Wir stellen hiermit ein Protokoll vor, um am Krankenbett die Endotoxinaktivität menschlicher Vollblutproben zu messen. Der Endotoxin Activity Assay ist ein einfacher Test und kann ein nützlicher Biomarker bei kritisch kranken Patienten mit Sepsis sein.
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Methodenartikel
Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lipopolysaccharid, auch bekannt als Endotoxin, ist ein grundlegender Bestandteil von gramnegativen Bakterien und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Sepsis und septischem Schock. Die frühzeitige Identifizierung eines infektiösen Prozesses, der sich rasch zu einer kritischen Krankheit entwickelt, könnte zu einer schnelleren und intensiveren Behandlung führen und damit potenziell zu besseren Patientenergebnissen führen. Der Endotoxin Activity (EA) Assay kann am Krankenbett als zuverlässiger Biomarker für systemische Endotoxämie verwendet werden. Der Nachweis erhöhter Endotoxin-Aktivitätsniveaus wurde wiederholt mit einer erhöhten Krankheitsschwere bei Patienten mit Sepsis und septischem Schock in Verbindung gebracht. Der Test ist schnell und einfach durchzuführen. Kurz nach der Probenahme wird ein Aliquot von Vollblut mit einem Anti-Endotoxin-Antikörper und mit zusatz LPS vermischt. Die Endotoxinaktivität wird als relativer oxidativer Ausbruch von grundierten Neutrophilen gemessen, wie sie durch Chemiolumineszenz nachgewiesen werden. Die Ausgabe des Assays wird auf einer Skala von 0 (abwesend) bis 1 (maximal) ausgedrückt und als "niedrig" (<0,4 Einheiten), "zwischengeschaltet" (0,4–0,59 Einheiten) oder "hoch" (0,6 Einheiten) kategorisiert. Die detaillierte Methodik und die Gründe für die Umsetzung des EA-Assays sind in diesem Manuskript aufgeführt.
Einleitung
Das Lipopolysaccharid (LPS), auch bekannt als Endotoxin, ist ein wichtiger Bestandteil der Membranstruktur von Gram-negativen (GN) Bakterien. Es macht etwa 10% der Zellwand aus und ist für die äußere Membranintegrität und Homöostase lebenswichtig. Darüber hinaus ist es ein potenter Aktivator des angeborenen Immunsystems des Wirts1,2.
In-vitro-Exposition von angeborenen Zellen des Immunsystems an LPS führt zu Veränderungen in der Expression mehrerer Gene3. Die Verabreichung sehr kleiner Mengen von LPS bei gesunden menschlichen Probanden löst die Kaskade einer akuten systemischen Entzündung aus, während Sepsis und septischer Schock mit höheren Endotoxinkonzentrationen4,5auftreten können.
Sepsis ist ein lebensbedrohlicher Zustand, der, wenn er nicht sofort erkannt wird, zu Multiorganversagen und Tod führen kann. Septische Patienten müssen rechtzeitig behandelt werden, mit aggressiver Reanimation, einer adäquaten Antibiotikatherapie, einer optimalen Quellcodeverwaltung und prompten Organunterstützungsstrategien. Die Diagnose der Ätiologie der Sepsis basiert in erster Linie auf klinischer Erkennung und kulturbasiertem Pathogennachweis6. Die Ergebnisse mikrobieller Kulturen können jedoch bis zu 48 h dauern und sind in bis zu 30% der Fälle7nicht schlüssig. Frühzeitige Identifizierung und Intervention können zu besseren Patientenergebnissen führen. Bei Patienten, bei denen eine Sepsis vermutet wird, werden Entscheidungen oft auf der Grundlage physiologischer und biochemischer Parameter getroffen, ohne dass ein klares Anzeichen für Endotoxämie vorliegt.
Die Messung der Endotoxinaktivität (EA) kann mittels eines kommerziellen Assays (siehe Materialtabelle)im Vollblut ermittelt werden. Es kann als Biomarker der systemischen Endotoxämie für die frühe Schichtung der Krankheitschwere verwendet werden, insbesondere bei Patienten mit Risiko für die Entwicklung septischen Schocks8. Der Test wurde verwendet, um Polymyxin B Hämoperfusionstherapie in einer kürzlich veröffentlichten doppelblinden randomisierten kontrollierten klinischen Studie bei Patienten mit septischem Schock9zu führen. Bei kritisch kranken Patienten zeigte die MEDIC-Studie, dass erhöhte EA-Spiegel mit multipler Organdysfunktion, Intensivstation (ICU) Aufenthaltsdauer und Mortalität10in Verbindung gebracht werden.
Verschiedene Assays wurden entwickelt, um Endotoxin zu detektieren. Der Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assay, entweder als Gel-Clot, trübungsrisch oder chromogener Test, wurde bisher am häufigsten für die Schätzung von Serumendotoxin angenommen. Es basiert auf der Fähigkeit von Endotoxin, die Gerinnung der Hämolymphe der Hufeisenkrabbe Limulus polyphemuszu induzieren. Dieser Test hat jedoch einige Einschränkungen in Bezug auf die Spezifität. Insbesondere kann es auch durch andere mikrobielle Produkte als Endotoxin aktiviert werden, wie z. B. Komponenten der Pilzzellwand, und es kann durch verschiedene menschliche Plasmaproteine gehemmt werden11.
Während des letzten Jahrzehnts wurde die Messung von EA als Biomarker der zirkulierenden Endotoxämie entwickelt und validiert. Im Vergleich zum LAL-Test ist EA im klinischen Umfeld schneller und einfacher zu implementieren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass es genauer als LAL im Vollblut ist, mit erhöhter Empfindlichkeit und Spezifität, sowohl in vitro als auch in vivo12.
Trotz seiner anfänglichen Implementierung als frühes diagnostisches Werkzeug zur schnellen Identifizierung von GN-Bakterien als Sepsis-Erreger wurde der EA-Spiegel auch als Biomarker für die Schwere der Erkrankung untersucht. In diesem Zusammenhang hat sich gezeigt, dass es besonders nützlich ist, den Hypoperfusionszustand aufgrund anhaltender kritischer Erkrankungen wie septischem Schock oder postkardialem Stillstandssyndrom13zu bewerten. In jüngerer Zeit, seit der Entwicklung von Hämopurifikifikationssystemen, wurde auch ein positives EA-Ergebnis als Screening-Tool vorgeschlagen, um potenzielle Kandidaten für eine solche Therapie genau zu identifizieren14. Kürzlich haben wir eine beobachtungsretrospektive Studie über die Prävalenz und klinische Signifikanz von frühen hohen EA-Spiegeln bei 107 Patienten mit septischem Schock durchgeführt. Im Einklang mit anderen jüngsten Ergebnissen fanden wir heraus, dass EA ein vielversprechender Marker für die Schwere der Erkrankung bei Patienten mit septischem Schock15ist.
Das Ziel des vorliegenden Manuskripts ist es, die Methode zu beschreiben, um den EA-Assay durchzuführen, entweder am Krankenbett oder im Labor, und seine mögliche Verwendung in einem repräsentativen Szenario eines septischen Schocks zu beschreiben. Diese Technik kann LPS-Aktivität erkennen, indem sie den verbesserten oxidativen Ausbruch in Neutrophilen nach ihrer Grundierung durch Komplexe eines Anti-Endotoxin-Antikörpers und LPS misst. Der erhöhte Atemausbruch wird von einem Chemiluminometer nachgewiesen und die Menge des emittierten Lichts wird proportional zur Menge an Endotoxin in der Blutprobe betrachtet. Der Assay benötigt nur wenige Reagenzien, dauert ca. 30 min und verwendet so wenig wie 40 l Vollblut12.
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Protokoll
Das Protokoll wird nach institutionellen Richtlinien in Bezug auf den Umgang mit menschlichen Bioproben und nach den aktuellen Standardverfahren unseres klinischen Labors durchgeführt. Die Verwendung von EA-Daten und klinischen Informationen von getesteten Patienten folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.
1. Laborgeräte und Assay Kit-Inhalte
- Bewahren Sie das EA-Kit bei 2–8 °C auf, wenn es nicht verwendet wird.
-
Jeder EA-Test besteht aus 5 verschiedenen Rohrarten; für einen anderen Teil des Tests verwenden (siehe Abschnitt 2).
- Verwenden Sie Tube #1 (das "Control"-Rohr), um die basale Aktivität des unspezifischen oxidativen Ausbruchs der Neutrophile des Patienten in Ermangelung eines spezifischen Antikörpers zu messen.
- Verwenden Sie tube #2 (das "Sample"-Rohr), um den oxidativen Ausbruch als Reaktion auf den LPS-Antikörper-Komplex zu messen.
- Verwenden Sie Tube #3 (die "Max" Röhre), um den maximalen oxidativen Ausbruch der Neutrophile des Patienten als Reaktion auf einen Überschuss an Endotoxin zu messen.
- Verwenden Sie tube #4 (das "LPS"-Rohr) als Quelle von exogenem Endotoxin.
- Verwenden Sie Tube #5 ("Aliquot" Rohr) für die Blutspeicherung.
HINWEIS: Für jede getestete Blutprobe sind Duplikate von #1, #2 und #3 vorgesehen (die EA-Reagenzflasche und der Qualitätskontrolltest können für alle in einem Beutel enthaltenen Tests verwendet werden).
- Sammeln Sie Patientenblutproben in sterilen Röhrchen, die EDTA-Gerinnungsmittel enthalten. Bewahren Sie Blutproben bei Raumtemperatur auf, bevor Sie den EA-Test ausführen.
- Bevor Sie mit dem Test beginnen, schalten Sie das Chemiluminometer und den Inkubator-Shaker ein. Erwärmen Sie den Inkubator auf eine Temperatur von 37 °C.
- Idealerweise beginnen Sie mit der Verarbeitung der Probe innerhalb von 30 min aus der Blutentnahme.
2. Endotoxin Aktivität Assay
- Bereiten Sie die EA-Reagenzgläser für die Blutprobe jedes Patienten vor, die Sie testen müssen. Legen Sie die Rohre in Rohrträger. Entfernen Sie dann die Kappen.
- Mit Hilfe einer Combipipette, Pipette ein 1 ml Volumen des EA-Reagenz aus der Flasche in Rohre #1 (Steuerrohr), #2 (Proberohr) und #3 (Max Rohr), jeweils in doppelter Ausführung.
HINWEIS: Pipette an der Seite des Rohres, um zu vermeiden, dass die Lösung wieder nach oben spritzt. - Mischen Sie die Blutprobe des Patienten, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 20 Mal sanft invertieren. Dann Pipette 0,5 ml Patientenblut in die #4 (LPS max Tube) und Rohr #5 (Aliquot-Rohr). Wirbelrohr #4 für 10 s.
- Legen Sie die Rohrträger mit allen EA-Reagenzgläsern in den Inkubator-Shaker. Schließen Sie den Deckel und brüten Sie 10 min bei einer Temperatur von 37°C.
- Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie die Rohrträger aus dem Inkubator-Shaker. Wirbelrohr #5 (Aliquot-Rohr). Mit einer sterilen Spitze, Pipette 40 l Blut in die Röhrchen #1 und #2, in doppelter Ausführung.
- Vortex-Rohr #4 (LPS-Rohr). Mit der gleichen Pipette Spitze, Pipette 40 l Blut aus Rohr #4 in Rohr #3 (Max Rohr), in dupliziert.
- Die sechs letzten Reagenzgläser (#1, #2, #3 und entsprechende Duplikate) legen sie dann wieder in ihre Regale.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Rohre für die gleiche Zeit gewirbelt sind. - Legen Sie die Rohrträger wieder in den Brüter und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie den inkubierenden Shaker auf 100 Rpm, dann starten Sie die Bewegung für 14 min.
- Legen Sie die EA-beschriftete Chipkarte in das Chemiluminometer ein und drücken Sie den Start. Folgen Sie nach der 14 min Inkubation den Anweisungen auf dem Chemiluminometer, um die EA-Röhren in der richtigen Reihenfolge zu lesen.
- Wirbeln Sie jedes Rohr für 10 s sanft, bevor Sie es auf den Probenhalter des Chemiluminometers legen. Öffnen Sie die Probenschublade und legen Sie das #1 im Probenhalter. Schließen Sie dann die Probenschublade und warten Sie auf den RLU-Wert (Relative Light Unit).
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 für Rohr 2 und Rohr 3.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 für Duplikatrohre 1, 2 und 3.
HINWEIS: Versuchen Sie, alle Rohre für die gleiche Zeit während der Schritte 2.10–2.12 zu wirbeln. - Nachdem alle Rohre verarbeitet wurden, beachten Sie, dass die EA-Ergebnisse automatisch berechnet und gedruckt werden. Die Werte werden als EA-Einheiten ausgedrückt und stellen den Mittelwert doppelter Ermittlungen aus denselben Stichproben dar.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.13 für jede Blutprobe, die getestet werden muss.
- Nach Abschluss des Tests die restlichen Reagenzgläser und EA-Reagenzien bis zu 30 Tage bei 2–8 °C lagern.
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Ergebnisse
Ein 72-jähriger Mann wurde in die Notaufnahme (ED) eines städtischen Krankenhauses eingeliefert. Wenige Tage zuvor hatte er sich seinem Hausarzt vorgestellt und sich über das Urinieren beschwert. Eine Kurzkurstherapie mit oralem Phosphomycin wurde empfohlen. Seine Krankengeschichte umfasste Bluthochdruck, unkomplizierten Typ-2-Diabetes und gutartige Prostatahyperplasie. Zu seinen Medikamenten gehörten Enalapril, Atorvastatin, Tamsulosin und Metformin.
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Diskussion
Septischer Schock ist heute noch mit einer Sterblichkeit von bis zu 40 % verbunden, obwohl diese Rate je nach den betrachteten Berichtenvariiert 16. Die Notwendigkeit neuer und besserer Biomarker wird von den meisten Experten auf den Feldern befürwortet, um Ärzten bei der Frühdiagnose, einem besseren Management und der Prognose von Patienten mit septischem Schock zu helfen6.
Die Durchführung eines EA-Tests erfordert keine technischen Vorkenntniss...
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Offenlegungen
Die Estor SpA deckte die Kosten für die Veröffentlichungs- und Videoproduktionsgebühr der Zeitschrift. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Paolo Bragana und Lisa Mathiasen, Ph.D. für ihre Überprüfung der Assay-Protokoll-Methodik. Dario Winterton, MD, leistete umfangreiche Hilfe bei der Überprüfung des Manuskripts für Englischkenntnisse.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EAA-Bausatz | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Paket mit 20 Tests + 1 Qualitätskontrolle |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Inkubator Shaker | GRANT | ES-20 | Mini-Inkubator Shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex Instrument |
Referenzen
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