellen aus dem Fliegen visuelle System indem Sie FACS und hohe Datenqualität durch RNA-FF Transkriptom reproduzierbar zu isolieren

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Protokoll

1. Planung vor dem Experiment

  1. Führen Sie vor Beginn des Experiments einen kleinen Pilotversuch um sicherzustellen, dass die Genetik erwartungsgemäß, speziell die gewünschten Zellen zu kennzeichnen.
    1. Als ersten Durchgang, Gebrauch Immunohistochemistry und Lichtmikroskopie zu ermitteln, ob sind unerwünschte Zellen gekennzeichnet. Im Idealfall werden genetische Marker spezifische innerhalb der Netzhaut und Optik Lappen (Abbildung 3). Nur Sehlappen dienen zur Zelle Dissoziation und so in das zentrale Gehirn Kennzeichnung ist kein Problem. Zum gleichen Zeitpunkt bestimmen Sie, wie viele Zellen des Interesses pro Gehirn gekennzeichnet sind.
    2. Wenn die genetische Etikett(en) die gewünschten Spezifität, ein pilot FACS-Experiment (Abbildung 4) um festzustellen, ob eine reine Population von Zellen durchführen haben reproduzierbar isoliert werden können und auch zu beurteilen, wie viele Zellen von Interesse kann isoliert werden aus jedem Gehirn. Wenn nötig, beurteilen Sie die Reinheit der isolierten Zellen durch quantitative PCR zu bestimmen, die Anreicherung oder de-Anreicherung bestimmter Gene.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der Kreuze erforderlich, um die gewünschte Menge an Material für das Experiment.
    Hinweis: Basierend auf experimentellen Erfahrungen, ~ 17 – 25 % der fluoreszent markierten Zellen werden mit diesem Protokoll konsequent isoliert und qualitativ hochwertige RNA-Sequenzierung Daten stammen aus so wenig wie 1.000 FACS gereinigt-Zellen (weniger Zellen können ausreichend sein).
    1. Um 1.000 Zellen für RNA-Seq-Analysen zu erhalten, sicherzustellen Sie, dass es mindestens 40 Zellen von Interesse eindringmittel pro Gehirn (20 Zellen pro Optik Lappen) beschriftet. Sezieren Sie um ~ 10, die Zellen von Interesse pro Gehirn, gereinigt zu werden also 100 Köpfe.
    2. Um ~ 100 fliegen in die entsprechenden Entwicklungsstadium in jedem Experiment sezieren zu erhalten, verwenden Sie ~ 100 Kreuze wenn gegen Balancer auswählen (Dies variiert je nach die Genotypen der Eltern). Wenn fliegen homozygot für die Allele/transgene von Interesse sind weniger Kreuze einstellbar.
    3. Begrenzen der Dissektion Fenster bis 1 h zelluläre Gesundheit maximieren und minimieren unspezifische Änderungen der Genexpression und Genom-Organisation, die auftreten können, nachdem Gehirne seziert, aber dies eingestellt werden kann. Bestimmen Sie die Anzahl der Dissectors, 100 Köpfe in 1 h zu zergliedern, die abhängig von der Fähigkeit der Dissectors erforderlich.

2. fliegen Arbeit

Hinweis: Fliegen sind bei 25 ° C mit ca. 50 % Luftfeuchtigkeit ausgelöst, sofern nicht anders angegeben. Unterhalb der Genotyp der Weibchen ist als Genotyp F, und das Männchen als Genotyp M angegeben.

  1. Wachsenden Bestände
    1. Erhalten Sie ~ 100 Durchstechflaschen mit jungen fliegen (nicht mehr als eine Woche alt mit Genotyp F) und ~ 30 Fläschchen mit Genotyp M.
    2. Drehen Sie am Donnerstag der Woche 1 100 Durchstechflaschen mit Genotyp F auf frische Lebensmittel. Ab Freitag, spiegeln Sie die Fläschchen jeden Tag bis Dienstag der Woche 2. Diese 6 Flips werden verwendet werden, um die Jungfrauen zu sammeln. Auch am Mittwoch der Woche 2 flip fliegen von Genotyp M auf frische Lebensmittel und löschen Sie die Eltern am Freitag der Woche 2. Diese Fläschchen werden verwendet werden, um Männer für die Kreuze zu sammeln.
  2. Sammeln von Jungfrauen
    1. Montags von Woche 3 sammeln Sie Jungfrauen aus den Genotyp F-Fläschchen. Sammeln Sie 2 - 3 Mal pro Tag und speichern Sie die Jungfrauen bei 18 ° C mit ca. 50 % Luftfeuchtigkeit. Wiederholen Sie diesen Vorgang täglich bis Dienstag der 4. Woche. Es wird dringend empfohlen, möglichst viele Jungfrauen wie möglich zu sammeln, da viele von ihnen sterben bevor die Kreuze gesetzt werden. In der Regel kreuzt ~ 2.500, die Jungfrauen gesammelt werden sollten, um 100 zu setzen.
  3. Einstellung der Kreuze
    1. Am Freitag der 4. Woche legen Sie die gewünschten Nummern der Kreuze (in der Regel 100-200 Kreuze pro Experiment) mit 15 Jungfrauen der Genotyp F und 7 Rüden von Genotyp M für jedes Kreuz. Es ist sehr wichtig, junge und gesunde Männer mit intakten Flügel einzusetzen.
    2. Drehen Sie die Kreuze täglich von Sonntag bis Samstag der Woche 5. Ergänzen Sie die Kreuze mit frischen Jungfrauen oder Männchen, wenn Tote fliegen gefunden werden. Es gilt zu verhindern, dass die Speisen austrocknen, also die Fläschchen Wasser, je nach Bedarf. Trockenfutter wird die Rendite deutlich schmälern.
  4. Negativ-Kontrolle für die Sortierung von FACS
    1. Unter anderem eine negative Kontrolle ohne die gewünschten Zellen, beschriftet für die FACS-Sortierung. Idealerweise sollten die negative-Kontrolle der Reporter (z.B. FH-GFP) aber nicht der Fahrer (z.B. GAL4) haben, so dass basale Ausdruck des Reporters (FH-Konstrukte können "undicht" sein) bestimmt werden kann, geeignete Anspritzung für die FACS Sortierung festlegen. Flip die fliegen für die negativ-Kontrolle zur gleichen Zeit mit den experimentellen fliegen, und in der gleichen Weise zu inszenieren.
  5. Staging-Puppen
    1. Zellen in einem bestimmten Stadium der pupal Entwicklung (z. B. 40 h nach puppenkammer Bildung [h APF]), Bühne gesammelt die Puppen in einem Zeitfenster von 1 h mit 1 h Zeit für Sezierungen (siehe oben) zugeteilt. FACS sollte direkt nach Zelle Dissoziation, tritt nach Sezierungen und dauert ~ 40 min durchgeführt werden. Also, ist der genaue Zeitpunkt der Inszenierung und Sezierungen durch FACS Verfügbarkeit bestimmt.
    2. Um Puppen bei 40 h APF zu erhalten, am Montag der Woche 6 zu inszenieren, zu einem bestimmten Zeitpunkt (z. B. 17:00), Puppen 40 h später zu zergliedern (z. B. 09:00 am Mittwoch). Verwenden Sie einen nassen Pinsel sanft weißen Pre-Puppen und legen Sie sie an der Wand in vorgewärmten Fläschchen. Wählen Sie nur die Puppen mit gewünschten Genotyp.
  6. Biologischer Replikate
    1. Mindestens 3 biologische Wiederholungen für jedes Experiment zu tun. Als eine einfache Möglichkeit wiederhole das Experiment dreimal in der Woche (Woche 6) mit der gleichen Kreuze. Z. B. Bühne Puppen für die zweiten und dritten Wiederholungen am Dienstag und Mittwoch, jeweils. Diese Puppen jeweils am Donnerstag und Freitag zu sezieren.

3. die Probenvorbereitung

Hinweis: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

  1. Lösungen für Sezierungen und Gewebe Dissoziation vorbereiten
    1. Vorbereiten der proteolytischen Enzym Mischung Stammlösung (siehe Tabelle der Materialien) durch Neuaufbau der gefriergetrockneten Enzyms mit DdH2O zu einer Konzentration von 26 Wünsch Einheiten (Wu) / mL. Für ein Fläschchen mit 260 Wu (große Flasche) das Fläschchen 10 mL DdH2O hinzu, und machen Sie Einweg-Aliquote (4.2 µL pro sind Dissoziation). Shop-Stammlösung bei-20 ° C. Jedes Experiment erfordert Dissoziation von zwei Proben (Negativkontrolle und experimentelle Gewebe).
    2. Bereiten Sie 10 x Rinaldini Lösung (RS) und komplette Schneider Media (CSM) am Vortag der Dissektion (Montag der Woche 6). 5 mL CSM für jedes Sezierer und etwa 5 mL 1 x RS und 5 mL des Richterrates für die Dissoziation von 2 Proben vorbereiten (negative Kontrolle und experimentell). 10 X RS bei 4 ° C für bis zu einem Monat und CSM bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahren.
      1. Lösen Sie um 100 mL 10 X RS vorzubereiten, 8 g NaCl, KCl, 50 mg von NaH2PO4, 1 g Nahco33 und 1 g Glucose in 100 mL DdH2O in einem 250-mL-Becherglas 200 mg. Filter zu sterilisieren mit 0,22 mm Filter.
      2. 20 mg L-Glutathion zu 1 mL DdH2O in einer reaktionscup hinzufügen.
      3. Um 50 mL CSM vorzubereiten, fügen Sie 5 mL Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,1 mL Insulin-Lösung 10 mg/mL, 5 mL 200 mM L-Glutamin Lösung, 12,5 μl von 20 mg/mL L-Glutathion und 1 mL Penicillin-Streptomycin-Lösung (5.000 Einheiten des Penicillins und 5 mg von streptomycin / mL) bis 38,9 mL Schneiders Medien. Filter zu sterilisieren mit 0,22 mm Filter.
      4. 10 X RS mit DdH2O 1 x RS funktionierende Lösung zu verdünnen. Jede Probe 500 μl 1 X RS in nichtklebenden mikroröhrchen vorbereiten.
    3. Schalten Sie ein Wasserbad und stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur korrekt ist, mithilfe eines Thermometers. Das Wasserbad darf bei der korrekten Temperatur vor Papain-Aktivierung. Es wird empfohlen, zum Einstellen der Temperatur am Vorabend eine Morgen-Dissektion.
  2. Bereiten Sie Papain und proteolytischen Enzym Mischung
    Hinweis: Machen Sie Papain Lösung vor jeder Dissoziation frisch.
    1. Am Dienstag der Woche 6 ca. 45 min vor dem Start die Sezierungen rufen Sie 1 Durchstechflasche mit Papain Pulver von 4 ° C ab und bei Raumtemperatur inkubieren. Auch beiseite CSM in ein Eppendorf-Röhrchen bei Raumtemperatur das Papain-Pulver später hinzu.
    2. min vor Beginn der Dissektionen der Durchstechflasche mit Papain (direkt über die GAP) die Raumtemperatur CSM hinzu, so dass die Konzentration 100 Einheiten/mL ist eine Spritze verwenden (die Menge des Pulvers in jedes Fläschchen ist etwas anders, für ein Fläschchen mit 123 Einheiten hinzufügen 1,23 m L der CSM). Mischen, zuerst das Fläschchen Pulver auf der Innenseite der Kappe fest erfassen invertieren und dann pipette rauf und runter.
    3. Hinzu kommt das Fläschchen einen Becher mit Wasser von 37 ° C im Wasserbad. Sicherstellen Sie, dass das Fläschchen Papain-Lösung nicht schwimmt. Aktivieren Sie das Papain für 30 min bei 37 ° C.
    4. Nach dem Hinzufügen der Papain, ein Becherglas im Wasserbad, rufen Sie eine Aliquote proteolytischen Enzym Mischung (26 Wu/mL) von-20 ° C und bei Raumtemperatur inkubieren. Inkubieren Sie nach 30 min der Aktivierung Papain bei Raumtemperatur.
  3. Sezierungen
    1. Am Dienstag der Woche 6 inszenierten pupal Gehirne in kalten CSM mit sauberen Pinzette zu sezieren, und die Sehlappen durch Kneifen an der Kreuzung von der Optik-Lappen und dem zentralen Gehirn abgeschnitten.
    2. Fügen Sie die Lappen am unteren Rand einer reaktionscup mit 500 μl 1 X RS (ein reaktionscup für das experimentelle Gewebe) und eine für die Negativkontrolle Gewebe. Halten Sie die Rohre auf dem Eis.
    3. So viele Lappen möglichst in 1 h zu sezieren. Für die negative kontrollgewebe genügen 10 Lappen. Pool seziert Sehlappen in einem einzigen reaktionscup Gewebeverlust während der Übertragung zwischen mikroröhrchen zu beseitigen.
  4. Zelle Dissoziation
    1. Entfernen Sie vorsichtig die 1 X RS aus die reaktionscup mit seziert Sehlappen mit einer P200-Pipette, verlassen die Lappen abdecken. Fügen Sie 500 μl 1 X RS sorgfältig auf die Seite des Rohres, um das Gehirn so wenig wie möglich stören. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
    2. Lassen Sie die Lappen nach unten zu begleichen. Gerade einmal 200 μL aufgreifen und pipette heraus um zu mischen (Lappen soll sich bewegen). Lassen Sie die Lappen wieder zu begleichen.
    3. Für zwei Proben (experimentelle und eine negative Kontrolle) aktiviert aliquoten 600 μL der Raumtemperatur Papain in eine reaktionscup. Fügen Sie 4.2 μL der Raumtemperatur proteolytischen Enzym Mischung in 600 μL Papain Lösung um eine Endkonzentration von 0,18 Wu/mL zu erhalten. Mischen von pipettieren rauf und runter. Dies ist die Dissoziation-Lösung.
    4. Sorgfältig entfernen Sie 1 X RS von jeder Probe und 300 μL der Dissoziation-Lösung in die Lappen. Inkubieren Sie die Proben bei 25 ° C, 1.000 u/min für 15 min in ein reaktionscup Thermomixer.
    5. Stoppen Sie zu den 5 und 10 min Zeitpunkten den Thermomixer und lassen Sie die Lappen an der Unterseite des die reaktionscup sinken. Dauern Sie bis 200 μl der Lösung und pipettieren, mischen.
    6. Lassen Sie nach 15 min die Lappen niederlassen nach unten und entfernen Sie vorsichtig die Dissoziation-Lösung von den Lappen (versuchen Sie nicht, die Lappen zu stören).
    7. Waschen Sie sich zweimal mit 1 X RS. Um dies zu tun, fügen Sie sorgfältig 500 μl 1 x RS (versuchen Sie nicht, die Lappen zu stören). Zu mischen, vorsichtig pipettieren bis 200 μL und dann pipettieren in die reaktionscup. Lassen Sie die Lappen auf den Boden sinken und wiederholen.
    8. Jede Probe zweimal mit 500 μL des CSM (identisch mit vorherigen Schritt) zu waschen.
    9. Sorgfältig Entfernen der CSM und eine weitere 200 μL des CSM in die Röhre. Mit einer Pipette P200 stören das Gewebe von oben und unten ohne Schaumbildung, pipettieren, bis die Lösung homogen ist (d.h., alle Reste des Gewebes nicht mehr sichtbar).
    10. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 30 μm Mesh Cap in einer 5 mL FACS-Rohr auf dem Eis (ein P200 verwenden und sicherstellen, dass die gesamte Federung durchläuft). Fügen Sie eine weitere 500 μL des CSM, die Dissoziation reaktionscup zu spülen, und Filtern Sie die Lösung in der FACS-Röhre.
    11. Vorsichtig nehmen Sie die Kappe der FACS-Röhre, sammeln Sie die Lösung unter den Siebfilter mit einem P200 und fügen Sie es mit dem Rest der Suspension in der FACS-Röhre. Die Proben sind bereit für FACS.
    12. Achten Sie darauf, mikroröhrchen für das Sammeln von FACS gereinigt Zellen bereit im Voraus haben. Für RNA-Seq, Sortieren Sie Zellen von jeder Probe direkt in mikroröhrchen mit 300 μL der RLT-Puffer (Lyse Puffer) von der RNA-Reinigung-Bausatz (1: 100 2–Mercaptoethanol vor Gebrauch hinzufügen).
  5. FACS sortieren
    Hinweis: Nach der Dissoziation, sofort sortieren Sie die Zellen durch FACS (max. 1 h). Stellen Sie sicher, Buch FACS Sitzungen entsprechend bei der Planung für das Experiment. Ein Zelle Sorter mit 100 μm Düsengröße wird normalerweise verwendet.
    1. Vergleichen Sie die Zelle Verteilung in die negativ-Kontrolle und die experimentelle Probe gating für die Sortierung einzurichten. Im Idealfall zu etablieren, die Anspritzung in FACS-Pilotversuch wird, und die negative Kontrollprobe Bestätigung oder fine-tuning des vorher festgelegten gating. Die Zellen von Interesse aus den hintergrundzellen, die in die negativ-Kontrolle und die experimentelle Probe (Abbildung 4) sind, gut getrennt werden sollten (dies testen in den Pilotversuchen).
    2. Sammeln Sie die sortierten Zellen in die vorbereitete Röhrchen.
  6. RNA-Reinigung
    1. Nach der Sortierung der Zellen direkt in 300 μl Puffer RLT, pipettieren rauf und runter zu die Zellen zu lösen.
    2. RNA nach dem Standardprotokoll Reinigung des Gesamt-RNS aus tierischen und menschlichen Zellen, die mit der Reinigung Reinigen auf Spalte DNA Verdauung7kit (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie die RNA in 20 μl RNase-freies Wasser.
    3. Einfrieren der RNA-Proben mit flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C.
    4. Führen Sie für jedes Experiment mindestens 3 Wiederholungen für Kontrolle und experimentellen Bedingungen. Vorbereiten der cDNA-Bibliotheken für alle Proben zur gleichen Zeit und führen Sie alle Proben auf dieselbe Zelle, für technische Variabilität zu kontrollieren. Sobald alle RNA-Proben vorbereitet sind, verwenden Sie eine Speed-Vac, um das Volumen auf 2 – 5 μL (jede Probe) zu reduzieren.

4. Vorbereitung cDNA-Bibliotheken und Sequenzierung von Smart-seq2

Hinweis: Zur Minimierung von technischen Variabilität machen die cDNA-Bibliotheken zur gleichen Zeit, und sie auf die gleichen Durchflusszelle Sequenz.

  1. Verwenden Sie eine Eingabe von 1,5 μL konzentrierte RNA cDNA-Bibliotheken zu machen, indem Sie die folgenden des Standardprotokolls für Smart-seq217 bis auf folgenden Änderungen: Verwendung ein anderen HiFi-PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien) für PCR Verstärkung; verwendet eine auf Spalte PCR Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien), anstelle von magnetischen Beads, PCR-Produkte zu reinigen.
  2. Die Smart-seq2 Protokoll beinhaltet einen PCR Vorverstärkung Schritt nach der reversen Transkription, sowie eine abschließende anreicherungsschritt PCR nach Tagmentation. Die Anzahl der Zyklen bei der PCR Verstärkung hängt von der Fülle der input-Material. Verwenden Sie mit 1.000 Zellen als Eingabe in der Regel 15 Zyklen in der PCR Vorverstärkung Schritt und 12 Zyklen für die endgültige anreicherungsschritt PCR.
  3. Die Bibliotheken zu bündeln und sie auf einer einzigen Durchflusszelle (z. B. die NextSeq-Plattform) Sequenz.

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Ergebnisse

Allgemeine Regelung
Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll gliedert sich in drei Hauptteile: Arbeit, Probenvorbereitung, Sequenzierung und Analyse von Daten zu fliegen. Die "Planung vor dem Experiment" Sitzung des Protokolls ist nicht in das allgemeine Schema der Einfachheit halber enthalten.

Timeline
Ein Kalender de...

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Diskussion

Dieses Protokoll ist einfach und nicht technisch schwierig zu realisieren, aber es gibt einige wichtige Schritte, die wenn Sie übersehen wird dazu führen, dass eine erhebliche Reduzierung in zellulären Ausbeute. (Schritt 2.3.2.) Es ist entscheidend, dass Kreuze gesund sind, und dass das Essen nicht austrocknet. Regelmässige Bewässerung der Kreuze ist wichtig, die Anzahl der fliegen zur Dissektion zu maximieren, die von der richtigen Genotyp und in der richtigen Phase der Entwicklung. Wie oft kreuzen müssen gewässert werd...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das NINDS von den National Institutes of Health unter prämiennummer K01NS094545, Andgrants von Lefler Mitte für die Studie von neurodegenerativen Erkrankungen finanziert. Wir erkennen Kalkung Tan und Jason McEwan für wertvolle Gespräche.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Liberase TMRoche5401127001Proteolytische Enzymmischung
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9541
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-Aldrich  S5761
GlukoseSigma-AldrichG0350500
L-GlutathionSigma-AldrichG6013
Hitzeinaktiviertes RinderserumSigma-AldrichF4135
InsulinlösungSigma-AldrichI0516
L-GlutaminSigma-AldrichG7513
Penicillin-Streptomycin LösungSigma-AldrichP4458
Schneider's NährmediumGibco21720024
PapainWorthingtonLK003178
2-Mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250-100ML
RNeasy Micro KitQiagen74004RNA-Aufreinigungskit
RNase-freies DNaseQiagen79254
SuperScript II Reverse TranskriptaseLife Technologies18064-014
dNTP MixLife TechnologiesR0191
MgCl2 LösungSigma-AldrichM1028-10X1ML
BetainlösungSigma-AldrichB0300-1VL
RNaseOUTLife Technologies10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNew England BiolabsM0492S
MinElute PCR AufreinigungskitQiagen28004
Nextera XT DNA-Bibliothek VorbereitungskitIlluminaFC-131-1024
Nextera XT Index KitIlluminaFC-131-1001
Reagenzglas mit Zellsieb SchnappverschlussFalcon352235
Bottle-Top VakuumfiltersystemeCorningCLS431153
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000020
FACSAria DurchflusszytometerBD Biosciences656700
HiSeq 2500 SequenziersystemIlluminaSY– 401– Nr. 2501

Referenzen

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
  2. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  3. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
  4. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  6. Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
  7. Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
  8. Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
  9. Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
  10. Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
  11. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
  12. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
  13. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
  14. Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
  15. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
  16. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  17. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  18. Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).

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