Methodenartikel

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

DOI:

10.3791/58501

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9. Oktober 2018

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1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir bieten eine neuartige Methode zur Verbesserung der Resorption Röntgenkontrast Mais Gewebe geeignet für gewöhnliche Microcomputed Tomographie scannen. Basierend auf CT-Bilder, stellen wir eine Reihe von Bildverarbeitungs-Workflows für verschiedene Mais Materialien effektiv mikroskopische Phänotypen der Leitbündel von Mais zu extrahieren.

Zusammenfassung

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Es ist notwendig, die anatomischen Strukturen des Mais Materialien auf Basis von Hochdurchsatz-Bild-Analyse-Techniken genau zu quantifizieren. Hier bieten wir ein "Probe-Vorbereitung-Protokoll" für Mais (d.h., Stamm, Blatt und Wurzel) geeigneten Materialien für gewöhnliche Microcomputed Tomographie (Mikro-CT) scannen. Basierend auf hochauflösenden CT-Aufnahmen des Mais Stamm, Blatt und Wurzel, beschreiben wir zwei Protokolle für die phänotypische Analyse der Leitbündel: (1) basierend auf dem CT-Bild von Mais Stiel und Blatt, entwickelten wir eine bestimmtes Bild Analyse Pipeline um 31 automatisch extrahieren und 33 phänotypische Merkmale der Leitbündel; (2) basierend auf der CT-Bild-Serie von Mais Root, wir richten Sie ein Bild-Verarbeitung-Schema für die dreidimensionale (3D) Segmentierung der Messungen Schiffe und extrahiert zweidimensional (2D) und 3-d-phänotypische Merkmale, wie Volumen, Fläche Messungen Schiffe, etc. Verglichen mit traditionellen manuellen Messung der Leitbündel Mais Materialien, verbessern die vorgeschlagenen Protokolle erheblich die Effizienz und Genauigkeit der phänotypischen Quantifizierung Mikron-Skala.

Einleitung

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Der Maize Gefäßsystem durchzieht die gesamte Anlage, von der Wurzel und Stengel, Blätter, bildet die wichtigsten Transport-Wege für die Bereitstellung von Wasser, Mineralstoffen und organischen Substanzen1. Eine weitere wichtige Funktion des Gefäßsystems soll der Maispflanze mechanische unterstützen. Beispielsweise sind die Morphologie, die Anzahl und die Verteilung der Leitbündel in Wurzeln und Stängeln, die Standfestigkeit von Maispflanzen2,3eng. Zur Zeit Studien über die anatomische Struktur der Leitbündel hauptsächlich nutzen mikroskopische und ultramikroskopischer Techniken um die anatomischen Strukturen eines bestimmten Teils der Stamm, Blatt oder Wurzel, anzuzeigen und dann Messen und zählen diese Strukturen der Interesse durch die manuelle Untersuchung. Zweifellos, manuelle Messung von verschiedenen mikroskopischen Strukturen in groß angelegten Microimages ist eine sehr mühsame und ineffiziente Arbeit und schränkt die Präzision der Microphenotypic Merkmale, aufgrund seiner Subjektivität und Inkonsistenz4, 5.

Mais hat keine sekundäre Wachstum, und Inhalt der Zelle besteht im Wesentlichen aus Wasser in den primären Meristem. Ohne jede Vorbehandlung können frische Proben von Mais Gewebe direkt mit einem Mikro-CT-Gerät gescannt werden; die Scan-Ergebnisse sind jedoch wahrscheinlich schlechte und rau. Die Hauptgründe sind wie folgt zusammenfassen: (1) niedrige Dämpfung dichten von Pflanzengewebe, was einen geringen Kontrast von Ordnungszahl und hohe Rauschen in Bildern; (2) frisches Pflanzenmaterial sind anfällig für austrocknen und schrumpfen während der normalen Scan-Umgebung, wie Du6berichtet. Die oben genannten Probleme sind die Haupthindernisse für die Entwicklung und Anwendung der Microphenotyping-Technologie für Mais, Weizen, Reis und anderen monocotylen geworden. Hier stellen wir das "Probe-Vorbereitung-Protokoll", die Proben von Mais Stamm, Blatt und Wurzel Vorbehandeln. Dieses Protokoll verhindert die Austrocknung und Verformung des pflanzlichen Rohstoffen bei der CT Scan; Daher ist es vorteilhaft, die Aufbewahrungszeit von Pflanzenproben mit Nondeformation zu erhöhen. Darüber hinaus erhöht der Färbe Schritt basierend auf soliden Jod auch den Kontrast von Pflanzenmaterial; So macht es signifikante Verbesserungen in der Bildqualität von Mikro-CT Darüber hinaus entwickelten wir Bildverarbeitungs-Software, namens VesselParser, die CT-Bilder von Mais Stengel und Blätter zu verarbeiten. Diese Software integriert eine Reihe von Bildverarbeitungs-Pipelines zu hohem Durchsatz und automatische Phänotypisierung Analysen für 2-D-CT-Aufnahmen von verschiedenen Pflanzengeweben. Leitbündel in den gesamten Querschnitt des Mais Stiel und Blatt werden erkannt, extrahiert und durch eine automatische Bildverarbeitung Methode identifiziert. Dadurch erhalten wir 31 mikroskopische Phänotypen des Mais Stammes und 33 mikroskopische Phänotypen des Mais Blattes. Für die CT-Bild-Serie der Mais Wurzel entwickelten wir ein Bildverarbeitungs-System, 3-d-phänotypische Merkmale der Messungen Schiffe zu erwerben. Dieses Schema ist in der Effizienz der Bildaufnahme und Wiederaufbau im Vergleich zu traditionellen Methoden überlegen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bildverarbeitung Rohrleitungen, wenn man bedenkt, dass die Abbildungseigenschaften von normalen x-ray Micro-CT bieten eine effektive Methode für die mikroskopische Phänotypisierung von leitbündeln; Das extrem weitet sich die Anwendungen von CT Techniken in Pflanzenkunde und verbessert die automatische Phänotypisierung von Pflanzenmaterial im zellulären Auflösung6,7.

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Protokoll

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1. Probe Vorbereitung Protokoll

  1. Für die Probenahme sammeln die Stengel, Blatt, Wurzel aus frischen Mais Pflanzen und teilen sie in drei Arten von Beispielgruppen (jede Gruppe mit vier Wiederholungen). Dann schneiden sie in kleine Segmente mit einer chirurgischen Klinge auf folgende Weise: (1) Schnitt ein Segment der mittleren Stamm Internodium 1-1,5 cm Länge; (2) schneiden Sie ein Segment für die maximale Breite des Blattes 0,5 - 3 cm in der Länge entlang der vertikalen Richtung mit der Hauptader; (3) geschnitten Sie ein Segment der eigentlichen Krone 0,5 cm in der Länge.
  2. Einweichen Sie für die FAA-Fixierung der Probe-Segmente in eine FAA-Lösung (90:5:5 V/V/V, 70 % Ethanol: 100 % Formaldehyd: 100 % Essigsäure) für mindestens 3 d.
  3. Führen Sie die Dehydrierung in sechs sequenziellen Ethanol-Gradienten (d.h.30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % und 100 %) und die Bearbeitungszeit von jeder Ethanol Verlauf als 30 min festgelegt.
  4. Legen Sie das Pflanzenmaterial in die entsprechende Probe-Körbe hergestellt, mit einem 3-d-Drucker; übertragen Sie anschließend die Probe Körbe schnell auf die Sample-Zelle von einer CO2 kritische Punkt Trocknungsanlage. Legen Sie die Trocknungsparameter wie folgt:
    (1) CO2 in: Eilgang. Inhaber Füllstoffe: 100 %.
    (2) kostenlos: CO2 kostenlos Verzögerung 120 s in den Kreislauf. Austausch von Geschwindigkeit: 5. Zyklus Anzahl: 12.
    (3) Gas heraus: Wärme, schnell. Geschwindigkeit: langsam, 50 %.
    1. Nach der morphologischen Unterschiede von Mais Wurzel, Stamm und Blatt, Design und print Sample Körbe mit einem 3-d-Drucker (z. B. Abbildung 1).
  5. Legen Sie die getrockneten pflanzlichen Rohstoffen (Mais Wurzel, Stängel oder Blatt) in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 2 g solide Jod färben das Pflanzenmaterial mit flüchtigen Jod Dampf und platzieren Sie dann die Rohre in einem lichtdichten Raum für 4-5 h.

2. Micro-CT-Scan-Protokoll

  1. Um in den Rohdaten CT scan, der CT Scan-Parameter wie folgt eingestellt: 40 kV/250 µA (für Stamm und Blatt) oder 34 kV/210 µA (für Root). Die entsprechenden Bereiche für die verschiedenen Größen und Volumina der verwendeten pflanzlichen Materialien zu scannen, und passen Sie die bildgebenden Pixelgrößen wie folgt: 2,0 µm (für den Mais Stamm), 6.77 µm (für den Mais Stamm) und 10,0 µm (nach dem Mais Blatt).
  2. Um Schnittbilder zu rekonstruieren, konvertieren Sie die CT Rohdaten in CT-Slice-Bilder mit einer Auflösung von 2K (2.000 x 2.000 Pixel) mit einem Bild-Wiederaufbau-Software. Weitere Details sind in der NRecon Bedienungsanleitung (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf) zur Verfügung gestellt.

3. Image Analyse Protokoll für eine Single-CT-Bild eines Mais Stamm oder Blatt

Hinweis: Verwenden Sie automatische imaging-Software für Leitbündel, die Phänotypisierung Analyse der Leitbündel in CT-Schnittbildern des Mais Stiel und Blatt (Abbildung 2). Die Software-Nutzung-Schritte werden im folgenden beschrieben.

  1. Benennen des Orgel-Typs zum anderen Algorithmus Rohrleitungen zu initialisieren. Klicken Sie auf Methodenparameter und wählen Sie Mais Stamm oder Mais Blatt im ersten Dropdown-Feld aus.
  2. Um die Bilder zu importieren, klicken Sie auf die Schaltfläche " Datenverwaltung ", legen Sie das Arbeitsverzeichnis und importieren Sie automatisch alle Schnittbilder in diesem Verzeichnis. Wählen Sie Einzel- oder Multi-Slice-Bilder in der Bild-Pipelines.
  3. Ermitteln Sie die tatsächliche Pixelgröße des Bildes. Klicken Sie auf Methodenparameter und geben Sie die tatsächliche Pixelgröße des Bildes in das Element bearbeiten von der Pixelgröße.
  4. Klicken Sie für die Phänotypisierung Berechnung, um automatisch extrahieren phänotypische Merkmale der Leitbündel für alle ausgewählten Schnittbilder Phänotypisierung Berechnung .
  5. Klicken Sie auf statistische Analyse , um die Ergebnisse als eine TXT oder CSV-Datei-Format ausgegeben.

4. Bild Analyse Protokoll für CT-Bild-Serie der Mais Wurzel

Hinweis: Die CT-Bild-Serie von Maiswurzeln werden genutzt, um die 3-d-Strukturen der Messungen Schiffe mit Bildbearbeitungs-Software zu extrahieren. Die wichtigsten Schritte sind wie folgt.

  1. Importieren Sie die rekonstruierten Bilder von Maiswurzeln (im BMP-Datei-Format) und bestimmen Sie die genaue Abstände Parameter (die Größe des ein Voxel [d.h., X, y, Z]). Verwenden Sie das rekursive "glockenförmig" Werkzeug um zu glätten diese Bilder um die Bildqualität zu verbessern.
  2. Durchführung von 3-d-Segmentierung der Messungen Schiffe durch Anpassung der Parameter Schwelle; Dies erzeugt eine einheitliche Farbe Bezeichnung für jedes angeschlossene Messungen Schiff.
  3. Zu verbessern Sie und die Messungen Schiffe interaktiv mit Morphologie, bitweise, und Füllung Operationen.
  4. Führen Sie Volume Visualisierung und Oberfläche Rekonstruktion der Gefäße. Verwenden Sie die Maske-Statistik-Tool zu zählen und messen die phänotypische Merkmale eines Schiffes in den 2-D und 3-d-Niveaus.

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Ergebnisse

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Die Probe Vorbereitung Protokoll geeignet für normale Mikro-CT-Scan nicht nur verhindert die Verformung der Pflanzengewebe aber auch verstärkt den x-ray Absorption Kontrast. Vorbehandelte pflanzlichen Stoffen werden gescannt, mit einem Mikro-CT-System in qualitativ hochwertige Schnittbilder, und die höchste Auflösung erreichen 2 µm/Pixel. Abbildung 4 zeigt die gescannten Mikro-CT-Bilder der Stamm, Blatt und Wurzel und den Kontrast des Bildes hat eine deutlich...

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Diskussion

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Mit den erfolgreichen Einsatz der CT-Technologie in den Bereichen Biomedizin und Materialwissenschaften wurde diese Technologie nach und nach in den Bereichen Botanik und Landwirtschaft, Förderung der Forschungen in den Lebenswissenschaften Werk als ein viel versprechendes Instrument der technischen eingeführt . In den späten 1990er Jahren war CT Technologie erstmals zur Untersuchung der morphologischen Strukturen und Entwicklung der Pflanze-Wurzel-Systeme eingesetzt. In den letzten zehn Jahren Synchrotron HRCT ist ein l...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Natur Science Foundation of China (No.31671577), die Wissenschaft und Technologie Innovation besondere Bau finanzierte Programm von Peking Akademie für Land- und Forstwirtschaft Sciences(KJCX20180423), die Forschung Entwicklungsprogramm von China (2016YFD0300605-01), der Beijing Natural Science Foundation (5174033), der Beijing Postdoc Research Foundation (2016 ZZ-66), und die Peking-Akademie der Landwirtschaft und Forstwirtschaft Wissenschaften Grant (KJCX20170404) ( JNKYT201604).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Skyscan 1172 Röntgen-Computertomographie-SystemBruker Corporation, BelgienNAFür CT-Scans
CO2 Critical-Point-Trocknungssystem (Leica CPD300)Leica Corporation, DeutschlandNAFür die Probentrocknung
EthanolBeliebigNAFür FAA-Fixierung
FormaldehydBeliebigNAFür FAA-Fixierung
Essigsäure SäureBeliebigNAFür die FAA-Fixierung
Chirurgische KlingeBeliebigNAZum Schneiden der Probenschnitte
3D-DruckerMakerbot Replicator 2, MakerBot Industries, USANAZum Drucken der Probenkörbe von Maiswurzel, -stiel und -blatt
ZentrifugenröhrchenCorning, USANAPlatzieren Sie die Wurzel-, Stängel- oder Blattmaterialien
Festes JodBeliebigNAFür die Probenfärbung
SkyScan Nrecon SoftwareSkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiumNAFür die Bildrekonstruktion
VesselParser SoftwareVesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, ChinaNABildanalyseprotokoll für ein einzelnes CT-Bild von Maisstängel oder -blatt
ScanIPScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UKNA 3D-Bildverarbeitungssoftware
LatexhandschuheAnyNA
PinzetteAnyNA

Referenzen

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  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

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