Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Zelle Dissoziation Protokoll für effizient bei geringen Fülle innerhalb des visuellen Systems der Drosophila durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Zellen zu isolieren.

Zusammenfassung

Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen auf eine kleine Anzahl von Zellen erleichtert. Nutzt diese Technologie, um die Entwicklung in dem visuellen System von Drosophila zu untersuchen, die eine Fülle von Zelle-spezifischen genetischen Werkzeuge bietet, liefert einen leistungsfähigen Ansatz für die Bewältigung der molekularen Grundlagen der Entwicklung mit genauen zellulären Auflösung. Für einen solchen Ansatz realisierbar ist es wichtig in der Lage, zuverlässig und effizient bei geringen Fülle im Gehirn Zellen zu reinigen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die effiziente Reinigung von einzelnen zellklonen im genetischen Mosaik Experimente ermöglicht. Mit diesem Protokoll erreichen wir konsequent einen hohen zellulären Ertrag nach der Reinigung mit Fluoreszenz Zelle Sortieren (FACS) (~ 25 % aller markierten Zellen) aktiviert, und erfolgreich Transkriptom-Analysen auf einzelne zellklonen erzeugt durch Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM). Dieses Protokoll ist ideal für die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen zu spezifischen Zelltypen im visuellen System in verschiedenen Stadien der Entwicklung und im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Manipulationen.

Einleitung

Das visuelle System von Drosophila ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Entwicklung und Verhalten. Es umfasst eine stereotype zellulären Architektur¹ und eine erweiterte genetische Toolkit zur Bearbeitung von bestimmten Zelle Arten^2,3. Die große Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, selbstständig zu verhören Genfunktion in Zelltypen des Interesses mit einzelligen Auflösung, mit genetischen Mosaik Methoden^4,5. Wollten wir diese genetische Werkzeuge mit den jüngsten Fortschritten in d....

Protokoll

1. Planung vor dem Experiment

1. Führen Sie vor Beginn des Experiments einen kleinen Pilotversuch um sicherzustellen, dass die Genetik erwartungsgemäß, speziell die gewünschten Zellen zu kennzeichnen.
   1. Als ersten Durchgang, Gebrauch Immunohistochemistry und Lichtmikroskopie zu ermitteln, ob sind unerwünschte Zellen gekennzeichnet. Im Idealfall werden genetische Marker spezifische innerhalb der Netzhaut und Optik Lappen (Abbildung 3). Nur Sehlappen dienen zur Zelle Dissoziation und so in das zentrale Gehirn Kennzeichnung ist kein Problem. Zum gleichen Zeitpunkt bestimmen Sie, wie viele Zellen des Interesse....

Ergebnisse

Allgemeine Regelung
Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll gliedert sich in drei Hauptteile: Arbeit, Probenvorbereitung, Sequenzierung und Analyse von Daten zu fliegen. Die "Planung vor dem Experiment" Sitzung des Protokolls ist nicht in das allgemeine Schema der Einfachheit halber enthalten.

Timeline
Ein Kalender de.......

Diskussion

Dieses Protokoll ist einfach und nicht technisch schwierig zu realisieren, aber es gibt einige wichtige Schritte, die wenn Sie übersehen wird dazu führen, dass eine erhebliche Reduzierung in zellulären Ausbeute. (Schritt 2.3.2.) Es ist entscheidend, dass Kreuze gesund sind, und dass das Essen nicht austrocknet. Regelmässige Bewässerung der Kreuze ist wichtig, die Anzahl der fliegen zur Dissektion zu maximieren, die von der richtigen Genotyp und in der richtigen Phase der Entwicklung. Wie oft kreuzen müssen gewässert werd.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Liberase TM	Roche	5401127001	Proteolytische Enzymmischung
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Glukose	Sigma-Aldrich	G0350500
L-Glutathion	Sigma-Aldrich	G6013
Hitzeinaktiviertes Rinderserum	Sigma-Aldrich	F4135
Insulinlösung	Sigma-Aldrich	I0516
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin Lösung	Sigma-Aldrich	P4458
Schneider's Nährmedium	Gibco	21720024
Papain	Worthington	LK003178
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA-Aufreinigungskit
RNase-freies DNase	Qiagen	79254
SuperScript II Reverse Transkriptase	Life Technologies	18064-014
dNTP Mix	Life Technologies	R0191
MgCl2 Lösung	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
Betainlösung	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
RNaseOUT	Life Technologies	10777-019
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S
MinElute PCR Aufreinigungskit	Qiagen	28004
Nextera XT DNA-Bibliothek Vorbereitungskit	Illumina	FC-131-1024
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001
Reagenzglas mit Zellsieb Schnappverschluss	Falcon	352235
Bottle-Top Vakuumfiltersysteme	Corning	CLS431153
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020
FACSAria Durchflusszytometer	BD Biosciences	656700
HiSeq 2500 Sequenziersystem	Illumina	SY– 401– Nr. 2501