Methodenartikel

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

DOI:

10.3791/58504

⸱

4. November 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.

Zusammenfassung

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Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) des Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) ist ein sofortiger Anfang Protein mit einem RING-Typ E3-Ubiquitin-Ligase. Es ist verantwortlich für den proteasomalen Abbau von Host einschränkende Faktoren und die anschließende virale Genaktivierung. ICP0 enthält eine kanonische nuklearen Lokalisierung Abfolge (NLS). Es tritt den Kern sofort nach de-Novo -Synthese und führt seine Anti-Host Verteidigungsfunktionen vor allem im Zellkern. Jedoch später in Infektion, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion ICP0 ausschließlich im Zytoplasma, gefunden. Vermutlich kann ICP0 Translokation ICP0 seine Funktionen entsprechend seine subzellulären Standorten in verschiedenen Infektion Phasen zu modulieren. Um die biologische Funktion und Regulationsmechanismus ICP0 Atom-cytoplasmatische Translokation abzugrenzen, haben wir eine immunofluorescent Mikroskopie-Methode zur Überwachung der ICP0 Menschenhandel bei HSV-1 Infektion geändert. Dieses Protokoll beinhaltet immunofluorescent Färbung, confocal Mikroskop Bildgebung und nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilungsanalyse. Das Ziel dieses Protokolls ist die Steady-State konfokale Bilder in einen zeitlichen Verlauf in eine quantitative Dokumentation der ICP0 Bewegung in der lytischen Infektion anzupassen. Wir schlagen vor, dass diese Methode verallgemeinert werden kann, um nuklearen vs. zytoplasmatischen Lokalisierung von anderen viralen oder zelluläre Proteine quantitativ zu analysieren, ohne Einbeziehung von live-imaging-Technologie.

Einleitung

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Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) verursacht eine Vielzahl von leichten bis schweren herpetische Erkrankungen einschließlich Herpes Labialis, Herpes genitalis, stromale Keratitis und Enzephalitis. Einmal infiziert, stellt das Virus eine lebenslange latente Infektion in den Ganglien Neuronen. Gelegentlich kann das Virus durch verschiedene Ursachen wie Fieber, Stress und Immunsuppression1, führt zu immer wiederkehrenden Herpes-Infektion reaktiviert werden. Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) ist viral Schlüsselregulator für lytische und latente HSV-1 Infektion von entscheidender Bedeutung. Es transactivates nachgeschalteten Virus Gene über Bekämpfung der Host intrinsische/angeborenen antiviralen Abwehr2,3. ICP0 hat eine E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit, die mehrere Zelle Faktoren für Proteasom-abhängige Abbau3richtet sich an. Es interagiert auch mit verschiedenen Zelle Signalwege, ihre Aktivitäten zu regulieren und anschließend Rechner antiviralen Einschränkungen3auszugleichen. ICP0 tritt bekanntermaßen bei verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu finden, da die Infektion3,4,5 verläuft. Das Protein besitzt ein Arginin/Lysin-reiche nuklearen Lokalisierung-Signal (NLS) Rückstände 500, 506-6. Bei der de-Novo -Synthese im frühen HSV-1 Infektion wird ICP0 sofort in den Zellkern importiert. Es ist zuerst erkannt, bei einer dynamischen nukleare Struktur bezeichnet Nuklearbereich 10 (ND10)7. Die E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit der ICP0 löst den Abbau von ND10 Veranstalter Proteine, Promyelocytic Leukämie (PML) Protein und gesprenkelten Protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Nach dem Verlust von Proteinen, Veranstalter ND10 nuklearen Einrichtungen sind weit verstreut und ICP0 wird verbreitet, um die gesamte Kern4,11zu füllen.

Interessant ist, nach dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation verschwindet ICP0 aus dem Zellkern. Es findet ausschließlich im Zytoplasma, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation spät in HSV-1 Infektion4,12. Das Erfordernis der DNA-Replikation bedeutet die mögliche Beteiligung von einem späten virale benutzt bei der Erleichterung der zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP04,12. Offenbar ICP0 Handel unter verschiedenen Kompartimenten während der Infektion befähigt ICP0 seine Interaktionen zu verschiedenen zellulären Wege in eine räumlich-zeitliche Mode zu modulieren, und daher koordinieren ihre vielfältigen Funktionen zu feinen Melodie die Balance zwischen die lytische und latente HSV-1 Infektion13. Zum besseren Verständnis der ICP0 Multifunktionalität und die Koordination der ICP0 Funktionsbereiche in der lytischen Infektion seziert wir sorgfältig die molekulare Grundlagen der dynamischen ICP0 Translokation12. Um die mechanistische Studien bereits berichtet12durchführen zu können, haben wir eine immunofluorescent Färbung Methode um ICP0 subzelluläre Lokalisation bei verschiedenen Infektionsstatus unter confocal Mikroskop visualisieren angewendet. Wir haben auch eine quantitative Protokoll zu analysieren, die nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 mit Hilfe der konfokalen Software entwickelt. Die Bevölkerung von HSV-1 infiziert Zellen war während der gesamten Infektion tabellarisch dargestellt und die Trends der ICP0 Bewegung wurden unter verschiedenen biochemischen Behandlungen12analysiert. Hier beschreiben wir dem ausführliche Protokoll, dass Dokumente ICP0 Translokation in HSV-1-Infektion. Wir schlagen vor, daß diese Methode kann, als eine allgemeine Methode angenommen werden, um die nukleare vs. zytoplasmatischen Translokation für andere virale oder zelluläre Proteine, studieren die dienen können, als Alternative zur live Bildgebung, wenn die live bildgebende Verfahren ist nicht anwendbar auf Probleme wie Kennzeichnung Methode, Signalintensität oder Protein Fülle.

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Protokoll

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(1) Zelle Aussaat und Virus-Infektion

  1. Samen Sie bei 20-24 h vor der Virusinfektion 5 x 104 von menschlichen embryonalen Lunge (HEL) Fibroblastenzellen oder andere Zellen auf einer 11 mm 4-gut gestaffelten Folie in Wachstumsmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen Rindern geprüft werden Serum (FBS)). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
    Hinweis: Jede sollte gut 70-80 % Zelle Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion haben.
  2. Am nächsten Tag das Wachstumsmedium zu entfernen und die Zellen mit Viren in Medium-199 bei einer Reichweite von 4 – 10 Pfu/Zelle zu infizieren. Inkubieren Sie Virus-infizierten Zellen für 1 h bei 37 ° c Schütteln Sie halten Sie die Folie während der Inkubationszeit.
  3. Nach 1 h Inkubation Medium-199 zu entfernen und zu ergänzen mit Wachstumsmedium.
    Hinweis: Medikamente, die mit verschiedenen Infektion Phasen stören können bei diesem Schritt bzw. vor viralen Aufnahme hinzugefügt werden.
  4. Die Virus-infizierten Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 für verschiedene Längen der Infektion Periode auszubrüten.

2. Fixierung und Permeabilisierung

  1. Zeitpunkt der richtigen Infektion schnell waschen Sie die infizierten Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 3 Mal und 200 μL der 4 % Paraformaldehyd frisch zubereitet mit PBS-Puffer. Inkubation der Zellen mit Paraformaldehyd für 8 – 10 min bei Raumtemperatur, die Zellen in jedem Bohrloch zu beheben.
  2. Aspirieren Sie Paraformaldehyd und waschen Sie die Brunnen mit 200 μl PBS für 3 Mal. Aspirieren Sie völlig PBS nach der 3rd -Wäsche.
  3. Fügen Sie 100 μL von 0,2 % nicht-ionische Tenside in jede Vertiefung, die Zellen für 5 – 10 min permeabilize.
  4. Nichtionischen Tensids abzusaugen und die Brunnen mit 200 μl PBS für 3 Mal waschen.

3. immunofluorescent Färbung

  1. Ganz Aspirieren PBS und fügen Sie 200 μL der blockierenden Puffer (1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 5 % Pferd Serum mit PBS-Puffer) in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 1 h oder bei 4 ° C.
  2. Fügen Sie experimentell ermittelten Konzentration der Primärantikörper (Kaninchen Anti-ICP0 polyklonalen Antikörper12) in blocking-Puffer und inkubieren Sie Primärantikörper bei Raumtemperatur für 2 h oder bei 4 ° C über Nacht.
  3. Waschen Sie mit blockierenden Puffer 3 Mal mit 10 min Inkubation. Fügen Sie Alexa 594 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 400 in blocking-Puffer verdünnt) und inkubieren Sie die Folien bei Raumtemperatur für 1 h. Dann waschen Sie die Folien 3 Mal mit blocking-Puffer in 10 min Intervall.
  4. Schließlich waschen Sie die Folie einmal mit PBS, passives BSA und Pferd Serum zu entfernen.
  5. Geben Sie einen Tropfen des antifade Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Montage der Folie und mit Deckglas mit transparenten Nagellack versiegeln.

4. confocal Imaging

  1. Legen Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Wellenlänge bei 590 – 650 nm für Alexa 594 und 410 – 520 nm für DAPI. Wählen Sie Bildformat bei 1024 x 1024 und Linie Durchschnitt von 8, hochauflösende Bilder zu erwerben.
  2. Analysieren Sie jede Vertiefung auf der 4-Well-Folie unter confocal Mikroskop. Repräsentative Zelle Bilder unter dem 100 X Objektiv zu erwerben, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt.
  3. Nehmen Sie für die große Anzahl von Zellen zu zählen Bilder von aufeinander folgenden Felder unter den 40 X Objektiv.
    Hinweis: Es erfordert 5 – 10 Bilder, über 200 infizierte Zellen von jeden Zeitpunkt jede Infektion zu sammeln.
  4. Fotografieren Sie in jedem Experiment mit konstanter konfokale Parameter für alle Proben verglichen werden müssen.

5. Analyse der nuklearen vs. zytoplasmatischen Verteilung

  1. Offenes Projekt mit der konfokalen Anwendungssoftware. Wählen Sie ein Bild aus der Zellen für nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 tabellarisch dargestellt werden müssen.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte "Quantity" vom oberen Menü und wählen Sie "sortieren ROIs" aus dem Menü "Extras".
  3. Eine Linie längs über die Zelle analysiert werden, durch die Auswahl "Schlussstrich" oben im Menü.
    Hinweis: Histogramm wird angezeigt der Fluoreszenzintensität entlang der Linie für ICP0 und DAPI. Im Histogramm blaue Linie stellt DAPI Pixel dar und markiert die Grenze des Kerns, während die rote Linie ICP0 Pixel darstellt.
  4. Basierend auf Hintergrundfärbung, richten Sie einen konstanten Schwellenwert für ICP0 Intensität ICP0 subzelluläre Verteilung in jedem Experiment zu analysieren.
    1. Beispielhaft in Abbildung 2, wenn im Durchschnitt das rote signal unterhalb der Schwelle im nuklearen Bereich jedoch oberhalb der Schwelle über die blaue Grenze, das rote Signal als überwiegend befindet sich im Zytoplasma zu kategorisieren.
    2. Wenn das rote Signal oberhalb der Schwelle in den Zellkern und jenseits der Grenze des blauen Signals ist, gruppieren Sie das rote Signal als Kern plus zytoplasmatischen Lokalisierung.
    3. Wenn das rote Signal oberhalb der Schwelle im Zellkern ist aber im Durchschnitt unterhalb es außerhalb der Begrenzungen des blauen Signal ist, gruppieren Sie das rote Signal als nukleare Lokalisation.
  5. Tabellieren Sie mehr als 200 infizierte Zellen von jeder Probe zu verschiedenen Infektion Zeit und Handlung im Balkendiagramm ICP0 Bewegung nach Zeit (Abbildung 3) illustrieren.

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Ergebnisse

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Verständnis der molekularen Grundlagen und biologische Funktionen des Menschenhandels ICP0 bei HSV-1 Infektion, verwenden wir eine Methode immunofluorescent Mikroskopie ICP0 subzelluläre Verteilung auf verschiedene Infektion Phasen zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Zellen mit markanten ICP0 Lokalisierung als die Infektion fortschreitet. Zur Quantifizierung der nuklearen-cytoplasmatische Translokation ICP0 analysieren wir ICP0 Verteilung bez...

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Diskussion

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Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nukleare zu zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP0 zu studieren. ICP0 erfährt subzelluläre Menschenhandel bei HSV-1 Infektion (Abbildung 1). Wahrscheinlich, ICP0 interagiert mit verschiedenen Zelle Signalwege, verschiedene Funktionen an unterschiedlichen Standorten durchzuführen. Dies ermöglicht ICP0 zur Feinabstimmung ihre vielfältigen Funktionen in das Tauziehen mit menschlichen Gastgeber13. Aber ist wie ICP0 die viel...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Wir danken finanziellen Unterstützung aus einem NIH-Zuschuss (RO1AI118992) an Haidong Gu vergeben. Wir danken der Mikroskopie, Imaging & Zytometrie Ressourcen (MICR) Core-Anlage an der Wayne State University für den technischen Support.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellen und Viren
Humane embryonale Lungenfibroblasten (HEL-Zellen)Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)HEL-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS
HSV-1 Virusstamm (Stamm F)Dr. Bernard Roizman Labor
Mittel
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Invitrogen  11965-092
Fötales Kälberserum (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015<
strong>Reagenzien
4-Well-Reagenzien 11 mm gestaffelter ObjektträgerCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16%ige Paraformaldehyd-Lösung (w/v) MethanolfreiThermo Scientific28908
Triton X-100Fisher ReagenzienBP151-1C0
Rinderserum Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
PferdeserumSigmaH1270
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7,4)Dr. Haidong Gu Labor
NaCl           Fisher BioreagenzBP358-212
KH2PO4                       Fisher BioreagenzBP362-500
KCl                         Fisher Wissenschaftlich BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagenzBP332-500
Blockierungspuffer (PBS mit 1 % BSA und 5 % Pferdeserum)Dr. Haidong Gu Labor
Rabiit Anti-ICP0 AntikörperDr. Haidong Gu Labor
PML (PG-M3)-Maus monoklonales IgGSanta Cruz BiotechnologySC-966
Alexa Fluor 594-Ziegen Anti-Kaninchen IgGInvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-Ziege Anti-Maus IgGInvitrogenA11001
Vectashield Mouting Medium mit DAPIVector LaboratorienH-1200
Pasteur-PipetteFisher Brand13-678-20D
NagellackSally Hansen
Equipment
Konfokales MikroskopLeica SP8
Konfokale SoftwareLeica LAS X Application Suite
Excel-SoftwareMicrosoft Excel
HERAcell 150i CO2 InkubatorThermoScientific Bestellnummer 51026282

Referenzen

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Schlagwörter

Kern Zytoplasma TranslokationHSV 1 ICP0 ProteinProteintransportanalysesubzellul re Lokalisationkonfokales BildgebungsprotokollMessung der Fluoreszenzintensit tDAPI Kernf rbungZeitverlauf der Infektionvirale Genaktivierung

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