Methodenartikel

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) bei Mäusen

DOI:

10.3791/58517

⸱

23. September 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Tecnologia em Medicina Molecular (CTMM), Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine therapeutische Technik, die zur Behandlung von psychiatrischer Erkrankungen vorgeschlagen. Einem Tiermodell ist unerlässlich für das Verständnis der spezifischen biologischen Veränderungen hervorgerufen durch tDCS. Dieses Protokoll beschreibt eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode verwendet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine nicht-invasive Neuromodulation Technik als eine alternative oder ergänzende Behandlung für mehrere neuropsychiatrischen Erkrankungen vorgeschlagen. Die biologischen Wirkungen von tDCS sind nicht vollständig geklärt, teilweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von menschlichen Hirngewebe erklärt wird. Dieses Protokoll beschreibt eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode, so dass die Studie der lang andauernde biologische Wirkungen der tDCS verwendet. In diesem experimentellen Modell tDCS wechselt die kortikalen Genexpression und bietet einen herausragenden Beitrag zum Verständnis der Beweggründe für den therapeutischen Einsatz.

Einleitung

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Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine nicht-invasive, kostengünstige, therapeutische Technik, die auf neuronalen Modulation durch kontinuierliche Ströme geringer Intensität1konzentriert. Derzeit gibt es zwei Setups (anodal und cathodal) für tDCS. Während die anodal Stimulation eine aktuelle elektrische Feld zu schwach übt, um Aktionspotentiale auslösen, haben Elektrophysiologie Studien gezeigt, dass diese Methode Änderungen in Synaptische Plastizität2erzeugt. Beispielsweise zeigt Beweise, dass tDCS Potenzierung (LTP) Langzeiteffekte wie erhöhte Peak Amplitude der exzitatorischen postsynaptischen Potenziale3,4 und Modulation der kortikale Erregbarkeit5induziert.

Im Gegensatz dazu induziert cathodal Stimulation Hemmung, wodurch Membran Hyperpolarisation6. Eine Hypothese für diesen Mechanismus basiert auf den physiologischen Erkenntnissen, wo tDCS um zu modulieren, Aktionspotential-Frequenz und Dauer in den neuronalen Körper3beschrieben wird. Vor allem ist dieser Effekt nicht direkt Aktionspotentiale, evozieren, obwohl es kann die Depolarisation Schwelle zu verlagern und erleichtern oder behindern neuronale feuern7. Diese gegensätzlichen Wirkungen wurden bisher nachgewiesen. Zum Beispiel produziert anodal und cathodal Stimulation gegenläufige Effekte konditionierte Antworten registriert über Elektromyographie Aktivität in Kaninchen8. Jedoch haben Studien auch gezeigt, dass längere anodal Stimulationssitzungen Erregbarkeit verringern können, während steigende cathodal Strömungen zu Erregbarkeit, präsentieren sich gegensätzliche Effekte3führen kann.

Anodal und cathodal Reize aggregieren die Verwendung von Elektrodenpaare. Beispielsweise wird in anodal Stimulation, die "aktiv" oder "Anode" Elektrode platziert, über die Region des Gehirns moduliert werden, während die "Referenz" oder "Kathode" Elektrode über einer Region befindet sich wo die Wirkung des Stromes angenommen wird, unbedeutend9. In der cathodal Stimulation Elektrode Disposition invertiert. Die Intensität der Stimulation für effektive tDCS hängt von der Stromstärke und Elektrode Dimensionen, betreffen das elektrische Feld anders10. In die meisten veröffentlichten Studien, ist die durchschnittliche Stromstärke zwischen 0,10 bis 2,0 mA und 0,1 mA bis 0,8 mA für Menschen und Mäusen, bzw.6,11. Obwohl die elektrodengröße 35 cm2 in der Regel bei Menschen verwendet wird, gibt es kein richtiges Verständnis bezüglich Elektrode Dimensionen für Nagetiere und eine gründlichere Untersuchung ist benötigten6.

tDCS wurde in klinischen Studien mit dem Versuch des bietet einer alternativen oder ergänzenden Behandlung für verschiedene neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen11 wie Epilepsie12, bipolare Störung13, Schlaganfall5 vorgeschlagen , major Depression14, Alzheimer-Krankheit15, Multiple Sklerose16 und der Parkinson-Krankheit17. Trotz der zunehmenden Interesse an tDCS und seine Verwendung in klinischen Studien, detaillierte zelluläre und molekulare evozierten Veränderungen im Hirngewebe, kurze und lang anhaltende Effekte sowie Verhaltens Ergebnisse, sind noch tiefer werden,18, untersucht 19. da ein direkter menschlichen Ansatz gründlich studieren tDCS nicht vertretbar ist, kann die Verwendung von einem Tiermodell tDCS bieten wertvolle Einblicke in die zellulären und molekularen Ereignisse zugrunde liegen die therapeutischen Mechanismen der tDCS aufgrund der Zugänglichkeit zu den des Tieres Hirngewebe.

Verfügbaren Daten beschränkt sich bezüglich tDCS Modelle bei Mäusen. Die meisten gemeldeten Modelle verwendet verschiedene implantierenden Layouts, Elektrode Abmessungen und Materialien. Z. B. Winkler Et al. (2017) implantiert die Kopf Elektrode (Ag/AgCl, 4 mm Durchmesser) mit Kochsalzlösung gefüllt und an den Schädel mit Acryl Zement und Schrauben20befestigt. Anders als bei unseren Ansatz, war ihre Brust-Elektrode implantiert (Platin, 20 x 1,5 mm). Nasehi Et al. (2017) verwendet ein Verfahren sehr ähnlich wie bei uns, obwohl die thorakale Elektrode aus einer Kochsalzlösung getränkten Schwamm (Kohlenstoff gefüllt, 9,5 cm2)21war. Eine weitere Studie implantiert beide Elektroden in den Kopf des Tieres, die durch die Verwendung von fester Platten und bedeckt den Kopf des Tieres mit einem Hydrogel Dirigent22erreicht wurde. Hier beschreiben wir eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode durch einfache chirurgische Verfahren und tDCS Setup (Abbildung 1) verwendet.

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Protokoll

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Männlichen Erwachsenen einzeln untergebracht (8-12 Wochen) C57BL/6 Mäusen wurden in diesem Experiment verwendet. Tiere erhalten Sorgfalt vor, während und nach der experimentellen Verfahren mit Nahrung und Wasser ad libitum. Alle Verfahren wurden von der tierischen Ethikkommission vom föderalen Universität von Minas Gerais genehmigt (Protokoll Nr. 59/2014).

(1) Platzierung der Elektrode

  1. Sedierende und fixieren das Tier auf der stereotaktischen Apparat
    1. Sterilisieren Sie alle notwendigen chirurgischen Instrumente.
      Hinweis. Chirurgische Instrumente wurden für 3 Minuten bei 440 ° c sterilisiert. Wattestäbchen wurden bei 20 Psi (Pfund pro Quadratzoll) bei 121 ° C für 20 min autoklaviert.
    2. Anpassen des thermischen Plattform-Controllers auf 37 ° C.
    3. Wiegen Sie das Tier und berechnen Sie die entsprechende Dosis für Anästhesie Induktion zu. Verwenden Sie eine Mischung von Ketamin und Xylazin bei einer Dosis von 100 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin, intraperitoneal gegeben (Nadelstärke, 31 G). Das Tier sollte innerhalb von 2 bis 3 Minuten einschlafen.
    4. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer oder Rasierklinge unten der Operationsstelle rasiert.
    5. Ort des Tieres auf der stereotaktischen Apparat über die vorgewärmten Heizplatte.
    6. Halten Sie den Kopf des Tieres und stecken Sie die Spitze Ohr Bars in aller Ohren des Tieres, der stereotaktischen Plattform zu befestigen.
    7. Stellen Sie sicher, gibt es keine Kopf Querverschub und kleine vertikale Bewegung nach durch Verlagerung langsam den Kopf des Tieres Positionierung.
    8. Sanft gleiten Sie die Anästhesie-Maske über die Maus Nase und durch Anziehen der Schraubenkopfes befestigen.
    9. Legen Sie die Isofluran auf 1 % mit 1,0 L/min O2.
    10. Augen des Tieres zu verhindern Hornhaut Austrocknen während der Operation zuweisen Sie Augensalbe.
  2. Befestigen das Implantat auf den Kopf des Tieres
    1. Verwenden Sie die Wattestäbchen an der Operationsstelle mit drei wechselnden Peelings von Povidon-Jod (oder 2 % Chlorhexidin) vorbereiten und 70 % Ethanol.
    2. Verwenden Sie ein paar Pinzette, um Anästhesie Tiefe zu überprüfen, indem Sie leicht zusammendrücken des Tieres Zehen und Überprüfung des Verlust des Tieres Pedal Rückzug (Zehe Prise) Reflex.
    3. Machen Sie einen Einschnitt ca. 3 mm posterior des Tieres Ohr Linie und halten Sie an das Auge. Die Schnitt-Website muss ca. 1 cm in der Länge zu groß genug, um das Implantat zu erhalten.
    4. Kratzen Sie sanft die Schädel mit einem Knochen Schaber zur Verbesserung der Leim und Einhaltung zu zementieren. Tun Sie dieses Licht im Alleingang zu schaffen Mikro-Kratzer.
    5. Positionieren Sie sorgfältig chirurgische Haken, um die lose Haut pflegen ein offene OP-Feld und frei von Hindernissen wie Haut und Fell.
    6. Verwenden Sie einem sterilen Wattestäbchen zum Trocknen des Tieres Kopfhaut.
    7. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop an um der Spitze der Schädel des Tieres zu visualisieren.
    8. Legen Sie eine Nadel auf der stereotaktischen Inhaber und suchen Sie die Bregma. Positionieren Sie die Nadel direkt über den Kopf des Tieres leicht berühren die Bregma.
    9. Alle Koordinaten auf der digitalen Tracer auf NULL und dann die Nadel nach oben bringen.
    10. Befestigen Sie die tDCS Implantat auf der stereotaktischen Halter. Positionieren Sie das Implantat über den Kopf des Tieres und senken Sie es langsam auf die Region des Interesses unter Verwendung der richtigen stereotaktischen Koordinaten.
    11. Verwenden Sie eine Nadel, um 1 Tropfen (ca. 35 μL) zu verbreiten, Sekundenkleber auf das Implantat.
    12. Langsam bewegen den Halter nach unten, bis er den Schädel berührt. Achten Sie darauf, dass die implantatbasis vollständig in Kontakt mit der Oberfläche ist.
    13. Vorbereiten des chirurgischen Zements gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    14. Nach der genauen Positionierung gelten 3 dünne, gleichmäßige Schicht von Zement über den Schädel und auf den unteren Teil des Implantats. Gelten Sie Tropfen pro Tropfen mit einem Pinsel Anwendung. Schichten müssen eine Hügel-förmige Struktur für die weitere strukturelle Unterstützung des Implantats bilden.
    15. Lassen Sie das Implantat Gewinde sauber von Zement, eine glatte, freie Verbindung zuzulassen.
    16. Lassen Sie jede Schicht ca. 4 Minuten trocknen.
    17. Nach dem Trocknen entfernen Sie vorsichtig den Halter, bis es völlig losgelöst vom Implantat ist. Immer extreme Vorsicht im Umgang mit das Implantat, da es versehentlich aus der Tier-Schädel extrahiert werden kann.
  3. Veredelung, Operation und postoperative Pflege
    1. Die Haut des Tieres in der Schnitt-Site mit einer Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen-Hydrat.
    2. Mantel der Haut über der Basis des Implantats tDCS.
    3. Verwenden der Pinzette zusammen zu bringen das Gewebe und den Schnitt mit einem Rückgang der chirurgische Gewebekleber pro 0,2 cm Gewebe in der Nähe.
    4. 1-2 % Lidocain in der Schnitt-Website zu infiltrieren und zugrunde liegenden Gewebe.
    5. Die Maus mit 500 µL Laktat-Ringer Lösung subkutan Hydrat.
    6. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine vorgewärmte (37 ° C) sauber, Einzelzimmer untergebracht-Käfig.
    7. Legen Sie eine kleine Schale mit Nassfutter Pellets in den Käfig für den einfachen Zugriff auf Nahrung in den folgenden Stunden.
    8. Registrieren Sie das Gewicht des Tieres nach dem chirurgischen Eingriff.
    9. Geben Sie dem Tier Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan nach der Operation und über die nächsten 2 Tage.
    10. Überwachen Sie die Wiederherstellung des Tieres eng für mindestens 1 Woche. Zeichen der Not, wie Piloerection, mangelnde Pflege, reduzierte Fortbewegung, Wunde kratzen und Entzündungen an der Operationsstelle zu beurteilen.

(2) tDCS Setup und Stimulation

  1. tDCS Setup (siehe Abbildung 2)
    Hinweis. Stellen Sie sicher, dass die tDCS Stimulator vollständig geladen ist.
    1. Befestigen Sie die Anode und Kathode Kabel zu den tDCS-Stimulator und in der Nähe der Stimulation stellen Sie zur Verfügung zu. Befestigen Sie Pin-Typ-Elektrode an der stereotaktischen Halter.
    2. Legen Sie die thermische Plattform auf 37 ° C.
    3. Der Sauerstoff-Durchflussmesser auf die Inhalation Anästhesiesystem auf 1 L/min schalten.
    4. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Anästhesie-Induktion-Kammer.
    5. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane auf 3 %. Lassen Sie das Tier Isofluran Effekte für 4 min zu unterziehen.
    6. Während das Tier in der Induktion Kammer ist, verwenden Sie eine sterile Spritze Körperelektrode mit 0,9 % Kochsalzlösung füllen.
    7. Entfernen Sie das Tier aus der Induktion Kammer und seine Brust über die Körperelektrode.
    8. Sanft gleiten Sie die Anästhesie-Maske über die Maus Nase und befestigen. Die Isofluran-Ausgabe auf 1,5 % zu senken.
    9. Füllen Sie das Implantat und die Pin-Typ-Elektrode mit Kochsalzlösung und befestigen Sie sie vorsichtig.
    10. Zeit der Stimulation und Stromstärke einstellen.
    11. Überprüfen Sie die Kontaktqualität auf der tDCS-Stimulator. Optimaler Kontakt reicht von 7 bis 10 auf einer Skala von 1 bis 10.
  2. Stimulation
    1. Beginnen Sie die Stimulation.
    2. Beachten Sie die aktuellen Hochlauf für 30 s, um den ausgewählten Wert und Pflege selbst zu stabilisieren, zum etablierten Mal, dann am Ende der Sitzung wieder Herunterfahren.
    3. Aktivieren Sie die Schaltfläche "Schein" für Kontroll-Mäusen.
    4. Beachten Sie die aktuellen Hochlauf für 30 s auf den eingestellten Wert und dann hinunter zu 1 für den Rest der stimulationsdauer mit einer endgültigen Rampe auf den eingestellten Wert am Ende mit einer aufeinanderfolgenden Rampe nach unten.
    5. Nachdem die Stimulationssitzung abgeschlossen ist, übertragen Sie sorgfältig das Tier auf einem vorgewärmten (37 ° C) Käfig für 10 min.
      Hinweis. Tiere beginnen, nach 3 min zu wecken.
    6. Die Inhalation Anästhesiesystem ausschalten.

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Ergebnisse

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Das chirurgische Protokoll überreichte langfristige Implantatstabilität für mindestens einen Monat keine entzündlichen Signale bei angeregt Ortsbild noch andere unerwünschte Wirkung. Alle Tiere überlebten die chirurgischen Verfahren und tDCS Sessions (n = 8). In diesem Experiment wurden tDCS Implantate über die M1 und M2 Cortex (+1,0 mm anterior-posterioren und 0.0 mm seitlich, Bregma) positioniert. Eine Woche später, tDCS (n = 3-4) und Sham (n = 3) Mäuse wurden angeregt, für fünf aufeina...

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Diskussion

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In den letzten Jahren haben Neurostimulation Techniken klinischen Praxis als viel versprechende Verfahren zur Behandlung von neuropsychiatrischen Störungen23eingeben. Um die Einschränkung auferlegt durch den Mangel an Wissen über die Mechanismen der Neurostimulation zu reduzieren, haben wir hier tDCS-Maus-Modell mit einer Elektrode, die Gehirnregionen zugeordnet werden kann. Da die Elektrode chronisch implantierbare ist, ermöglicht dieses Tiermodell die Untersuchung von dauerhaften biologischen Wi...

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Danksagungen

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Wir danken Herrn Rodrigo de Souza für Hilfe bei der Aufrechterhaltung der Maus Kolonien. L.A.V.M ist CAPES postdoctoral Fellow. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Zuschuss PRONEX (FAPEMIG: APQ-00476-14).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BD Ultrafeine 50U SpritzeBD10033430026Zur intraperitonialen Injektion.
Rasierer (Philips Multigroom)Philips (Brasilien)QG3340/16Zum Trimmen der Operationsstelle.
Chirurgische Geräte
Modell 940 Stereotaktisches Instrument für Kleintiere mit digitaler AnzeigekonsoleKOPF940Für die tierchirurgische Einschränkung und Positionierung.
Modell 922 Nicht reißende Ohrbügel mit 60-Grad-SpitzeKOPF922Für die chirurgische Einschränkung und Positionierung von Tieren.
KanülenhalterKOPF1766-APFür die Implantatpositionierung.
Präzisions-Stereo-Zoom-Binokularmikroskop (III) auf GalgenstativWPIPZMIII-BSFür die Bregma-Lokalisierung und Implantatpositionierung.
Modell des Temperaturregelungssystems KOPFTCAT-2LVFür die thermische Kontrolle von Tieren.
Kalte Lichtquelle WPIWA-12633Für Brennweite
Tisch-Anästhesiesystem für Labortiere mit ScavengingVetEquip901820Für Isofluran-Verabreichung und Sicherheit.
VaporGuard Aktivkohle-AdsorptionsfilterVetEquip931401Sicherheitsmaßnahmen für das Fördersystem.
Modell 923-B Maus-Gas-Anästhesie-KopfhalterKOPF923-BFür die Restriktion von Tieren und die Verabreichung von O2 und Isofluran.
Sauerstoffregler, E-Zylinder  VetEquip901305für O2 Regulierung und Abgabe.
Sauerstoffschlauch – grün VetEquip931503Für die Verabreichung von O2 und Isofluran.
Infrarot-Sterilisator 800 º CMarconiMA1201Für die Sterilisation von Instrumenten.
Chirurgische Instrumente
Feinschere - ToughCutFine Science Tools14058-11Für den Schnitt.
Chirurgische HakenINJEX1636In House Fabricated - Wird verwendet, um die Operationsstelle von Haut und Fell zu befreien.
Standard-Pinzette oder Pinzette-Zum Greifen der Haut.
Chirurgische Verbrauchsmaterialien
Vetbond3MSC-361931Zum Schließen von Schnitten.
Zement- und Katalysator-KIT (Duralay)Reliance2OZFür die Implantatfixierung.
Sterile Wattestäbchen (autoklaviert)JnJ75UFür die Antisepsis an der Operationsstelle. 
24-Well-Platte (Gewebekulturplatte)SARSTEDT831,836Für die Zementherstellung.
Anwendung BürsteparkellS286Zum Mischen und Auftragen von Zement.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)Ceva Pharmaceutical (Brazil)P10160Für die Anästhesieeinleitung.
Ketamin (DOPALEN 10%)Ceva Pharmaceutical (Brasilien)P30101Für die Anästhesieeinleitung.
Isofluran (100%)Cristá lia (Brasilien)100MLFür die Aufrechterhaltung der Anästhesie.
Lidocain (XYLESTESIN 5%)CristalPharma-Fürdie postoperative Versorgung.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)Sanofi Aventis20MLFür die postoperative Versorgung.
Ringer's LaktatlösungSANOBIOL LAB 7898153652145Für die postoperative Versorgung.
TobraDex (Dexamethason 1 mg/g)Alcon631Zur Befeuchtung und zum Schutz der Augen.
Stimulation
Tierischer Transkranieller StimulatorSoterix Medical2100Für die aktuelle Generation.
Elektrodenhalter mit Stift (zylindrische Halterbasis)Soterix Medical2100Elektrodenhalterung (Implantat).
Stiftelektrode (Ag/AgCl)Soterix Medical2100Für die Stromzufuhr (Elektrode). 
ElektrodenkappeSoterix Medical2100Für den Schutz von Implantaten.
Körperelektrode (Ag/AgCl beschichtet)Soterix Medical2100Zur Stromabgabe (Elektrode). 
Kochsalzlösung (0,9%)FarmaX7896902206441Leitfähiges Medium für die Stromabgabe.
Standardpinzette oder Pinzette-Für die tDCS-Einrichtung.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time SystemBioRadC1000Für qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 x 1mL)BioRad1725271Für qPCR
Hartschalen-PCR-Platten PCT COM 50 p/ CFX96BioRadHSP9601Für qPCR
Microseal "B" Siegel pct c/ 100BioRadMSB1001für qPCR

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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tDCS MausmodellElektrodenimplantationkortikale Genexpressionanodale und kathodale Stimulationstereotaktischer ApparatIsofluran An sthesieKetamin Xylazin MischungApplikation von chirurgischem Zementverhaltensbiologische und molekulare Analyse

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