Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

Summary

Wir präsentieren eine Methodik zur Quantifizierung des Stärkegehalts in den Eierstock Primordia in Süßkirsche (Prunus Avium L.) während der Winterruhe, mithilfe einer Bild-Analyse-System mit histochemische Techniken kombiniert.

Abstract

Veränderungen in Stärke in kleinen Strukturen sind verbunden mit wichtigen Ereignissen während mehreren Pflanze Entwicklungsprozesse, einschließlich der reproduktiven Phase von der Bestäubung zur Befruchtung und das Einsetzen der Fruchtkörper. Jedoch sind Abweichungen in der Stärke während der Blüte Differenzierung nicht vollständig, vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung des Stärkegehalts in den besonders kleinen Strukturen der Blume Primordia bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche (Prunus Avium L.) mithilfe einer Bildanalysesystem angeschlossen an das Mikroskop, wodurch im Zusammenhang mit den Veränderungen im Stärkegehalt mit den verschiedenen Phasen der Vegetationsruhe vom Herbst bis zum Frühling. Zu diesem Zweck wird die Dormanz Blütenknospen Statusermittlung durch die Auswertung der Knospe Wachstum der Triebe, die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Winterzeit in kontrollierten Bedingungen übertragen. Für die Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia Blütenknospen sind sequentiell gesammelt, fixiert, eingebettet in Paraffinwachs, geschnitten und gefärbt mit I₂Kl (Kaliumjodid-Jod). Die Vorbereitungen sind unter dem Mikroskop beobachtet und analysiert, indem ein Bild-Analysator, der Stärke deutlich vom Hintergrund unterscheidet. Inhaltswerte Stärke erhält man durch Messung der optischen Dichte des Bildes, die die gefärbten Stärke entspricht, unter Berücksichtigung der sich aus der optischen Dichte der einzelnen Pixel als eine Schätzung des Stärkegehalts des Rahmens studierte.

Introduction

Gemäßigte waldige Stauden passen sich den Jahreszeiten durch die Modulation, ihr Wachstum und ihre Entwicklung. Während sie im Frühling und Sommer zu entwickeln, aufhören sie zu wachsen im Herbst, im Winter¹schlafend gehen. Obwohl Dormanz bei niedrigen Temperaturen im Winter überleben kann, ist chillen Voraussetzung für eine ordnungsgemäße Knospenaustrieb im Frühjahr². Die wichtigen Implikationen der Vegetationsruhe in gemäßigten Obstproduktion und Forstwirtschaft führten zu vielfältigen Bemühungen zu bestimmen und Vorhersage der Dormanz Periode³. In Obst-Baum-Spezies, empirischer Experimente Übertragung Triebe zu zwingen, Bedingungen und statistische Vorhersagen basierend auf Daten der Blüte sind aktuelle Ansätze feststellen, das Datum für das Brechen der Keimruhe, wodurch Forscher schätzen die Chillen Anforderungen für jede Sorte. So erkennen Sie die Dormanz Status basierend auf biologische Prozesse bleibt jedoch unklar³.

Blüte im gemäßigten Obstbäume wie Süßkirsche (Prunus Avium L.), tritt einmal im Jahr und dauert etwa zwei Wochen. Allerdings beginnen Blumen zu differenzieren und rund 10 Monate früher, während der vergangenen Sommer⁴zu entwickeln. Blume Primordia aufhören zu wachsen im Herbst ruhend innerhalb der Knospen im Winter zu bleiben. In dieser Zeit muss jeder Sorte eine besondere kühle Voraussetzung für richtige Blüte⁴ansammeln. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen in den Knospen im Winter Blume Primordia sind physiologisch aktiv während der Vegetationsruhe und die Anhäufung von kühlen Temperaturen wurde vor kurzem assoziiert mit der Dynamik der Stärke Anhäufung oder verringern innerhalb der Zellen von der Eierstock Primordium bietet einen neuen Ansatz für Dormanz Bestimmung⁵. Die geringe Größe und die Position des Eierstocks Primordium erfordern jedoch eine spezielle Methodik.

Stärke ist das große Speicher-Kohlenhydrat im Gehölz Arten⁶. So haben Veränderungen in Stärke auf die physiologische Aktivität der Blume Gewebe, die brauchen Kohlenhydrate zur Unterstützung ihrer Entwicklung^7,8in Verbindung gebracht. Andere wichtige Ereignisse während der reproduktiven Prozesses beziehen sich auch auf Variationen in Stärkegehalt in verschiedenen floralen Strukturen, z. B. Anthere Meiose⁹, das Wachstum der Pollenschläuche durch den Stil oder Ovulum Befruchtung¹⁰. Histochemische Techniken ermöglichen die Erkennung von Stärke in jedem bestimmten Gewebe Blume Primordia während der Vegetationsruhe. Allerdings bleibt die Schwierigkeit bei der Quantifizierung dieser Stärke, im Anschluss an ihre Muster der Akkumulation/Abnahme über die Zeit oder die Stärke zu vergleichen zwischen Gewebe, Sorten oder Jahre Inhalte zulassen. Dies ist aufgrund der kleinen Menge an Gewebe für die analytische Techniken¹¹zur Verfügung. Als Alternative ermöglicht Bildanalyse, Mikroskopie¹² verbunden die Quantifizierung der Stärke in sehr kleine Proben von pflanzlichen Gewebe¹³.

Ansätze, die Kombination von Mikroskopie und Bildanalyse wurden zur quantifizieren des Inhalts der verschiedenen Komponenten in pflanzlichen Geweben, wie Kallose¹⁴, Mikroröhrchen¹⁵, oder¹⁶, durch Messung der Größe des Bereichs gefärbt durch spezifische Stärke Flecken. Für Stärke, kann leicht erkannt werden mit Kaliumiodid-Jod (ich₂KI) Reaktion¹⁷. Diese Methode ist sehr spezifisch; Ich₂KI Plasmamembrane innerhalb der laminaren Struktur der Stärke Körner und bildet eine dunkle blaue oder rötlich-braune Farbe, abhängig von der Amylosegehalt Stärke¹⁸. Abschnitte mit ich befleckt₂KI Fleck zeigen ausreichenden Kontrast zwischen Stärke und dem Hintergrund Gewebe, so dass eine eindeutige Stärke-Erkennung und der anschließenden Quantifizierung durch die Bild-Analyse-System¹⁹. Obwohl dieser Farbstoff nicht stöchiometrischen ist, ist die Anhäufung von Jod proportional zur Länge des Stärke-Moleküls, die¹⁷stark variieren kann. So kann die Größe des verschmutzten Bereich ausgedrückt als die Anzahl der Pixel nicht genau den Inhalt der Stärke, da hohe Unterschiede im Stärkegehalt zwischen Feldern mit gefärbten Bereiche ähnlicher Größe gefunden werden konnte. Als Alternative kann der Stärkegehalt ausgewertet werden durch die Messung der optischen Dichte der gefärbten Körnchen auf schwarz / weiß Bilder von dem Mikroskop ausgewiesen in verschiedenen Geweben in Apricot^{8,13 , 19}, Avocado^10,20und Olive²¹.

Hier beschreiben wir eine Methodik, die die experimentelle Bestimmung der Dormanz Status mit der Quantifizierung der Stärkegehalt in Primordium Eierstockgewebe vom Herbst kombiniert bis zum Frühling in süßen Kirschen, bietet ein neues Tool für das Verständnis und die Vorhersage der Vegetationsruhe basierend auf der Studie der biologischen Mechanismen im Zusammenhang mit Keimruhe.

Protocol

(1) Dormanz Entschlossenheit und Pflanze Materialkollektion

1. Probieren Sie die Blütenknospen im Feld. Dormanz Studien sind Langzeitexperimente und benötigen Erwachsene groß genug Bäume Knospen zu sammeln und schießt den ganzen Winter ohne die Bäume Entwicklung im nächsten Frühjahr. Spezielle Obstgarten Management könnte je nach dem Trainingssystem erforderlich; so kann Beschneidung weniger schwerwiegend als für Produktionszwecke Obst sein.
   1. Jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austreiben, sammeln Sie und wiegen Sie 10 Blütenknospen.
   2. Beheben Sie die Blütenknospen zu, indem man sie in ein 10 mL Glasrohr mit einer Kappe und genießen Sie die Proben in einer Fixativ Lösung von Ethanol/Essigsäure Säure (3:1) für mindestens 24 Stunden bei 4 ° c Dann verwerfen Sie das Fixiermittel und fügen Sie 75 % Ethanol, großzügig um sicherzustellen, dass die Proben deckt. Die Proben können bis zur Verwendung in dieser Lösung bei 4 ° C aufbewahrt werden.
      Hinweis: Vakuum eindringen lässt sich die Luftblasen im Inneren Keim entfernen und verhindern, dass sie schweben. Dies erleichtert das Eindringen von das Fixiermittel in den Geweben, aber beschädigen die Struktur des Gewebes. Versuchen Sie es ggf. nicht zu vermeiden.
2. Probieren Sie die Triebe im Feld.
   1. Nehmen Sie jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austreiben, drei Triebe von 15-30 cm lang und 5 mm im Durchmesser, mit mindestens 10 Blütenknospen. Legen Sie sie auf Wasser getränkten Florist Schaum in einer Kammer Wachstum bei 22 ± 1 ° C mit einer 12 h Licht Photoperiode.
   2. Wählen Sie nach 10 Tagen in der Wachstums-Kammer und wiegen Sie 10 Blütenknospen aus der Triebe.
3. Bewerten der Knospe-Wachstum und den Dormanz-Status zu bestimmen. Die Abfrageperiode muss an die Gegebenheiten des Standortes angepasst werden. In den Obstgarten-Bedingungen (Zaragoza, Spanien, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W und 220 m über dem Meeresspiegel), die Probenahme der Triebe wurde vom 30. November bis Ende Februar oder Anfang März durchgeführt.
   1. Wöchentlich bewerten Sie die Reaktion der die Blütenknospen, die geeignete Wachstumsbedingungen der Kammer, von Anfang Herbst bis zum Austrieb im Frühjahr, durch den Vergleich des Gewichts der 10 Knospen aus dem Feld gepflückt.
   2. Wenn es keine Unterschiede gibt, diese Unterschiede weniger als 30 sind % der Ansicht, dass die Knospen ihre abschreckenden Anforderungen nicht erfüllt und sind Endodormant²². Wenn die Unterschiede mehr als 30 sind % der Ansicht, dass die Knospen ihre abschreckenden Anforderungen erfüllt haben und sind Ecodormant²².

2. technische Anlagen Vorbereitung des Materials für die Quantifizierung der Stärke

1. Wählen Sie etwa sechs feste Knospen aus jeder Probenahme Datum (siehe Punkt 1.1). Je nach Sorten enthält jedes Süßkirsche Blütenknospe bis zu fünf Blume Primordia.
   1. Entfernen Sie die äußere Knospenschuppen und legen Sie die Knospe auf einem Uhrmacher Glas mit 75 % Ethanol zu verhindern Austrocknung.
   2. Keim zu sezieren und mindestens eine Blume Primordium pro Bud mit Hilfe von Präzisions-Pinzetten und eine ophthalmologische Skalpell unter eine stereoskopische Mikroskop zu extrahieren. Die Blume Primordium kann in einer 10 mL Glasröhre mit 75 % Ethanol bei 4 ° C aufbewahrt werden oder sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
2. Die Proben in einer tertiären Butyl Alkohol-Serie zu entwässern.
   1. Ersetzen Sie die 75 % ige Ethanol-Lösung mit 10 mL 75 % tertiären Butyl-Alkohol (TBA) großzügig bedecken die Proben und inkubieren sie 1,5 h. Eine Pasteurpipette kann um die Lösung zu verwerfen.
   2. Wiederholen Sie Schritt 2.2.1, Hinzufügen von TBA mit steigenden Konzentrationen (85 %, 95 % und 100 % V/V; und 3 X mit reinen TBA) in einem trocknen Ofen bei 30 ° C mit Entlüftung, da reine TBA bei Raumtemperatur (< 20 ° C kristallisiert) und sehr flüchtig und giftig ist. Wenn TBA mit der Probe sprechen, würde es das Gewebe schädigen.
3. Die Proben in Paraffin¹⁸einbetten.
   1. Schmelzen Sie das Paraffin durch die Einführung der Paraffin-Perlen im trocknen Ofen bei 60 ° C mit Luftabsaugung am Vortag. Paraffin-Perlen können auch auf eine Heizplatte geschmolzen werden, aber dafür sorgen, dass das flüssige Paraffin bei 60 ° C und nicht bei einer höheren Temperatur, um Gewebeschäden zu vermeiden ist.
   2. Ersetzen Sie die TBA mit einer Mischung aus TBA und Paraffin-Öl (1:1) und inkubieren Sie für 24 h in einem trocknen Ofen bei 60 ° C. Ersetzen Sie dann die Mischung aus TBA und Paraffinöl mit reinem Paraffin schmilzt und inkubieren Sie für mindestens 6 h in einem trocknen Ofen bei 60 ° C. Wiederholen Sie es 2 X und inkubieren Sie die letzte Änderung für mindestens 4-6 d.
   3. Legen Sie jede Probe auf eine kleine Basis Metallform über eine Wärme-Oberfläche, eingebettet in Paraffinwachs und Tempo der einbettenden Kassette. Legen Sie es über eine kalte Oberfläche und entfernen Sie den Block zu, sobald das Wachs erstarrt ist.
4. Abschnitt und die Vorbereitungen rehydrieren.
   1. Bereiten Sie Haupts-Klebstoff: lösen Sie 1 g schlicht Knox Gelatine in 100 mL destilliertem Wasser bei 30 ° C; Fügen Sie 2 g Phenol lose Kristalle (C₆H₅OH) und 15 mL Glycerin. Einen Objektträger mit einer Bürste bestreichen Sie die Haupt-Kleber und Tropfen Sie einen einer 1 % igen Formaldehyd-Lösung.
   2. Abschnitt jedes Paraffin bei 10 µm in eine rotatorische Mikrotom blockieren und legen Sie in den Abschnitten auf dem Objektträger mit Haupt Klebstoff bedeckt.
   3. Legen Sie die Glas-Objektträger mit den Abschnitten über eine Wärme-Oberfläche bei 35-40 ° C bis trocken; fahren Sie die Glas-Folien zu einem Dia-Rack.
   4. Bereiten Sie die Dewax und Rehydratation Lösungen. Legen Sie 200 mL Histoclear II in drei Glas-Färbung Gerichte, einen mit Histoclear II:ethanol (1:1, V/V), eine Ethanol-Serie (100 %, 70 %, 40 % V/V), und eine endgültige waschen mit destilliertem Wasser.
   5. Wachsentfernung die Abschnitte mit drei Wäschen, jede 5 min, in Histoclear II und Histoclear II:ethanol (1:1, V/V). Platzieren Sie Folie-Rack in die Glas-Färbung Gerichte, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig die Folien bedeckt und verschieben Sie dann die Folie Rack aus einer Lösung zur nächsten.
   6. Rehydrieren die Abschnitte durch die folgende Reihe von 2 min Wäschen: eine Ethanol-Serie (100 %, 70 %, 40 % V/V) und eine endgültige waschen mit destilliertem Wasser. Schließlich trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur.
5. Färben Sie die Abschnitte¹⁸.
   1. Bereite ich₂KI Fleck: lösen Sie 2 g Kaliumjodid (KI) und 0,2 g Jod (ich₂) in 100 mL destilliertem Wasser. Geben Sie einen Tropfen frisch ich₂KI über die Abschnitte für 5 min und verwerfen Sie die überschüssige Beize mit einem Löschpapier absorbieren. Schnell fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
   2. Tropfen Sie einen kleinen eine synthetische Montage-Medien, legen Sie einen kleinen Deckglas darauf und drücken Sie fest. Sobald die Montage Medien trocknet, unter dem Hellfeld Mikroskop für eine vorläufige Einschätzung der Eierstock Stärke beobachten.
      Hinweis: Dieser Schritt ist nicht zwingend erforderlich, obwohl ein besserer Kontrast zwischen der Stärke und dem Hintergrund gewonnen wird. Wenn der Abschnitt hat mit anderen Flecken nach Stärke Quantifizierung wiederverwendet werden, platzieren Sie das Deckglas über die Tropfen Fleck und verwerfen den Überschuss mit einem Löschpapier absorbieren (siehe 2.5.1). Dann, nach Stärke Quantifizierung, waschen, das ich₂KI Fleck mit destilliertem Wasser und Stelle die Vorbereitungen Hitze bei 35-40 ° C trocknen Oberfläche.

3. Quantifizierung des Stärkegehalts

1. Kalibrieren Sie die optischen Bedingungen.
   Hinweis: Die Erfassungsebenen von Image Analyzer verwendet, um die gefärbten Stärke zu erkennen sind direkt abhängig von Lichtverhältnissen und Vergrößerung des Mikroskops; so befestigen Sie diese Bedingungen für alle Präparate ausgewertet. Anzupassen Sie die Einstellung hier vorgeschlagen, um die verfügbaren Mikroskop und Lichtverhältnissen.
   1. Passen Sie die Aperturblende um die 20 X Vergrößerung und der Helligkeit oder Intensität des Lichts.
   2. Stellen Sie sicher, dass es keine Filter auf den Filterhalter, und wählen Sie eine Hellfeld Bedingung im Mikroskop. Wählen Sie eine geeignete Vergrößerung (z.B.40 X für Süßkirsche Eierstock Primordium).
2. Steuern Sie die Bild Erwerb. Passen Sie die Kameraeinstellungen mit einem gefärbten Präparat ohne Gewebe über Bild | Erwerb | Pre-View.
   1. Beheben Sie die Helligkeit auf 50 %, der Gewinn bei 1,0 x und die Histogramm-Indikatoren der Gamma value-at-1,00 und der Kontrast bei 0 - 100, mit den Grenzen der Helligkeit Verteilung Histogramm Schlange.
   2. Aktivieren Sie die Funktion der Überbelichtung/Unterbelichtung und passen Sie die Belichtungszeit an der Grenze zur Überbelichtung.
   3. Gelten Sie die Weißabgleich-Funktion für das gesamte Bild alle Null-farbigen Komponenten des Bildes ohne jeden Farbton und Schattierung Korrektur, das komplette Bild erstelle ich eine korrigierte und homogenere Bild anzuzeigen.
3. Kalibrieren Sie die Bild-Analyse-System die Kontrollwerte der grauen Ebene (0, schwarz, 255, weiße) unterschiedlicher optischer Dichte (OD) zu erhalten, die durch die Transmission (T) Werte erhalten werden.
   1. Erwerben Sie ein Bild einer gefärbten Zubereitung ohne Gewebe, als Kontrolle weiß, und Messen Sie die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 0 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einem 100 % Transmission; so eine optische Dichte von 0, nach OD = 2 - Anmeldung T.
   2. Erwerben Sie ein Bild der gleichen Vorbereitung mit einem 4N-Filter, das reduziert die Menge an Licht 4 X und messen die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 0,6 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einer 25 % Durchlässigkeit; so eine Extinktion von 0,6 nach OD = 2 - Anmeldung T.
   3. Ein Bild der gleichen Zubereitung ohne Licht, als schwarz zu erwerben, und Messen Sie die graue Ebene der schwarz / weiß Bild über Maßnahme | Graue Maßnahme | Kalibrieren, grau | Sollwert = 1 | Maßnahme | Kalibrieren | OK. Dies entspricht einer 0 % Transmission; so eine optische Dichte von 1 nach OD = 2 - Anmeldung T.
4. Stärke zu erkennen.
   1. Erwerben Sie ein Farbbild des Feldes im TIFF-Format mit einer Auflösung von mindestens 300 Punkte pro Zoll (dpi) gemessen.
   2. Erstellen Sie ein binäres Bild entspricht der Gegend gebeizt. Die drei Farben Schwellenwerte festgelegt (Werte zwischen 0 - 255 für jeden) bis binäre Bild genau gefärbten Stärkekörner beobachtet spiegelt, über Bild | Erkennen | Wählen Sie die Schwellen von rot, blau und grün | OK. Immer wieder visuelle Vergleiche in verschiedenen Zubereitungen und Geweben zu tune up die endgültige Erfassungsebenen. Speichern Sie und verwenden Sie diese Werte für alle Vorbereitungen.
   3. Quantifizierung der Stärke. Umwandeln Sie das ursprüngliche Farbbild in ein Schwarzweißbild mit dem Bild-Analyse-System. Verwenden Sie das binäre Bild als überlagerten Maske auf der schwarz / weiß Bild über Bild | Binäre bearbeiten. Die Summe der optischen Dichte der jedes Pixel unter der Maske über Maßnahme messen | Graue Ebene | OK und dieser Wert als der Stärkegehalt im gemessenen Bereich betrachten.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 - 3.4.3 in vier Orten der Eierstock Primordia einen repräsentativen Wert des Stärkegehalts in den Eierstöcken der Blume Primordia zu erhalten.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1 - 3.4.3 und Schritt 3.4.5 in verschiedenen Blumen jeder sammeln Datum.

Results

Dormanz Studien erfordern die Festlegung des Zeitpunkts, wann die abschreckenden Voraussetzungen erfüllt sind. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen während des Winters unter Feldbedingungen (Abbildung 1A) wiederherstellen Kirschbäume nicht die Kapazität des Wachstums unter geeigneten Bedingungen, bis sie einen bestimmten Zeitraum unter niedrigen Temperaturen passieren. Die regelmäßige Übertragung der Triebe zu einer kontrollierten Bedingungen Ka...

Discussion

Dormanz in holzigen Stauden stellt deutliche Auswirkungen im Obstbau und Forstwirtschaft im Klimawandel, obwohl der biologische Prozess hinter Dormanz unklar bleibt. Dormanz Studien aus verschiedenen Blickwinkeln angegangen werden können, aber die Forschung auf der Suche nach einer biologischen Marker für die Winterruhe hat in den letzten Jahren intensiviert. Allerdings wurden die meisten Versuche, eine eindeutige Kennzeichen, wenn eine Knospe Dormanz gebrochen hat zu finden erfolglos³. Die hierin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Präzisionswaage	Sartorius	CP225D
Stereoskopisches Mikroskop	Leica Microsystems	MZ-16
Trockenofen	Memmert	U15
Paraffin-Einbettstation	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatorisches Mikrotom	Reichert-Jung	1130/Biocut
Mikrotom-Klinge	Feather	S35
Edelstahl Hellfeldmikroskop	Leica Microsystems	DM2500
Digitalkamera	Leica Microsystems	DC-300
Bildanalysesystem	Leica Microsystems	Quantiment Q550