Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.
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Methodenartikel
Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine umfassende Kennzeichnung der RNA-bindende Proteine (RBPs) ist Schlüssel zum Verständnis der posttranskritionelle regulatorischen Netzwerks in den Zellen. Eine weit verbreitete Strategie für RBP-Capture nutzt die Polyadenylation [Poly] Ziel RNAs, die tritt meist auf Eukaryotische reifer mRNAs, verlassen die meisten bindende Proteine der non-poly(A) RNAs nicht identifizierte. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer kürzlich berichtet Methode bezeichnet Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC), die die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs ermöglicht durch die Kombination der metabolischen Kennzeichnung von RNAs in Vivo UV-Vernetzung und Bioorthogonal zu markieren.
Einleitung
Das menschliche Genom ist in verschiedenen Arten der Codierung und Forensisches RNAs (NcRNAs), einschließlich der mRNAs, rRNAs und tRNAs, kleinen nuklearen RNAs (SnRNAs), kleinen Nukleolus RNAs (SnoRNAs) und lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs)1transkribiert. Die meisten von diesen RNAs besitzen Kleidung der RBPs und fungieren als Ribonucleoprotein Partikel (RNPs)2. Daher ist eine umfassende Kennzeichnung der RBPs Voraussetzung zum Verständnis der regulatorischen Netzwerk zwischen RNAs und RBPs, die an verschiedenen Krankheiten beim Menschen3,4,
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Protokoll
Achtung: Gegebenenfalls verwendeten Reagenzien sollten gekauft in Form von RNase-freie, oder aufgelöst in RNase-freie, Lösungsmittel (in den meisten Fällen in Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser). Beim Umgang mit RNA-Proben und Reagenzien RNase-freie tragen Sie immer Handschuhe und Masken, und ändern sie häufig um RNase Kontaminationen zu vermeiden.
1. Vorbereitung der Lysate von metabolisch beschriftet und UV-vernetzte Zellen
-
Metabolische Einbindung von EU und 4SU
- Kultur-HeLa-Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 μg....
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Ergebnisse
Die repräsentativen Ergebnisse der Qualitätskontrolle Schritte werden vorgestellt. Die Ergebnisse enthalten die im Gel Fluoreszenzanalyse im Schritt 2.3.2 (Abbildung 1) beschrieben, der western-Blot-Analyse im Schritt 4.1.3 (Abbildung 2A) beschrieben und die Silber-Färbung Analyse im Schritt 4.2.2 (Abb. 2 b) beschrieben. Die Qualitätskontrolle-Schritte sind entscheidend für die Optimierung der CARIC .......
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Diskussion
Die Aufrechterhaltung der Messe RNA-Integrität ist einer der Schlüssel zum erfolgreichen CARIC Experimente. Mit entsprechenden Liganden Cu(I) und sorgfältige Bedienung kann RNA-Abbau deutlich reduziert werden, obwohl Teilabbau beobachtet wurde. Die Ersatz-Verhältnisse der EU und 4SU in experimentellen Proben sind 1,18 % bzw. 0,46 % (Daten nicht gezeigt). Für intakte RNAs mit einer Länge von 2.000 nt, ca. 90 % der RNAs enthalten mindestens eine EU und eine 4SU. Für teilweise abgebauten RNAs mit einer Länge von 1.000 nt, ~.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation von China Zuschüsse 91753206, 21425204, und 21521003 und von nationalen Key Forschungs- und Entwicklungsprojekt 2016YFA0501500 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fötales Rinderserum) | Thermo Fisher | Scientific 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-Ethinyluridin) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-Thiouridin) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10- mal; PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV-Vernetzer | UVP | CL-1000 | Ausgestattet mit 365-nm-UV-Lampe |
| DEPC (Diethylpyrocarbonat) | Sigma Aldrich | D5758 | Zur Wasseraufbereitung. Hochgiftig! |
| Tris· HCl, pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | Eine Tablette für 50 mL Lysepuffer. |
| LDS (Lithiumdodecylsulfat) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa) | Millipore | UFC901024 | |
| 0,5-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin-Magnetkügelchen | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethylsulfoxid) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azid-Biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Kupfer(II)-sulfat | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Natriumascorbat | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azid-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS-Probenpuffer (4&fach;) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% Bis-Tris Gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Natriumdodecylsulfat) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylen (20)-oleylether] | J& K | 315442 | |
| Triethanolamin | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin Agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Harnstoff | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosin Natriumsalz) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
Referenzen
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
