Methodenartikel

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

DOI:

10.3791/58580

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19. Oktober 2018

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1College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.

Zusammenfassung

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Eine umfassende Kennzeichnung der RNA-bindende Proteine (RBPs) ist Schlüssel zum Verständnis der posttranskritionelle regulatorischen Netzwerks in den Zellen. Eine weit verbreitete Strategie für RBP-Capture nutzt die Polyadenylation [Poly] Ziel RNAs, die tritt meist auf Eukaryotische reifer mRNAs, verlassen die meisten bindende Proteine der non-poly(A) RNAs nicht identifizierte. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer kürzlich berichtet Methode bezeichnet Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC), die die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs ermöglicht durch die Kombination der metabolischen Kennzeichnung von RNAs in Vivo UV-Vernetzung und Bioorthogonal zu markieren.

Einleitung

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Das menschliche Genom ist in verschiedenen Arten der Codierung und Forensisches RNAs (NcRNAs), einschließlich der mRNAs, rRNAs und tRNAs, kleinen nuklearen RNAs (SnRNAs), kleinen Nukleolus RNAs (SnoRNAs) und lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs)1transkribiert. Die meisten von diesen RNAs besitzen Kleidung der RBPs und fungieren als Ribonucleoprotein Partikel (RNPs)2. Daher ist eine umfassende Kennzeichnung der RBPs Voraussetzung zum Verständnis der regulatorischen Netzwerk zwischen RNAs und RBPs, die an verschiedenen Krankheiten beim Menschen3,4,5beteiligt ist.

Die letzten Jahren verzeichnen einen großen Schub von RBPs entdeckt in verschiedenen eukaryontischen Systemen2,6, einschließlich menschliche7,8,9,10,11, Maus12,13,14, Hefe9,15,16, Zebrafisch17, Drosophila Melanogaster18,19 , Caenorhabditis Elegans16, Arabidopsis Thaliana20,21,22und menschliche Parasiten23,24,25 . Diese Fortschritte haben durch eine RBP-Capture-Strategie von Castello Et Al. entwickelt erleichtert 7 und Baltz Et al. 8 im Jahr 2012 verbindet in Vivo UV-Vernetzung der RNA und seinen interagierenden Proteine, oligo(dT) Erfassung von poly(A) RNAs und Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomic profiling. Allerdings ist angesichts der Tatsache, dass poly(A) meist auf Reifen mRNAs vorhanden ist, die für nur ~ 3 % - 5 % der eukaryotischen Transkriptom26ausmachen, diese weit verbreitete Strategie nicht in der Lage RBPs Interaktion mit non-poly(A) RNAs, einschließlich die meisten ncRNAs und Pre-mRNAs.

Hier berichten wir über die Modalitäten einer neu entwickelten Strategie für die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs27. CARIC genannt, verbindet diese Strategie in Vivo UV-Vernetzung und metabolische Kennzeichnung von RNAs mit Photoactivatable und "anklickbar" Nukleosid-Analoga (enthält eine Bioorthogonal funktionelle Gruppe, die bei Klick Reaktion teilnehmen können), 4 - Thiouridine (4SU) und 5-Ethynyluridine (EU). Die Taste, um optimale Ergebnisse mit der CARIC-Strategie sind Schritte sind effiziente metabolische Beschriftung, UV-Vernetzung und klicken Sie auf die Reaktion und die Aufrechterhaltung der Integrität der RNA. Da Cu(I) verwendet als Katalysator in Klick Reaktion die Zersplitterung des RNAs verursachen können, unbedingt ein Cu(I) Liganden, die RNA Fragmentierung reduzieren können. Wir beschreiben, wie effiziente Klick Reaktionen in Zelle Lysates durchführen, ohne dass es zu schweren RNA-Abbau.

Obwohl RBP erfassen und Identifikation in HeLa-Zellen wird nur in diesem Protokoll beschrieben, kann die CARIC Strategie zu verschiedenen Zelltypen und möglicherweise zu lebenden Organismen angewendet werden. Neben RBP erfassen bietet dieses Protokoll auch optimierte schrittweise Anleitungen für MS Probenvorbereitung und Proteinidentifizierung und Quantifizierung, die hilfreich für diejenigen, die nicht vertraut mit Proteomic Experimente sind.

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Protokoll

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Achtung: Gegebenenfalls verwendeten Reagenzien sollten gekauft in Form von RNase-freie, oder aufgelöst in RNase-freie, Lösungsmittel (in den meisten Fällen in Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser). Beim Umgang mit RNA-Proben und Reagenzien RNase-freie tragen Sie immer Handschuhe und Masken, und ändern sie häufig um RNase Kontaminationen zu vermeiden.

1. Vorbereitung der Lysate von metabolisch beschriftet und UV-vernetzte Zellen

  1. Metabolische Einbindung von EU und 4SU
    1. Kultur-HeLa-Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin bei 37 ° C in 5 % CO2 Atmosphäre ergänzt. ~ 4 x 107 HeLa-Zellen (in zwei 15-cm-Gerichten) für die Vorbereitung einer experimentellen Kultur oder Einfluss auf Probe für einen standard MS ausführen.
    2. Wenn die kultivierten HeLa-Zellen ~ 80 % Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und 15-mL vorgewärmte frisches Medium pro 15 cm Schale.
    3. Fügen Sie 15 μl pro Schale von 100 mM EU (aufgelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)), eine Endkonzentration von 1 mM und 7,5 μl pro Schale von 100 mM 4SU (aufgelöst mit PBS-Puffer), eine Endkonzentration von 0,5 mM für experimentelle und NoUV Kontrollproben. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 1 mM für no4SU-Kontrollproben 15 μl pro Schale von 100 mM EU (aufgelöst in PBS).
      Hinweis: 4SU ist Foto-aktivierbare; Somit ist vor Licht geschützt, nach dem Hinzufügen von 4SU erforderlich.
    4. Die Gerichte mit Folie abdecken und Kultur der Zellen für 16 h hinzufügen die Hälfte des Betrags der EU und 4SU oder nur EU aus Schritt 1.1.3 zu experimentellen, NoUV- und no4SU-Kontrollproben, bzw., und Kultivierung einer anderen 2 h.
  2. In vivo UV-Vernetzung
    1. Das Kulturmedium zu entfernen, waschen Sie die Zellen 3 X mit 5 mL PBS pro Schale, und entfernen Sie verbleibende PBS so weit wie möglich.
      Hinweis: Rückstände Flüssigkeit verringert erheblich vernetzende Leistung.
    2. Für experimentelle und no4SU-Kontrollproben, legen die Gerichte auf dem Eis mit den Deckel entfernt und die Zellen mit 365 nm UV-Licht 2 J/cm2 durch eine UV-Vernetzer zu bestrahlen.
    3. Für NoUV Kontrollproben die Gerichte auf Eis legen und sie vor Licht zu schützen.
      Hinweis: Alle folgenden Schritte zur NoUV Kontrollproben sollte in einem abgedunkelten Raum durchgeführt werden.
  3. Lyse der Zelle und Homogenisierung
    1. Fügen Sie 1 mL pro Schale von Pre-Lyse-Puffer (10 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 50 mM LICI, 0,02 % Nonidet p-40 und Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-freie Protease-Inhibitor-Cocktail) zu den Zellen. Kratzen Sie die Zellen mit einer Kautschuk-Zelle-Lifter und sammeln Sie die Pre-Lyse-Suspension in eine 15-mL-Tube.
      Hinweis: Dieser Schritt wird brechen die Zellmembran und release-lösliche zytoplasmatischen Proteinen und RNAs. Nicht Zentrifugieren die Röhre und den überstand zu entfernen.
    2. Für die Aufhängung von zwei 15-cm-Gerichte die Lautstärke bis 6 mL durch Hinzufügen von Pre-Lyse Puffer. Hinzu kommt die Pre-Lyse Aussetzung ein gleiches Volumen an R-Lyse Puffer (200 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 500 mM LICI, 2 % Lithium Dodecyl Sulfat [hlt]).
    3. Homogenisieren der Zelle lysate, indem man es durch eine Spritze mit einer schmalen Nadel (27 G) mehrmals bis die lysate klar und homogen ist. Inkubieren Sie lysate bei 4 ° C mit sanften Drehung (~ 15 u/min) für 1 h.
      Hinweis: Dieser letzte Schritt ermöglicht die vollständige Denaturierung der Proteine. Die lysate können sicher bei-70 ° C bis zu einem Monat aufbewahrt werden.
  4. Vorbereitung auf Klick Reaktion
    1. Verdünnen Sie der lysate durch Zugabe von 20 Bände Verdünnungspuffer (50 mM Tris∙HCl, pH 7,5) und in 15 mL Fraktionen aufteilen.
      Hinweis: Lösungen mit einer hohen Konzentration von Salz und Spülmittel beeinträchtigt die Effizienz der Cu (I)-katalysierten Reaktion Klick; Somit muss der Puffer von der lysate gewechselt werden.
    2. Jede Fraktion mit 15 mL Ultrafiltration Rohr (mit einem Molekulargewicht Cutoff von 10 kDa), bis das Volumen kleiner als 1 mL ist zu konzentrieren. Verwenden Sie einen schwingen-Eimer-Rotor um die Ultrafiltration Röhre bei 4.000 X g bei 4 ° C für ca. 15 min zu drehen.
    3. Die konzentrierte lysate Bruchteil 14 mL Verdünnungspuffer hinzu, und wiederholen Sie Schritt 1.4.2. Kombinieren Sie die Brüche und konzentrieren sie auf ein Volumen von 6 mL durch Ultrafiltration (4.000 X g bei 4 ° C für ca. 15 min).
      Hinweis: Die meisten Salz und LDS wird nun entfernt werden, damit die lysate für die Klick-Reaktion steht. Die lysate können bei-70 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden. Vermeiden Sie mehrere Frost-Tau-Zyklen, da sie zu erheblichen RNA-Abbau führt. Aliquoten lysate, wenn kleine Charakterisierungen erforderlich sind.

2. Vorbereitung von Proben für RNA-Interaktom erfassen

  1. Preclearing von der lysate
    1. Fügen Sie 100 μL Streptavidin magnetische Beads pro 6 mL lysate und drehen Sie sanft (~ 15 u/min) für 30 min bei Raumtemperatur, natürlich biotinylierte Proteine zu beseitigen.
    2. Pellet-die Perlen mit einem Magneten (für ~ 20 min bei 4 ° C) und Transfer der precleared lysate zu einem neuen Schlauch.
  2. Leistung der Klick-Reaktion
    1. Bereiten Sie die Reaktion Mischung: 6,5 μL der Biotin-Lager (100 mM-azid-Biotin aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid [DMSO] auf eine Endkonzentration von 100 μM), 3,25 μL Kupfer Aktie (frisch machen; 1 M CuSO4 aufgelöst in Wasser bei einer Endkonzentration von 500 μM) , 65 μL des Liganden Lager (200 mM THPTA in Wasser bei einer Endkonzentration von 2 mM aufgelöst) und 262.75 μL von H2O.
      Hinweis: THPTA steht für Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) Methyl] Amin.
    2. 6 mL precleared lysate Reaktion-Mischung hinzufügen und gut verrühren. Fügen Sie 162,5 μl Reagenz zu reduzieren (machen es frisch; 40 mg/mL Natrium-Ascorbat an eine Endkonzentration 5 mM) zu der lysate und gut mischen. Das Endvolumen sollte 6,5 mL betragen.
    3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (800 u/min). Das Reaktionsgemisch 5 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie es für 5 min um die Reaktion zu stillen.
  3. Kleinräumige Charakterisierungen
    1. Bereiten Sie die Reaktion Mischung wie in Schritt 2.2.1 mit Biotin-Lager durch Farbstoff bestand (z. B.100 mM-azid-Cy5 in DMSO gelöst) ersetzt.
      Hinweis: Das Reagenz sollte entsprechend dem Volumen der lysate angepasst werden. In der Regel reicht ein 20 μL aliquoten von der lysate Charakterisierungen wie eine in-Gel Fluoreszenzanalyse.
    2. Hinzu kommt die Reaktion Mischung der lysate und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie ein Drittel des Volumens des LDS Probenpuffer (4 X), bei 55 ° C für 5 min Denaturieren Sie und lösen Sie die Probe auf einem 10 %-Bis-Tris-Gel.
      Hinweis: Um zu bestätigen, dass das Fluoreszenzsignal auf RNAs präsentiert wird, enthalten Sie Steuerelemente mit RNase A Verdauung nach der Klick-Reaktion.
  4. Aufräumen des Reaktionsgemisches
    1. Das abgeschreckt Reaktionsgemisch acht Bänden prechilled Methanol (100 %) hinzu und inkubieren Sie es für 30 min bei-30 ° C Niederschlag. Führen Sie den Niederschlag in 50 mL konische Zentrifuge Röhren.
      Hinweis: Wenn das Gesamtvolumen größer als 50 mL ist, teilen Sie das Reaktionsgemisch in zwei 50 mL konische Zentrifuge Röhren.
    2. Rekonstitution Puffer zubereiten: 1 Volumenteil Puffer A (4 % Sodium Dodecyl Sulfat [SDB] und 10 mM EDTA) mit acht Bänden Puffer B (1 % Brij-97, 150 mM NaCl und 50 mM Triethanolamin, pH 7,4) zu kombinieren.
    3. 4.000 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand verwerfen. Das Pellet ~ 1-2 mL prechilled Methanol hinzufügen. Pipette rauf und runter zu brechen das Pellet und sicherzustellen, dass das Pellet ist vollständig mit keine sichtbaren Klumpen suspendiert. Füllen Sie das Rohr mit prechilled Methanol. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.
    4. 4.000 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand verwerfen. Setzen Sie zurück, die die Rohre und Zentrifuge wieder bei 4.000 X g für 5 min. vorsichtig das restliche Methanol so weit wie möglich ziehen ohne zu stören das Pellet.
    5. 10 mL Rekonstitution Puffer zum Pellet hinzugeben. Pipette rauf und runter um die Pellets zu lösen. Zentrifuge bei 4.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
    6. Übertragen Sie den überstand auf einen neuen Schlauch. Sammle 20 μl der Probe für die Qualitätskontrolle (siehe Abschnitt 4).
      Hinweis: Jetzt ist die Probe für RNA-Interaktom Erfassung bereit. Die rekonstituierte Probe kann bei-70 ° C bis zu einer Woche gelagert werden.

(3) RNA-Interaktom Capture

  1. Vorbereitung der Streptavidin-Agarose Korne
    1. Eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen berücksichtigen Sie 1.600 μL Streptavidin-Agarose Gülle (800 μl der sesshaften Perlen) pro 10 mL der rekonstituierten Probe.
    2. Spin-down der Perlen bei 4000 X g für 5 min. entfernen Sie vorsichtig den überstand ohne zu stören die sesshaften Perlen.
    3. Waschen Sie die Perlen mit 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Spin-down der Perlen (4.000 X g für 5 min) und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.
  2. Affinität pulldown
    1. Übertragen Sie aufgeräumt und rekonstituierte Probe von Schritt 2.4.6 auf die Streptavidin-Agarose-Perlen (siehe Punkt 3.1). Über Nacht mit sanften Drehung bei 4 ° c inkubieren
  3. Waschen von Streptavidin-Perlen
    1. Spin-down der Perlen (4.000 X g für 5 min) und den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen. Sammle 20 μl der Probe für die Qualitätskontrolle.
    2. Waschen Sie die Perlen mit 10 mL Waschpuffer (2 % SDS mit PBS-Puffer, pH 7.4). 10 min mit sanften Drehung (~ 12 u/min) bei Raumtemperatur inkubieren. Spin-down der Perlen (4.000 X g für 5 min) und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie 1 X.
    3. Wiederholen Sie Schritt 3.3.2 mit Waschpuffer B (8 M Harnstoff und 250 mM NH4HCO3 in Wasser aufgelöst). Wiederholen Sie Schritt 3.3.2 mit Waschpuffer C (2,5 M NaCl mit PBS-Puffer, pH 7.4). Waschen Sie die Perlen mit 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Spin-down der Perlen (4.000 X g für 5 min) und den überstand zu entfernen.
    4. Die Perlen gleichmäßig aufgeteilt und auf zwei 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
  4. Elution der erfassten RNPs
    1. Bereiten Sie Biotin Elution Buffer: 12,5 mM Biotin, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris∙HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15 % SDS, 0.075 % Sarkosyl und 0,02 % Natrium Deoxycholate.
      Hinweis: Store kann der Puffer bei Raumtemperatur für Biotin bei 4 ° c Niederschlag
    2. 400 μl der gewaschenen ständiger Perlen fügen Sie 400 μl von Biotin Elution Buffer hinzu.
    3. Inkubieren sie auf einem Orbitalschüttler (1.500 u/min) bei Raumtemperatur für 20 min. Dann, brüten auf einem Orbitalschüttler mit einem Heizblock (1.500 u/min, 65 ° C) für 10 min. Spin down die Perlen (7.800 X g für 1 min) und der eluierten RNP zu sammeln.
    4. Fügen Sie zu den Perlen 400 μl von frischen Biotin Elution Buffer hinzu und wiederholen Sie Schritt 3.4.3. Kombinieren Sie die beiden elutes in eine 15-mL-Tube.
  5. RNase-Verdauung
    1. Fügen Sie drei Bände mit Verdünnungspuffer eluierten RNP, die Konzentration der SDS zu verringern hinzu. Der verdünnte Probe zu konzentrieren, indem mit einem 0,5 mL Ultrafiltration Rohr (mit einem Molekulargewicht Cutoff von 10 kDa; drehen sich mit 12.000 X g bei 4 ° C für ca. 30 min), ~ 40 μL.
    2. Fügen Sie 0,5 µg/μl RNase A und 2 h bei 37 ° C freizugebende RBPs aus vernetzten RNAs inkubieren. Sammeln Sie 2 μL der RBPs für die Qualitätskontrolle (siehe Abschnitt 4).

4. Qualitätskontrolle

  1. Kontrolle der Effizienz der Affinität pulldown
    1. Nehmen Sie 10 μL der "vor-Pulldown" Probe aus Schritt 2.4.6 und 10 μL der "nach-Pulldown" Probe aus Schritt 3.3.1.
    2. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung von standard-western-Blot-Verfahren (10 % Bis-Tris-Gel).
    3. Fleck Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran mit Streptavidin-HRP-Konjugat, die Rückstände Biotin Signale der "nach-Pulldown" Probe zu überwachen.
      Hinweis: Wenn das Biotin-Signal der "nach-Pulldown" Probe mehr als ein Fünftel des Signals der "vor-Pulldown" Probe ist, erhöhen Sie die Streptavidin-Agarose Korne in Schritt 3.1.1 verwendet.
  2. Kontrolle über die gesamte Erfassung Effizienz
    1. 2 μL der veröffentlichten RBP Probe aus Schritt 3.5.2 und 0,5 μL der "vor-Pulldown" Probe zu nehmen (wie 0,1 % Eingang) Schritt von 2.4.6.
    2. Analysieren Sie die Proben mit Silber-Färbung Standardverfahren.
      1. Befestigen Sie das Gel mit Fixierung Puffer (40 % Ethanol, 10 % Essigsäure) für 20 min, gefolgt von Sensibilisierung (13 mM Na2S2O3, 83 mM Natriumacetat, 30 % Ethanol) für 30 min.
      2. Waschen Sie das Gel 3 X mit Wasser für 5 min und dann färben Sie es mit einem 15 mM AgNO3 Lösung für 20 min. waschen das Gel 2 X mit Wasser für 1 min in 0.24 M Na2CO3 und 0,012 % Formaldehyd zu entwickeln und mit 45 mM EDTA zu kündigen, wenn die Färbung ist sufficien HNO.
        Hinweis: Die Silber-Färbung Intensität der erfassten RBPs sollte ähnlich wie die Eingabe von 0,1 %.

5. Vorbereitung der Proben für MS

  1. Trypsin-Verdauung der aufgenommenen RBPs in gel 28
    1. Fügen Sie ein Viertel Volumen der SDS-Probenpuffer (5 X) zu den veröffentlichten RBP-Beispielen aus Schritt 3.5.2. Denaturieren Sie die Probe bei 95 ° C für 10 Minuten.
    2. Lösen Sie die RBPs auf einem 1,5 mm 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel.
    3. Färben Sie das Gel mit Silber, folgende standard-Protokolle.
    4. Verbrauchssteuern der Spur der experimentellen Probe oder Kontrollprobe mit Stapeln Gel und die wichtigsten Band der RNase (~ 15 kDa) entfernt.
    5. Die ausgeschnittene Lane in kleine Stücke (~ 1-1.5 x ~ 1-1,5 mm) schneiden.
      Hinweis: Die kürzeste Kante des Stückes Gel sollte nicht kürzer als 1 mm sein, verhindert Verstopfung Pipettenspitzen.
    6. Übertragen Sie die Gel-Stücke zu einem Microcentrifuge Schlauch und destain mit Entfärben Puffer (eine Mischung aus gleichen Volumina von 100 mM Na2S2O3 und 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Waschen Sie die Gel-Stücke mit 200 mM Ammonium Bicarbonat (ABC), bis das Gel Stücke völlig farblos sind.
    8. Die Gel-Stücke in 1 mL der ordentlich Acetonitril (ACN) zu entwässern. Deinen Durst mit 200 μl 10 mM Dithiothreitol (gelöst in 50 mM ABC) und bei 56 ° C für 45 min inkubieren.
      Hinweis: Komplett dehydriert Gel Stücke sollte sehr hart und undurchsichtig. Wenn die Gel-Stücke nach Austrocknung noch weich sind, entfernen Sie die ACN und 1 mL ordentlich ACN wieder austrocknen.
    9. Die Gel-Stücke auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie 200 μL der 58 mM Iodoacetamide (aufgelöst in 50 mM ABC) und bei Raumtemperatur für 45 Minuten im Dunkeln inkubieren.
    10. Nach einem kurzen waschen mit Wasser entwässern Sie die Gel-Stücke in 1 mL ordentlich ACN.
      Hinweis: Die Gel-Stücke müssen völlig dehydriert.
    11. Rehydrieren Sie die Gel-Stücke mit der entsprechenden Menge von 10 ng/μl Trypsin (gelöst in 50 mM ABC) und inkubieren Sie bei 37 ° C für 12-16 Uhr.
      Hinweis: Die Gel-Stücke sollte komplett mit keine undurchsichtigen Kernen rehydriert werden. Überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
  2. Stabiler Isotope Dimethyl Kennzeichnung der verdauten Peptide 29
    1. Auszug der verdauten Peptide aus Gel-Stücke durch Zugabe von 200 μl des Extraktionspuffer (5 % Ameisensäure und 50 % ACN im Wasser) und Inkubation bei 37 ° C für 30 min mit Vortexen (bei 1.200 u/min).
    2. Wiederholen Sie Schritt 5.2.1 2 X. Kombinieren Sie die Extrakte in einem Microcentrifuge Schlauch.
    3. Trocknen Sie die extrahierten Peptide durch Vakuum Zentrifugieren.
    4. Bereiten Sie die Peptide in 200 μl 100 mM triethylammoniumhydrochlorid Bikarbonat (TEAB, pH 8,5).
      Achtung: Schritte 5.2.4 - 5.2.6 sollte auf Eis in einem Abzug durchgeführt werden.
    5. 8 μl 4 % CH2O und 8 μl 4 % 13CD2O, die experimentelle und Kontrollproben, bzw. hinzufügen.
      Hinweis: Um die Vorspannung des stabilen Isotopen Kennzeichnung zu steuern, tauschen Sie das stabile Isotop für experimentelle und Proben von den anderen biologisch unabhängige replizieren zu kontrollieren.
    6. Hinzufügen von 0,6 M NaBH3CN 8 μl (frisch machen) und gut mischen.
    7. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur 1 h mit aufschütteln.
    8. Die Proben auf Eis abkühlen. Die Reaktion durch Zugabe von 32 μL 1 % wässrige Ammoniaklösung zu stillen. Dann weiter zu stillen die Reaktion durch Zugabe von 16 μL der Ameisensäure.
    9. Kombinieren Sie die experimentelle Probe mit den entsprechenden Kontrollprobe in einem Microcentrifuge Schlauch. Trocknen Sie die Proben durch Vakuum Zentrifugieren.
  3. Fraktionierung von Dimethyl-Label Peptide
    1. Bereiten Sie die Stop-und-Go-Extraktion Tipps (StageTips)30.
      1. Legen Sie eine C18-Membran in eine erweiterte Länge 10 μL Tipp.
      2. Fügen Sie 300 μg von hohem pH-Wert C18 Perlen bis zur Spitze im ACN ausgesetzt.
      3. Setzen Sie die Spitze aufrecht in einem Microcentrifuge Schlauch mit einem selbst gebastelten Rack, stabilisieren die Spitze und die Spitze aus dem Boden heben kann.
      4. Drehen Sie der Spitze bei 1.400 X g für 2 min. verwerfen der durchströmten.
      5. Waschen Sie die Spitze mit 50 μL von 80 % ACN in 10 mM ABC (pH 10,0). Wiederholen Sie 1 X.
        Hinweis: Stellen Sie den pH-Wert von 10 mM ABC Lösung durch Zugabe von 28 % Ammonium Hydroxid.
      6. Waschen Sie die Spitze mit 50 μL von 50 % ACN in 10 mM ABC (pH 10,0). Wiederholen Sie 1 X.
      7. Waschen Sie die Spitze mit 50 μL 10 mm ABC (pH 10,0). Wiederholen Sie 1 X.
    2. Bereiten Sie die Peptide in 50 μl 10 mm ABC (pH 10,0).
    3. Die vorbereiteten Spitze die rekonstituierte Probe hinzufügen. Laden Sie den Durchfluss bis zur Spitze zu effizienten Peptid-Bindung zu gewährleisten.
    4. Waschen Sie die Spitze mit 50 μL 10 mm ABC (pH 10,0). Wiederholen Sie 1 X.
    5. Eluieren das Peptid schrittweise für 12 Fraktionen mit 50 μL von 6 %, 9 %, 12 %, 15 %, 18 %, 21 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 80 % und 6 % ACN in 10 mM ABC (pH 10,0).
    6. Kombinieren Sie zwei Brüche mit dem gleichen Intervall (Teil 1 mit 7, 2 mit 8, und so weiter) zu sechs Fraktionen kombiniert.
    7. Trocknen Sie die Proben durch Vakuum Zentrifugieren. Die getrockneten Peptide können gespeichert werden, bei-30 ° C.

6. Ausführung der MS und Datenanalyse

  1. Peptid-Analyse durch flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
    1. Bereiten Sie die getrockneten Peptid-Fraktionen aus Schritt 5.3.7 in 15 μl Wasser mit 0,1 % Ameisensäure. Überprüfen Sie den pH-Wert des rekonstituierten Peptide durch spotting 1 μl der Lösung auf einen pH-Streifen (der pH-Wert sollte unter 3).
    2. Injizieren Sie die Probe stellen in der Flüssigchromatographie (LC)-Spalte. Auftragen einer geeigneten Steigung von Lösungsmittel (Lösungsmittel, die A ist, dass Wasser mit 0,1 % Ameisensäure, Lösungsmittel B ist ACN mit 0,1 % Ameisensäure) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Ein typischen Verlauf des Lösungsmittels B lautet wie folgt: 5 % - 35 % in 40 min; 35 % - 70 % in 4 min; und bei 75 % für 10 min gehalten.
    3. Die eluierten Peptide durch Electrospray ionisieren und das Massenspektrometer in datenabhängiges Modus zu betreiben. Wählen Sie 15 am häufigsten vorkommenden Ionen (mehrfach geladenen: 2 + 3 + oder höher) in der ersten MS Scannen für einen Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Scan (Kollision-induzierte Dissoziation, CID). Legen Sie die Größe der dynamischen Ausgrenzung bis 500 mit einer maximalen Dauer von 25 s.
  2. Protein-Identifizierung und Quantifizierung mit MaxQuant 31
    1. Die false Discovery Rate (FDR) der Proteinidentifikation auf 0,01 festgelegt und die Anzahl der einzigartigen Peptide auf 2 gesetzt, um Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu erhöhen.
    2. Satz der minimal erforderlichen Verhältnis zählt (einzigartige + Rasiermesser) für Protein Quantifizierung, 2, und aktivieren Sie die neu zu quantifizieren und Übereinstimmung zwischen den Läufen Funktionen.
  3. Anreicherung Bedeutung Auswertung über die R/Bioconductor Paket limma 32
    1. Führen Sie einen moderierten t-Test implementiert in Limma, Log2-fache Änderung gegen Null aus mindestens drei biologische Wiederholungen zu testen. Verwenden Sie die read.table -Funktion zum Lesen der Datentabelle. Verwenden Sie dann die Funktionen LmFit und eBayes für Daten passend. Verwenden Sie die TopTable -Funktion, um die Berechnungsergebnisse (einschließlich der gemittelten Log2-Falte ändern und P -Werte) exportieren.
    2. Korrigieren Sie die P -Werte mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode für die Steuerung der FDR.
    3. Anwenden einer FDR von 0,01 zum Generieren einer Liste von Proteinen in den experimentellen Proben wesentlich bereichert. Stellen Sie einem Cutoff von zwei- oder dreifache Änderung auf weitere Kontrolle der Fehlalarme.

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Ergebnisse

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Die repräsentativen Ergebnisse der Qualitätskontrolle Schritte werden vorgestellt. Die Ergebnisse enthalten die im Gel Fluoreszenzanalyse im Schritt 2.3.2 (Abbildung 1) beschrieben, der western-Blot-Analyse im Schritt 4.1.3 (Abbildung 2A) beschrieben und die Silber-Färbung Analyse im Schritt 4.2.2 (Abb. 2 b) beschrieben. Die Qualitätskontrolle-Schritte sind entscheidend für die Optimierung der CARIC ...

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Diskussion

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Die Aufrechterhaltung der Messe RNA-Integrität ist einer der Schlüssel zum erfolgreichen CARIC Experimente. Mit entsprechenden Liganden Cu(I) und sorgfältige Bedienung kann RNA-Abbau deutlich reduziert werden, obwohl Teilabbau beobachtet wurde. Die Ersatz-Verhältnisse der EU und 4SU in experimentellen Proben sind 1,18 % bzw. 0,46 % (Daten nicht gezeigt). Für intakte RNAs mit einer Länge von 2.000 nt, ca. 90 % der RNAs enthalten mindestens eine EU und eine 4SU. Für teilweise abgebauten RNAs mit einer Länge von 1.000 nt, ~...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation von China Zuschüsse 91753206, 21425204, und 21521003 und von nationalen Key Forschungs- und Entwicklungsprojekt 2016YFA0501500 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HeLaATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Thermo Fisher Scientific11995065
FBS (Fötales Rinderserum)Thermo FisherScientific 10099141
Penicillin & StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
EU (5-Ethinyluridin)Wuhu Huaren Co.CAS:69075-42-9
4SU (4-Thiouridin)Sigma AldrichT4509
10- mal; PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Thermo Fisher ScientificAM9625
UV-VernetzerUVPCL-1000Ausgestattet mit 365-nm-UV-Lampe
DEPC (Diethylpyrocarbonat)Sigma AldrichD5758Zur Wasseraufbereitung. Hochgiftig!
Tris· HCl, pH 7,5Thermo Fisher Scientific15567027
LiClSigma Aldrich62476
Nonidet P-40Biodee74385
EDTA-freier Proteasehemmer-CocktailThermo Fisher Scientific88265Eine Tablette für 50 mL Lysepuffer.
LDS (Lithiumdodecylsulfat)Sigma AldrichL9781
15-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa)MilliporeUFC901024
0,5-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa)MilliporeUFC501096
Streptavidin-MagnetkügelchenThermo Fisher Scientific88816
DMSO (Dimethylsulfoxid)Sigma Aldrich41639
Azid-BiotinClick Chemistry ToolsAZ104
Kupfer(II)-sulfatSigma AldrichC1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin]Sigma Aldrich762342
NatriumascorbatSigma Aldrich11140
Azid-Cy5Click Chemistry ToolsAZ118
LDS-Probenpuffer (4&fach;)Thermo Fisher ScientificNP0008
10% Bis-Tris GelThermo Fisher ScientificNP0301BOX
EDTAThermo Fisher ScientificAM9260G
RNase ASigma AldrichR6513
SDS (Natriumdodecylsulfat)Thermo Fisher Scientific15525017
NaClSigma AldrichS3014
Brij-97 [Polyoxyethylen (20)-oleylether]J& K315442
TriethanolaminSigma AldrichV900257
Streptavidin AgaroseThermo Fisher Scientific20353
HarnstoffSigma AldrichU5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosin Natriumsalz)Sigma Aldrich61743
BiotinSigma AldrichB4501
NatriumdesoxycholatSigma Aldrich30970
MaxQuantVersion: 1.5.5.1

Referenzen

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RNA binding ProteinsClick ChemistryRNA interactome CaptureMetabolic LabelingUV Cross linkingBioorthogonal TaggingStreptavidin Agarose BeadsMass SpectrometryWestern Blot AnalysisIn gel Fluorescence

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