Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Summary

Wir beschreiben die Methoden für die fluoreszierenden Kennzeichnung von tangential Migration Zellen durch Elektroporation und für Zeitraffer-Aufnahmen von der markierten Zelle Bewegung in einer Wohnung-Mount-Kultur um die Migration zu visualisieren Zelle Verhalten in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum .

Abstract

Zeitraffer-Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode, wandernde Zelle Verhalten zu analysieren. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die Bewegung der markierten Zellen in Kultur unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, ist Stück Kultur verbreitet Zellwanderung parallel zum Abschnitt Slice wie radial Zellwanderung beobachten. Die Slice-Kultur-Methode Zellwanderung senkrecht zur Scheibe Abschnitt, z. B. tangentiale Zellwanderung analysieren kann jedoch nur begrenzte Informationen einzuholen. Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum. Eine Kombination aus Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovo und eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht eine Erfassung der wandernde Zelle Bewegung in der horizontalen Ebene. Darüber hinaus ermöglicht unsere Methode Erkennung der einzelnen Zelle Verhalten und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen auf lange Sicht. Diese Methode kann potenziell angewendet werden, um die sequenzielle Änderung der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Mikro-Struktur, einschließlich der axonalen Dehnung in die neuronale Gewebe oder Zellen Verschiebung im nicht-neuronale Gewebe zu erkennen.

Introduction

Mit der fortschreitenden Technik live Imaging hat das Studium der Zellmigration voran. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die zeitliche Bewegung der markierten Zellen in einer Kulturschale oder in Vivo unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. In der Studie der neuronalen Entwicklung wurden die morphologische Veränderungen der Zellen migrieren oder verlängern Axone mit Zeitraffer Bildgebung analysiert. Für effektive Belichtung ist es wichtig, eine geeignete Methode für fluoreszierende Zelle Kennzeichnung und Gewebe Zubereitung, basierend auf dem Zweck des Experiments und Analyse anwenden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde ....

Protocol

1. Electroporation In Ovo

1. Bereiten Sie vor, dass der Ausdruck Plasmid DNA fluoreszierende Kennzeichnung in hoher Konzentration. Isolieren Sie DNA aus 200 mL Bakterienkultur von der alkalischen Lyse-Methode mit Anionen-Austausch Spalten entsprechend des Herstellers Protokoll (Table of Materials). Mischen Sie pCAGGS-EGFP und pCAGGS-mCherryNuc auf eine Endkonzentration von 4 µg/µL.
   Hinweis: Endotoxin-freie Plasmid DNA Reinigung möglicherweise für die Elektroporation bevorzugt.
2. Inkubieren Sie fruchtbaren Hühnereier horizontal bei 38 ° C 70 % Relative Luftfeuchtigkeit.
3. Nach 2,5 Tagen 5 mL Albumin (Eiweiß) aus der S....

Results

Abbildung 2 zeigt die visualisierte oberflächliche tangentiale Migration in einer Wohnung-Mount-Kultur zu einer verstrichene Zeit (0, 9, 18, 27 h) nach Beginn der Aufzeichnung. Film 1 ist ein Zeitraffer Film von 10 Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 28 h 50 min. Der Rahmen ist für die Fokussierung auf die Migration von Zellen von den beschrifteten unteren linken Ecke des Rahmens auf den unmarkierten Raum (

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll ist für die Erkennung von Zellwanderung in oberflächlichen Schichten^6,8optimiert. Es ist anwendbar für die Erkennung von Mittelschicht Migration Bäche (Movie 5)^6,7, nur durch Verschieben der Zeitplan für die Elektroporation (E5.5, E4.5) und dem Beginn der Kultur und Bildgebung (E7.0, E6.0).

Das vorgestellte Verf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxinfreies Plasmid-DNA-Aufreinigungskit
20 ml Spritze	TERUMO	SS-20ESZ
18 Gauge Nadel	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x Penicillin und Streptomycin	Gibco	15140-122
Glaskapillarröhrchen	Narishige	G-1
Zellkultureinsatz	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	Beschichtung des Kultureinsatzes
Poly-L-Lysin	Peptide Institute	3075	Beschichtung des Kultureinsatzes
Glasbodenschale	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	Nährmedium
F12	Gibco	11765-054	Nährmedium
fötales Rinderserum	Gibco	12483	Nährmedium
Kükenserum	Gibco	16110082	Nährmedium
10xHBSS	Gibco	14065-056
mikrochirurgisches Messer	Zusammenarbeit bei chirurgischen Spezialitäten	72-1501
Name	Unternehmen<	strong>Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
Schere	AS ONE	Nr.11
Mikropipettenprozessor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
Pinzettenelektrode	BEX	LF646P3x3
Impulsgenerator	BEX	CUY21EX	Elektroporator
Fluoreszenzmikroskop stereoskopisches Mikroskop	Leica	MZ16F
inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX81
Gasregler	Tokken	MIGM/OL-2
Temperaturregler	Tokai Hit	MI-IBC
Laser Konfokaleinheit	Olympus	FV300