In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle der Proteinbestimmung Ausdruck, Reinigung, Kristallisation und Struktur der N-terminalen Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Diamondback Moth (Plutella Xylostella).
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Methodenartikel
Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Entwicklung von potenten und effiziente Insektiziden gezielt Insekt Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) wurde von großem Interesse im Bereich der landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung. Bis heute mehrere Diamide Insektizide targeting Pest, die RyRs in den Handel gebracht worden sind, generieren, die jährlichen Umsatz von 2 Milliarden US-Dollar. Aber Verständnis für die Wirkungsweise von RyR Zielversionen Insektiziden ist begrenzt durch den Mangel an strukturellen Informationen über Insekt RyR. Dies schränkt im Gegenzug Verständnis für die Entwicklung von Insektizid Widerstand in Schädlinge. Die Diamondback Moth (DBM) ist eine verheerende Pest zerstören Kreuzblütler Kulturen weltweit, die auch berichtet wurde, Widerstand gegen Diamide Insektizide zu zeigen. Daher ist es von großer praktischer Bedeutung, neuartige Insektizide, die Ausrichtung der DBM RyR, vor allem auf eine Region, die anders als die traditionelle Diamide-Bindungsstelle zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die N-terminale Domäne von RyR von DBM strukturell zu charakterisieren. Die Röntgen-Kristallstruktur wurde gelöst durch molekulare Ersatz mit einer Auflösung von 2,84 Å, die zeigt, ein Beta-Kleeblatt Falten Motiv und eine flankierende Alpha-Helix. Dieses Protokoll kann in der Regel für den Ausdruck, Reinigung und strukturelle Charakterisierung von anderen Domänen oder Proteine angepasst werden.
Einleitung
Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) sind spezifische Ionenkanäle, die die Permeation von Ca2 + -Ionen über den sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membranen in den Muskelzellen zu vermitteln. Daher spielen sie eine wichtige Rolle in der Erregung Kontraktion Kupplung Prozess. In seiner funktionalen Form RyR montiert wie ein Homo-Tetramer mit einer Molekülmasse von > 2 MDa mit jeder Untereinheit, bestehend aus ~ 5000 Aminosäurereste. Bei Säugetieren, gibt es drei Isoformen: RyR1 - Skelettmuskulatur Typ, Herzmuskel Typ RyR2- und RyR3-ubiquitär in verschiedenen Geweben1ausgedrückt.
Bei Insekten gibt es nur eine Art von R....
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Protokoll
1. Gen-Klonieren, Proteinexpression und Reinigung
- PCR DNA entspricht Protein des Interesses zu verstärken (1-205 Rückstände von DBM RyR, Genbank gem. keine. AFW97408) und Klon in Haustier-28a-HMT Vektor durch Ligation-unabhängige Klonen (LIC)25. Dieser Vektor enthält ein Histidin-Tag, MBP-Tag und ein TEV Protease-Spaltstelle am N-Terminus15.
- Entwerfen Sie LIC Primer für die Amplifikation des Zielgens mit LIC-kompatiblen 5' Erweiterungen:
Nach vorne LIC-Primer:
5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
Rückwärts LIC-Primer:
5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'<....
- Entwerfen Sie LIC Primer für die Amplifikation des Zielgens mit LIC-kompatiblen 5' Erweiterungen:
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Ergebnisse
Reinigung
Die N-terminale Domäne des DBM RyR wurde als ein Fusionsprotein mit einem Hexahistidine Tag, ein MBP-Tag und ein TEV Protease-Spaltstelle ausgedrückt. Wir folgten eine fünf-Stufen-Reinigung-Strategie um ein sehr reines Protein, geeignet für Kristallisation Zweck zu erhalten. Anfangs war Fusionsproteins aus der löslichen Fraktion von Zelle lysate durch Ni-NTA-Spalte (HisTrap HP) gereinigt. Als nächstes Fusionsproteins TEV .......
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Diskussion
In diesem Artikel beschreiben wir das Verfahren um rekombinant express, reinigen, kristallisieren und bestimmen die Struktur der DBM RyR NTD. Für die Kristallisation ist eine entscheidende Voraussetzung um Proteine mit hohen Löslichkeit, Reinheit und Homogenität zu erhalten. In unserem Protokoll haben wir pET-28a-HMT Vektor verwenden, denn es enthält ein Hexahistidine Tag und MBP-Tag, die genutzt werden könnte, für Reinigung, eine höhere Falte Reinheit zu erhalten. Darüber hinaus die MBP-Tag hilft in der Löslichkeit des .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Finanzierung dieser Forschung von zur Verfügung gestellt wurde: National Key Research und Development-Programm aus China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National Nature Science Foundation of China (31320103922, 31230061) und Projekt des nationalen Grundlagenforschung (973) Programm der China (2015CB856500, 2015CB856504). Wir sind dankbar für das Personal auf das Strahlrohr BL17U1 bei Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
E. coli
BL21 (DE3) Stamm Novagen 69450-3CN HisTrapHP-Säule (5 mL)GE Healthcare 45-000-325 Amylose-Harzsäule New England Biolabs
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pET-28a-HMT-Vektor | Dieser modifizierte pET-Vektor enthält einen Hexahistidin-Tag, ein MBP-Fusionsprotein und eine TEV-Protease-Spaltstelle am N-Terminus (Lobo und Van Petegem, 2009) | ||
| E8021S | |||
| Q Sepharose Hochleistungssäule | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon Konzentratoren (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 Gel-Filtrationssäule | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automatisiertes Liquid-Handling-Robotersystem | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop - 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck Dewar Ladewerkzeug | Molekular Abmessungen | MD7-607 | |
| Nanotropfen | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal Inkubator | Molekulare Abmessungen | MD5-605 | |
| Röntgendiffraktor | Rigaku | FRX | |
| PCR-Maschine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid Mini-Prep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel-Extraktion Kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI-Restriktionsendonuklease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA-Polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-Mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Zentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Proteinaufreinigungssystem | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light Mikroskop | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt Kristallfarbstoff | Hampton Research | HR4-710 | |
| Elektrophoresegerät | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Inkubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index Kristallsieb | Hampton Research | HR2-144 | |
| Struktur Kristallsieb | Molekulare Abmessungen | MD1-01 | |
| ProPlex Kristallsieb | Molekulare Abmessungen | MD1-38 | |
| PACT Premier Kristallsieb | Molekulare Abmessungen | MD1-29 | |
| JCSG-plus Kristallsieb | Molekular Abmessungen | MD1-37 |
Referenzen
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isola....
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Nachdrucke und Genehmigungen
