Screening Cotton Genotypes auf Reniform Nematode Resistenz

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für das schnelle zerstörungsfreie Screening von Baumwollgenotypen auf reniforme Nematodenresistenz vorgelegt. Das Protokoll beinhaltet die visuelle Untersuchung der Wurzeln von nematodeninfizierten Baumwollsämlingen, um die Infektionsreaktion zu bestimmen. Der vegetative Trieb aus jeder Pflanze wird dann vermehrt, um Pflanzen für die Saatgutproduktion zurückzugewinnen.

Zusammenfassung

Ein schnelles zerstörungsfreies Reniformnematode (Rotylenchulus reniformis) Screening-Protokoll ist für die Entwicklung von resistenten Baumwolle (Gossypium hirsutum) Sorten erforderlich, um das Nematodenmanagement zu verbessern. Die meisten Protokolle beinhalten die Extraktion von vermiformen Nematoden oder Eiern aus dem Baumwollwurzelsystem oder Blumenerde, um die Populationsdichte oder Fortpflanzungsrate zu bestimmen. Diese Ansätze sind in der Regel zeitaufwändig, wobei eine kleine Anzahl von Genotypen bewertet wird. Hier wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem das Wurzelsystem visuell auf Eine Nematodeninfektion untersucht wird. Das Protokoll beinhaltet die Impfung von Baumwollsämling 7 Tage nach der Pflanzung mit vermiformenen Nematoden und die Bestimmung der Anzahl der Weibchen, die 28 Tage nach der Impfung am Wurzelsystem befestigt sind. Die Daten werden ausgedrückt als die Anzahl der Weibchen pro Gramm frischer Wurzelgewichte, um sich an die Variation des Wurzelwachstums anzupassen. Das Protokoll bietet eine ausgezeichnete Methode zur Bewertung der Wirtspflanzenresistenz im Zusammenhang mit der Fähigkeit des Nematoden, eine Infektionsstelle zu etablieren; Resistenzen, die die Nematodenreproduktion behindern, werden jedoch nicht beurteilt. Wie bei anderen Screening-Protokollen wird häufig Variation bei Nematodeninfektionen zwischen einzelnen Genotypen innerhalb und zwischen Experimenten beobachtet. Die Daten werden dargestellt, um den Variationsumfang zu veranschaulichen, der mit dem Protokoll beobachtet wurde. Um diese Variation anzupassen, werden Kontrollgenotypen in Experimente einbezogen. Dennoch bietet das Protokoll eine einfache und schnelle Methode zur Bewertung der Wirtspflanzenresistenz. Das Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um resistente Beitritte aus dem Gzu identifizieren. Arboreum-Keimplasma-Sammlung und bewerten Segregierenpopulationen von mehr als 300 Individuen, um die Genetik der Resistenz zu bestimmen. Es wurde auch eine vegetative Vermehrungsmethode zur Rückgewinnung von Pflanzen für die Resistenzzüchtung entwickelt. Nach der Entfernung des Wurzelsystems zur Nematodenauswertung wird der vegetative Trieb nachgepflanzt, um die Entwicklung eines neuen Wurzelsystems zu ermöglichen. Mehr als 95% der Triebe entwickeln in der Regel ein neues Wurzelsystem mit Pflanzen, die reife reife werden.

Einleitung

Rotylenchulus reniformis (Linford und Oliveira), gemeinhin als Reniformnematode bezeichnet, ist eine der wichtigsten parasitären Nematodenarten, die in Böden des Südostens der Vereinigten Staaten vorkommen^1,2,3. Der Nematoden ist ein obligater, sessesshafter Semiendosit, der eine Wirtspflanze benötigt, um ihren Lebenszyklus abzuschließen^2,4. Vermiforme präadulte weibliche Nematoden dringen in das Wirtswurzelsystem ein, um eine Futterstelle in der Stele^2,3zu errichten. Wenn sich die Nematode ernährt und reift, schwillt der hintere Teil, der außerhalb der Wirtswurzel verbleibt, bei der Eiproduktion an und bildet eine charakteristische Nierenform (Abbildung 1). Rotylenchulus reniformis ist in der Lage, sich vom Wurzelsystem von mehr als 300 Pflanzenarten, einschließlich Baumwolle⁴, zu ernähren. Upland-Baumwolle(Gossypium hirsutum L.) wird im Südosten der Vereinigten Staaten weit verbreitet angebaut, aber das Fehlen von R. reniformis resistente Sorten behindern Nematodenmanagement^2,3. Managementstrategien wie Nematizidbehandlung und Rotation mit Nicht-Wirtspflanzenarten wurden verwendet, um den Boden Rzu reduzieren. reniformis Populationsdichten^5,6, aber Samen Baumwolle Ertragsverluste können in der Regel von 1 bis 5%²reichen. Symptome von R. Reniformis-Infektion kann Pflanzenstunting, unterdrücktes Wurzelwachstum, Ernährungsmängel, Obstabtreibung und verzögerte Reife²umfassen. Jedoch, Symptome können nicht aufgrund der Gleichförmigkeit der Symptome auf dem Feld offensichtlich sein; daher Ansätze zur Bewertung von R. Reniformis-Infektionen sind erforderlich, um resistente Baumwollsorten im Hochland zu identifizieren und zu entwickeln. Bewertung von R. reniformis Resistenz in Baumwolle gilt als schwierig⁷, weil das infizierte Wurzelsystem normal erscheinen kann, obwohl die Pflanze Symptome einer Infektion zeigen kann⁸.

Für die Identifizierung von Rist ein effektives Nematoden-Screening-Protokoll erforderlich. reniformis resistente Beitritte aus der Baumwollkeimplasmasammlung und zur Bestimmung der Resistenzgenetik für diese Beitritte. Ein solches Protokoll wird bei der Übertragung von Resistenzgenen auf Hochlandbaumwolle helfen. Zur Beurteilung von Rwurden verschiedene Bioassay-Methoden verwendet. reniformis Infektion in Baumwolle^{8,9,10,11,12,13,14,15}. Im Allgemeinen wurden zwei Hauptansätze für die Identifizierung von Rverwendet. reniformis resistente Baumwollgenotypen. Der am häufigsten verwendete Ansatz beinhaltet die Extraktion von Eiern und/oder vermiformenen Nematoden aus infizierten Pflanzen oder Böden^{8,11,12,14,15}. Die allgemeine Methodik für diesen Ansatz beinhaltet das Anpflanzen von Samen für die einzelnen Baumwollgenotypen in separaten Töpfen, so dass sich die Sämlinge für 7 bis 14 Tage entwickeln können, indem die Sämlinge durch Zugabe einer Mischung aus vermiformen Stufen von Rimpfen. Reniformis in den Boden, und so dass die Nematoden das Wurzelsystem für 30 bis 60 Tage infizieren. Als nächstes werden vermiforme Nematoden und/oder Eier aus dem infizierten Wurzelsystem jeder Pflanze oder aus dem Blumenboden extrahiert. Die Anzahl der extrahierten Nematoden oder Eier wird dann bestimmt, um die Populationsdichte und Fortpflanzungsrate zu schätzen, die mit Kontrollgenotypen verglichen werden, um resistente Genotypen zu identifizieren.

Ein alternativer Ansatz, wie hier beschrieben, beinhaltet mikroskopisch die Untersuchung des Baumwollwurzelsystems, das mit Nematoden infiziert wurde, um die Anzahl der weiblichen Nematoden zu bestimmen, die die Wurzeln parasitieren^10,16. Ähnlich wie bei anderen Ansätzen werden Baumwollgenotypen in separaten Töpfen gepflanzt und ca. 7 Tage nach der Pflanzung mit vermiforderen Nematoden geimpft. Innerhalb von 30 Tagen nach der Impfung wird das Wurzelsystem von einzelnen Pflanzen entfernt und der Boden von den Wurzeln abgeführt. Als nächstes werden die Amematoden, die am Wurzelsystem befestigt sind, mit roter Lebensmittelfarbe¹⁷gefärbt, und Die Wurzeln werden mikroskopisch untersucht, um die Anzahl der Infektionsstellen mit resistenten Baumwollgenotypen zu bestimmen (identifiziert basierend auf der Anzahl der Nematoden pro Gramm Wurzel) im Vergleich zu einer anfälligen Kontrolle¹⁶. Dieser zweite Ansatz hat den Vorteil eines erhöhten Durchsatzes, indem er die Anzahl der für die Bewertung erforderlichen Tage reduziert und die Anzahl der einzelnen Genotypen erhöht, die in einem einzigen Experiment bewertet werden. Screening-Methoden, die Bevölkerungsdichte oder Reproduktionsrate bewerten, sind oft zeitaufwändiger als jene, die auf visuellen Beobachtungen von Infektionszeichen basieren⁷. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass die Widerstandsfähigkeit von Wirtspflanzen, die die Nematodenvermehrung gemäß der Eiproduktion behindert, nicht bewertet wird¹³.

Screening-Protokolle für R. Reniformis-Widerstand zerstört oft das Wurzelsystem während der Auswertung⁷ und beinhaltet, dass der vegetative Trieb verworfen wird. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine Methode der vegetativen Vermehrung entwickelt, um die Rückgewinnung von Pflanzen für die Saatgutproduktion zu ermöglichen¹⁸. Nach dem Entfernen des Wurzelsystems zur Nematodenbewertung wird der vegetative Trieb in Blumenerde gepflanzt, damit das Wurzelsystem nachwachsen kann. Diese Methode hat breite Anwendungen für die meisten R. reniformis Screening-Protokolle. Eine einfache und schnelle Methode der vegetativen Vermehrung ist von entscheidender Bedeutung für die Züchtung R. reniformis resistente Hochland-Baumwollsorten, bei denen die Rückgewinnung der Nachkommenschaft erforderlich ist, um resistente Genotypen auf die nächste Generation zu bringen.

Für das großflächige Screening von Baumwollgenotypen auf Reniformnematodenresistenz wird ein Protokoll vorgelegt. Ziel ist es, eine einfache und schnelle zerstörungsfreie Screening-Methode zur Bewertung von Baumwollzuchtpopulationen auf Nematodenresistenz zu entwickeln, um bei der Züchtung resistenter Hochland-Baumwollsorten zu helfen. Mit diesem Protokoll werden die Daten in der Regel innerhalb von 35 Tagen gewonnen, wobei mehr als 300 Genotypen in einem einzigen Experiment ausgewertet werden. Die Daten werden für resistente und anfällige Genotypen dargestellt, um die mit diesen Methoden häufig beobachtete Variation zu veranschaulichen.

Protokoll

1. Aufrechterhaltung einer Quelle von R. reniformis Inokulums

1. Füllen Sie Terrakotta-Tontöpfe (15 cm Durchmesser, 13,5 cm Höhe) mit einer dampfpasteurisierten Mischung aus 1-teiligem Sandund und 2-teiligem Sand. Eine anfällige Tomate (Solanum lycopersicon) sorte in jedem Topf pflanzen und die Töpfe in ein Gewächshaus geben.
   HINWEIS: Andere anfällige Pflanzensorten wie Baumwolle können anstelle von Tomaten verwendet werden.
2. Die Tomatenpflanzen mit vermiformen reniformen Nematoden impfen (siehe Schritt 3.3). Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei einer Temperatur von ca. 28 °C.

2. Pflanzung Baumwolle Genotypen für R. reniformis Widerstandsbewertung

1. Bereiten Sie den Boden vor, indem Sie 2-teiligen feinen Sand mit 1-teiligem Sandlehm kombinieren, der vom Feld gesammelt wurde.
2. Dampf pasteurisieren die Bodenmischung, um sicherzustellen, dass der Boden frei von Nematoden und bodenbedingten Pflanzenpathogenen ist.
3. Fügen Sie die Bodenmischung zu konischen Kunststofftöpfen (4 cm Durchmesser, 21 cm in der Höhe) hinzu. Bevor Sie die Töpfe füllen, legen Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden des Topfes, um Bodenverlust zu verhindern. Füllen Sie die Töpfe teilweise mit Erde ca. 2 cm von der Spitze.
4. Bereiten Sie einen Plastikpfahl für jeden Topf vor, um den zu pflanzenden Genotyp zu bezeichnen.
5. Pflanzensamen der zur Bewertung ausgewählten Baumwollgenotypen.
   1. Pflanzen Sie einen einzelnen Samen in jeden Topf für die Bewertung der Segregierenden Populationen, in denen jeder Samen einen einzigartigen Genotyp darstellt.
   2. Für Baumwollsorten oder Keimplasma-Beitritte 2 bis 3 Samen in einem einzigen Topf pflanzen, um die Keimung von mindestens einer Pflanze mit den anderen Sämlingen, die vor der Nematodenimpfung aus den Töpfen entfernt werden, zu versichern.
      Hinweis: Alternativ können Samen vor der Pflanzung für 24 bis 72 h gekeimt werden, um die Anzahl der Töpfe mit nicht lebensfähigen Samen zu minimieren.
6. Pflanzensamen ausgewählter resistenter und anfälliger Kontrollgenotypen.
   Anmerkung: Kontrollgenotypen werden 5 bis 10 Mal repliziert, um natürliche Variationen zu bewerten, die der Screening-Methodik innewohnen.
7. Füllen Sie Töpfe mit zusätzlichem Boden, um das Saatgut in jedem Topf zu bedecken.
8. Legen Sie die Töpfe in die Wachstumskammer. Halten Sie eine konstante Temperatur von 28 °C, eine Umgebungslufttemperatur, für die Wachstumskammer. Bieten Sie künstliche Beleuchtung mit einer Mischung aus Leuchtstoff- und Glühlampen mit einer 16-Stunden-Fotoperiode.
9. Legen Sie Wasserstrahler in jeden Topf und gießen Sie die Töpfe zweimal täglich mit einem automatischen Bewässerungssystem. Passen Sie das Bewässerungssystem an, um zusätzliches Wasser zu liefern, wenn die Pflanze wächst.

3. Nematode-Inokulation von Baumwollpflanzen und Vorbereitung von Wurzelproben

1. Extrahieren Sie vermiforme reniforme Nematoden, die auf anfälligen Tomatenpflanzen gehalten werden (siehe Schritt 1) mit Elutriation¹⁹ und Zentrifugalflotation²⁰ Methoden am Tag vor der Impfung. Bewahren Sie die extrahierten Nematoden bei 4 °C auf.
   HINWEIS: Die Baermann-Trichterextraktion²¹ ist eine alternative Methode zur Nematodenextraktion.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der extrahierten Nematoden, indem Sie die Anzahl der Nematoden in einer 100-L-Unterstichprobe zählen, und bereiten Sie eine Suspension von 1.000 Nematoden/ml im Leitungswasser für Impfungen vor.
3. Die Baumwollsämlinge 7 d nach dem Pflanzen mit der Nematodensuspension impfen. Erstellen Sie eine kleine Depression im Boden neben der Pflanze, und Pipette 1 ml der reniformen Nematodensuspension in die Depression.
4. Entfernen Sie Pflanzen aus den Töpfen 28 d nach der Impfung für die Nematodenbewertung.
   HINWEIS: In diesem Stadium sind pflanzen etwa 15 cm hoch mit 4 bis 6 voll expandierten Blättern.
   1. Entfernen Sie die meisten der vollständig expandierten Blätter aus den Pflanzen mit einer Schere, bevor Sie die Pflanzen aus den Töpfen entfernen.
   2. Um Pflanzen aus den Töpfen zu entfernen, drücken Sie den Topf und schieben Sie den Boden in die Hand.
   3. Entfernen Sie den Boden vorsichtig von den Wurzeln, indem Sie das Wurzelsystem in Leitungswasser in einem 10 L Behälter rühren. Spülen Sie das Wurzelsystem kurz in einem Behälter mit sauberem Leitungswasser ab.
   4. Entfernen Sie das Wurzelsystem aus der Pflanze ca. 1 cm unter der Bodenlinie mit einer Schere.
5. Legen Sie das Wurzelsystem in einen 120 ml Kunststoff, nicht-sterilen Einweg-Probenbehälter zusammen mit dem Kunststoffpfahl aus dem Topf zur Identifizierung verwendet.
   HINWEIS: Mehrere Proben werden verarbeitet, bevor sie mit Schritt 3.7 fortfahren. Fahren Sie mit Schritt 4 für die vegetative Vermehrung des Pflanzentriebs fort.
6. Bereiten Sie eine 12,5% (v/v) Lösung der roten Lebensmittelfärbung¹⁷ in Leitungswasser vor, um die am Wurzelsystem befestigten Nematoden zu färben.
7. Fügen Sie der Wurzelprobe im Probenbehälter ca. 30 ml der roten Lebensmittelfärbelösung hinzu, um das Wurzelsystem vollständig abzudecken.
8. Legen Sie den Probenbehälter in einen Mikrowellenherd und erhitzen Sie die Wurzelprobe, bis die Färbelösung zu kochen beginnt. Entfernen Sie die Probe aus dem Mikrowellenherd und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur abkühlen.
9. Dekantieren Sie die rote Lebensmittelfärbungslösung aus der Wurzelprobe und fügen Sie etwa 100 ml Leitungswasser in den Probenbehälter, um überschüssige Flecken zu entfernen. Legen Sie die Abdeckung auf den Probenbehälter und lagern Sie die Probe in einem Kühlschrank bei 4 °C. Fahren Sie mit Schritt 5 für die Bewertung der Wurzelinfektion fort.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, bevor Sie mit Schritt 5 fortfahren.

4. Vegetative Vermehrung zur Rückgewinnung von Pflanzen für die Saatgutproduktion

1. Legen Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden eines konischen Plastiktopfes (siehe Schritt 2.3) und füllen Sie den Topf teilweise mit Torfmoos-Topfmedien. Dann legen Sie den vegetativen Trieb in den Topf und fügen Sie fest Topfmedien hinzu, um den Topf zu füllen. Legen Sie einen neuen beschrifteten Kunststoffpfahl in jeden Topf, um den Baumwollgenotyp zu bezeichnen.
2. Das Schalentablett in einen Kunststoffbehälter (73,6 cm Länge x 45,7 cm Breite x 15,2 cm Höhe) mit Wasser geben und die Pflanzen kurz gießen, um die Vergussmedien zu befeuchten. Legen Sie die Töpfe in einer Wachstumskammer mit einer konstanten Temperatur von 28 °C mit einer 16 h Photoperiode. Fügen Sie dem Kunststoffbehälter bei Bedarf zusätzliches Wasser hinzu, um die Bodenfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
3. Verpflanzen Sie die Pflanzen in größere Töpfe für die Samenproduktion nach ca. 30 d. Füllen Sie einen 6 L Kunststofftopf teilweise mit Topfmedien (siehe Schritt 4.1), entfernen Sie die Pflanze aus dem kleinen Topf, legen Sie die Pflanze in den 6 L Topf und fügen Sie die Topfmedien fest hinzu, um den Topf zu füllen.
4. Legen Sie die Pflanzen in ein Gewächshaus und fügen Sie Wasser hinzu, um die Topfmedien zu befeuchten. Halten Sie die Temperatur im Gewächshaus bei ca. 28 °C (künstliche Beleuchtung ist nicht erforderlich).
   1. Wasserpflanzen von Hand, wie für ca. 30 d benötigt.
   2. Wenn etwa 75% der Pflanzen täglich bewässert werden müssen, verwenden Wasserpflanzen täglich ein automatisches Bewässerungssystem. Passen Sie das automatische Bewässerungssystem häufiger an Daswasser an, je nach Bedarf für das Pflanzenwachstum.
   3. Fügen Sie etwa 10 g eines langsam freisetzenden Düngers in jeden Topf vor dem Beginn der floralen Einweihung.
5. Erntepflanzen bei Reife und verarbeiten sie die Baumwollsamenproben, um Samen für die weitere Bewertung zu erhalten.
   1. Um Baumwollsamen zu ernten, entfernen Sie die Baumwolle von Hand von den offenen Pollern auf der Pflanze und legen Sie sie in eine beschriftete Papiertüte. Die Samen werden an den Baumwollfasern befestigt, die in den folgenden Schritten entfernt werden.
   2. Entfernen Sie Fusselfasern aus den Samenproben mit einem 10-Säge-Labor-Gin.
   3. Entfernen Sie Fuzzfasern aus den Samenproben mit konzentrierter Schwefelsäure. Neutralisieren Sie Die Samenproben in einer 15%-Lösung (v/v) von Natriumcarbonat, spülen Sie die Proben mit Leitungswasser ab und trocknen Sie die Proben in einem Zwangslufttrockner.
   4. Legen Sie die Samenproben zur Lagerung in beschriftete Umschläge.

5. Bewertung von R. reniformis Wurzelinfektion

1. Entfernen Sie die Wurzelprobe aus dem Probenbehälter und zählen Sie die Anzahl der weiblichen Nematoden, die mit einem Stereomikroskop (20X Vergrößerung) am Wurzelsystem befestigt sind.
   HINWEIS: Nur weibliche reniforme Nematoden sind in der Lage, Pflanzenwurzeln zu infizieren.
2. Legen Sie das Wurzelsystem für ca. 10 min auf Papiertücher, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Wiegen Sie das Wurzelsystem, um das frische Wurzelgewicht zu bestimmen.
3. Geben Sie die Nematodenanzahl und die datenfrischen Stammgewichte in ein Computertabellenprogramm ein und berechnen Sie die Anzahl der Weibchen pro Gramm Root.

Ergebnisse

Rotylenchulus reniformis Infektion des Wurzelsystems für zwei Sorten ist in Abbildung 1dargestellt. Relativ weniger weibliche reniforme Nematoden sind in der Lage, eine Futterstelle für den resistenten Baumwollgenotyp im Vergleich zum anfälligen Genotyp zu etablieren. Unterschiede im Wurzelwachstum sind zwischen den Beitritten üblich, wie in Abbildung 2dargestellt. Diese Variation, gemessen am frischwurzelgewichtigen Gew...

Diskussion

Für 1) die Identifizierung von Rist ein effektives Screening-Protokoll erforderlich. reniformis resistente Baumwollgenotypen, um die Genetik der Resistenz und 2) die Züchtung resistenter Sorten zu bewerten. Die meisten Protokolle bewerten R. reniformis Populationsdichten oder Reproduktionsraten durch Extraktion von vermiformenen Nematoden oder Eiern aus dem Baumwollwurzelsystem oder Blumenerde^8,11,1...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ray Leach Cone-tainer,	Stuewe und Söhne, Inc.	SC10U Cone-tainer
	Tablett Stuewe and Sons Inc.	RL98
Sand	verschiedene
Wattebällchen	verschiedene
Pylon 4 Zoll Pflanzenetiketten (4 Zoll L x 5/8 Zoll W)	Pylon Platics	L-4-W	Jede Marke oder jeder Anbieter ist akzeptabel.
4 oz. Probenbehälter	Fisher Scientific	16-320-731	Jede Marke oder jeder Anbieter ist akzeptabel.
Rote Lebensmittelfarbe	McCormick & Co., Inc.
1 mL Pipettenspitzen	diverse
10 L Behälter	diverse		Preiswerte Eimer funktionieren gut.
6 L Töpfe	Nursery Supplies Inc.	Poly-Tainer-Dose No2A	Jede Marke und jeder Hersteller ist akzeptabel. Es können Töpfe in verschiedenen Größen verwendet werden
Blumenerde	Sun Gro Horticulture	Metro-Mix 360	Jede Marke oder jeder Anbieter ist akzeptabel.
Düngemittel	Everris NA Inc.	Osmocote Plus	Jede Marke oder jeder Anbieter ist akzeptabel.
Kunststoffbehälter (73,6 cm L x 45,7 cm B x 15,2 cm T)	Rubbermaid	3O29	Jede Marke oder jeder Anbieter ist akzeptabel.