Methodenartikel
Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.
Kinase und Pyrophosphokinase Enzyme übertragen die Gamma-Phosphat oder Beta-Gamma Pyrophosphat glyko-aus Nukleotid Triphosphat Vorstufen auf Substrate phosphorylierten Produkte zu schaffen. Die Verwendung von γ -32- P bezeichnet NTP Vorstufen ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Substrat-Auslastung und Produkt-Bildung durch Röntgen. Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Zellulose Platten ermöglicht schnelle Trennung und sensible Quantifizierung von Substrat und Produkt. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Nutzung der Dünnschichtchromatographie um die Pyrophosphokinase Aktivität einer gereinigten (p) PpGpp Synthestase assay. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der zyklische Nukleotid und Dinucleotide Synthetasen charakterisieren und eignet sich im großen und ganzen für die Charakterisierung der Aktivität jedes Enzym, das eine Nukleotid Triphosphat Bindung hydrolysiert oder überträgt einen terminal Phosphat von einem Phosphat-Spender zu einem anderen Molekül.
Kinase und Pyrophosphokinase (oder Diphospho-Kinase) Enzyme ins Substrat Moleküle Phosphate aus Nukleotid Triphosphat (NTP) Vorstufen. Die Substrate können andere Nukleotide, Aminosäuren oder Proteine, Kohlenhydrate und Lipide1gehören. Bioinformatische Analysen können manchmal ein Enzym cognate Substrat oder Substrate aufgrund der Ähnlichkeit zu gekennzeichnet Enzyme, aber experimenteller Validierung ist immer noch notwendig. Ebenso müssen die Affinität des Enzyms für ihre Substrate und die Rate, mit der es die Phosphor-Transfer Reaktion katalysiert, und die Auswirkungen der Co-Faktoren, Inhibitoren oder anderen Enzym Effektoren experimentell e....
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(1) induzierbaren Überexpression eines Proteins Histidin-markierten
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Wir präsentieren eine Methode für die Affinitätsreinigung ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium Difficile und die Beurteilung der seine enzymatische Aktivität. Abbildung 1 veranschaulicht die Proteinreinigung durch Metall Affinitätschromatographie erreicht. Die zweite Elution (E2)-Fraktion aus diese Reinigung war dialysiert und für die enzymatische Aktivität Assay verwendet. Abbildung 2 beschreibt die notwendigen Sch.......
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Hier berichten wir die Reinigung des His-Tags RSH von C. Difficile und stellen eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität mit radioaktiven Dünnschichtchromatographie. Diese Methode wurde zuvor verwendet, um die Aktivität der Diguanylate Cyclase Enzyme von C. Difficile, sowie (p) PpGpp Synthestase, Nukleotid-Cyclase, Kinase und Phosphodiesterase Enzyme aus anderen Organismen11,12 bewerten ,13,
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Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.
Diese Arbeit wurde von NIAID 1K22AI118929-01 finanziert. EBP wurde unterstützt durch einen Sommer Research Fellowship Programm Zuschuss von der Office of Research bei Old Dominion University in Norfolk, Virginia, USA.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Induzierbare Überexpression eines Histidin-markierten ProteinsPhusion-Polymerase | |||
| T4-DNA-Ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha-kompetent E. coli ( Hoher Wirkungsgrad) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Kompetente E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 Zentrifuge mit JLA 10.500 Rotor | Beckman Coulter Avanti-Mikrozentrifuge | ||
| mit D3024/D3024R Rotor | Scilogex-MaxQ | ||
| SHKE6000 Inkubator | Thermo Scientific-Ultraschallprozessor | ||
| Sonics | VC-750 | ||
| Proteinaufreinigung durch Nickel-Affinitätschromatographie | |||
| G Biosciences | 786-940/941 | ||
| Pierce Einweg-Schwerkraftsäulen, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 Dialysegerät (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophorese Cell | BioRad | 1658004 | |
| Proteinaktivitätsassay durch Dünnschichtchromatographie | |||
| Entwicklungstank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimin (PEI)-Zelluloseplatten (20 cm x 20 cm, 100 μ m Dicke) mit Polyesterträger | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml Blei, 100 μ Ci | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosin 5'-triphosphat (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosin-5'-diphosphat Dinatriumsalz (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Lagerung Phosphor Sieb | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 Phosphorimager | GE Healthcare Biowissenschaften | - |
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