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Methodenartikel

Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung In Vivo

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DOI:

10.3791/58616

8. November 2018

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Technik der Hochfrequenz-Ultraschall zur in Vivo Analyse der Feten bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht das Follow-up von Föten und die Analyse der plazentaren Parameter sowie mütterlichen und fetalen Durchblutung während der gesamten Schwangerschaft.

Zusammenfassung

Ultraschall-Bildgebung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Organanomalien und Tumoren im menschlichen und tierischen Geweben. Die Methode ist nicht invasiv, harmlos und schmerzlos, und die Anwendung ist einfach, schnell und überall, auch mit mobilen Geräten durchgeführt werden kann. Während der Schwangerschaft ist Ultraschall-Bildgebung standardgemäß zur fetalen Entwicklung aufmerksam verfolgen. Die Technik ist wichtig, intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR), eine Komplikation der Schwangerschaft mit kurz- und langfristigen gesundheitlichen Folgen für die Mutter und Fötus zu bewerten. Verständnis des Prozesses der IUGR ist unverzichtbar für die Entwicklung von wirksamerer Therapiestrategien.

Das Ultraschallsystem verwendet in diesem Manuskript ist ein Ultraschallgerät für die Analyse von kleinen Tieren hergestellt und kann in verschiedenen Forschungsbereichen, einschließlich der Schwangerschaft verwendet werden. Hier beschreiben wir die Nutzung des Systems für in Vivo Analyse der Feten von natürlichen killer (NK) Zelle/Mastzellen (MC)-mangelhafte Mütter das Wachstum eingeschränkt Welpen gebären. Das Protokoll beinhaltet die Vorbereitung des Systems, Umgang mit den Mäusen vor und während der Messungen und die Verwendung von den B-Modus, Farb-doppler-Modus und Puls-Wave doppler-Modus. Fetale Größe, plazentare Größe und Blut-Versorgungsmaterial zu den Fötus wurden analysiert. Wir fanden reduzierte Implantation Größen und kleinere Plazenta in NK/MC-defizienten Mäusen von Mid Schwangerschaft ab. Darüber hinaus MC/NK-Mangel war abwesend zugeordnet und umgekehrt Ende diastolischer Strömung in der fetalen Arteria Umbilicalis(UmA) und einen erhöhten Widerstand-Index. Die im Protokoll beschriebenen Methoden können leicht für Verwandte und nicht verwandte Forschungsthemen verwendet werden.

Einleitung

Ultraschall ist Schallwellen mit Frequenzen oberhalb des hörbaren Bereiches des menschlichen Ohres, größer als etwa 20 kHz1. Tiere wie Fledermäuse, Wales, Delfine2,3, Mäuse4, Ratten5und Maus Lemuren6 alle verwenden Ultraschall zur Orientierung oder Kommunikation. Menschen nutzen des Ultraschalls für verschiedene technische und medizinische Anwendungen. Ein Ultraschallgerät kann die Schallwelle zu erstellen und zu verteilen und repräsentieren das Signal. Wenn Ultraschall auf ein Hindernis stösst, der Klang wird reflektiert, absorbiert oder kann durch sie gehen. Die Anwendung von Ultraschall als ein bildgebendes Verfahren, Sonographie, genannt dient zur Analyse von organischen Geweben in der Human- oder Veterinärmedizin wie das Herz (Echokardiographie)7,8, Lunge9, Schilddrüse10 , Nieren11und urinausscheidenden und reproduktiven Traktate12,13; Erkennung von Gallensteinen14 und Tumoren15; und Bewertung der Durchblutung der Gefäße oder Organe16,17. Ultraschall ist eine Standardmethode in Vorsorgeuntersuchungen während der Schwangerschaft und fetalen Entwicklungsstörungen oder Beeinträchtigungen frühzeitig erkannt werden können. Insbesondere wird das Wachstum des Fötus in regelmäßigen Abständen zu erkennen, eine mögliche IUGR überwacht. Schließlich kann fetalen Durchblutung überwacht werden, da das Wachstum Einschränkungen18,19,20,21hinweisen kann.

Ein großer Vorteil der Ultraschall-Bildgebung im Vergleich zu anderen Methoden wie Röntgen ist der Klang Harmlosigkeit der Gewebe analysiert werden. Diese einfache und schnelle Methode ist nicht invasiv, schmerzlos, und kann eine Anzahl von Zeiten verwendet. Die Anschaffungskosten ein Ultraschallgerät ist teuer; Allerdings sind die Verbrauchsmaterialien benötigt billig. In diesem Manuskript verwendete Ultraschall-System eignet sich für eine Reihe von Tiermodellen (d. h. Mäuse und Fische) während ein Ultraschallgerät für den Menschen eine Frequenz von 3-15 mHz erfordert, eine Frequenz von 15-70 mHz ist erforderlich für Mäuse.

Das vorliegende Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Verwendung von B-Mode, doppler Farbmodus und Puls-Wave doppler-Modus. Die Beschreibung beinhaltet die Vorbereitung von Mäusen als auch Leistung, Datenerfassung und Speicherung. Diese Methode wurde erfolgreich angewandte, verschiedene Mausstämme überhaupt Schwangerschafts Tage und kann zur fetalen und plazentaren Entwicklung sowie mütterlichen und fetalen Blutparameter zu untersuchen. Hier werden alle Anwendungen basierend auf unsere Studien mit schwangeren MC/NK-defizienten und Kontrolle Mäuse erklärt.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch genehmigt die "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

(1) experimentelle Verfahren

  1. 6 bis 8 Wochen alten weiblichen MC-defizienten C57BL/6J-Cpa3 PaarenCre /+ (Cpa3Cre /+) Mäuse und MC-ausreichend C57BL/6J-Cpa3+/+ (Kolonie Kontrollen; Cpa3+/+) mit BALB/c Männchen.
  2. Definieren des Schwangerschaft Tages (gd) 0 nach der Bestätigung der vaginal Plug und die Weibchen sofort nach der Operationsbestätigung Stecker zu behandeln.
    Hinweis: Ein Stecker ist das Sperma des Mannes in die vaginale Öffnung des Weibchens.
    1. 250 µL PBS intraperitoneal Adis Cpa3+/+ zu injizieren Weibchen.
    2. Injizieren Sie 250 µL Anti-CD122 (0,25 mg) intraperitoneal in MC-defizienten Cpa3Cre /+ Weibchen.
      Hinweis: Eine Injektion von 0,25 mg Anti-CD122 verbraucht, periphere NKs und uNKs in MC-defizienten Cpa3Cre /+ Weibchen bereits22beschrieben.
  3. Warten Sie, bis gd5.
    Hinweis: Bei gd5 ist die früheste Möglichkeit zur Implantation Analyse.
    1. Führen Sie Schritte 2 bis 5 für die Ultraschall-Analyse.
  4. Führen Sie die Ultraschall-Bildgebung bei gd5, 8, 10, 12 und 14.

2. Vorbereitung des Ultraschall-System

  1. Schalten Sie das System (Abbildung 1A, Hauptschalter auf der Rückseite und Computer Standby-auf der linken Seite), die beheizte Plattform (Abbildung 1 b; auf dem Steuerkreuz), und das Gel wärmer (Abbildung 1).
    Hinweis: Ultraschallgel muss Aufwärmphase von ca. 0,5 h.
  2. Sicherzustellen, dass das Isofluran-Gerät ausreichend gefüllt wird (Abbildung 1).
  3. Öffnen Sie eine Neue Studie oder Neue Serie in einer vorhandenen Studie im Browser. Füllen Sie alle erforderlichen Informationen (Besitzer, Studie, Serie, Daten aus Tierversuchen) im Studium Info -Fenster. Klicken Sie auf Ok.
  4. Nach einem Klick auf Ok, damit Image Fenster B-Modus erscheint und beginnt automatisch mit der Bildgebung im B-Modus.

(3) Maus-Handling

  1. Anesthetization der Maus
    1. Platzieren Sie den Mauszeiger im Feld Knockdown (Abbildung 1E), schließen Sie das Öffnen Sie Isofluran Rohres der Knockdown Box und schalten Sie die Isofluran (Konzentration 3,5 %).
    2. Wenn die Maus narkotisierten, niedriger (bis 1,5 % Konzentration) und leiten die Isofluran Ablauf durch das Rohr in die Richtung der Heizung Plattform öffnen und schließen den Fluss zum Feld Niederschlag.
      Hinweis: Um ausreichende Anästhesie zu erreichen, warten Sie weitere 10 s nach die Maus nicht mehr bewegt.
    3. Übertragen Sie die Maus schnell aus dem Ko-Feld auf die Heizung-Plattform (Abb. 1F) in eine Rückenlage und positionieren Sie sanft seine Nase in der Anästhesie-Nase-Röhre auf der Oberseite der Plattform.
  2. Fixierung, Enthaarung und Vorbereitung der Maus für die Messung
    1. Augenschutz Creme in jedes Auge der Maus, um zu verhindern, dass trockene Augen zu platzieren.
    2. Geben Sie einen Tropfen Elektrodengel auf jeder der vier Kupferflächen auf der beheizten Plattform (Abb. 1F).
    3. Tippen Sie auf die Pfoten mit chirurgischen Klebeband auf die Gel-beschichtete Elektrodenflächen der Heizung-Plattform.
    4. ECG zu überprüfen [optimalen Wert = 450-550 Schläge/Minute (BPM)] und Atmungsphysiologie zu allen Zeiten.
      Hinweis: Mithilfe einer rektale Sonde Körper Temperaturmessung ist möglich, aber nicht notwendig.
    5. Ort Enthaarungsmittel Creme auf den Bauch der Maus, Rub die Creme mit einem Wattestäbchen und warten ca. 1 min. Entfernen Sie die Creme mit Wasser getränkten Kompresse. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn nicht alle Haare verschwunden sind.
    6. Das vorgewärmte Ultraschallgel auf die enthaarten Haut auftragen.

4. Messungen und Erwerb von Bildern und Videos

  1. Die Wandler (Abbildung 1) in der Hand halten oder Klemmen Sie es in die Haltevorrichtung (Abbildung 1 H; halten, Gerät wird empfohlen).
  2. Identifizieren Sie die Blase mit der Wandler und verwenden Sie es als Bezugspunkt. Bewegen Sie den Schallkopf zu den linken und rechten Seiten des Bauches, Spur Implantationen.
  3. B-Modus für die Visualisierung von anatomischen Strukturen in 2D Graustufenbild
    1. Bewegen Sie den Schallkopf oder Heizung Plattform Tisch wo die Maus fixiert, ist bis die erste Implantation sichtbar auf dem Bildschirm in der größten Größe ist.
      1. Wählen Sie Bild-Beschriftung und geben Sie einen Namen oder Frame Store (Lagerung ohne Namen) zum Speichern von Einzelbildern oder Cine Store eine Cineloop für ganze Implantation Messungen speichern.
    2. Bewegen Sie den Schallkopf oder Tabelle, die die Plazenta um eine Position zu bringen, wo die Durchblutung in den oberen Speicherbereich sichtbar ist. Ein einzelnes Bild oder Cineloop zu speichern (siehe Schritt 4.3.1.1) für plazentare Messungen.
      Hinweis: Plazentale Messungen sind möglich von gd10 ab.
    3. Fahren Sie mit allen Implantationen mit der gleichen Methode.
  4. Color doppler-Modus zu visualisieren und bestimmen Sie die Richtung des Blutflusses
    1. Drücken Sie die Schaltfläche " Farbe ".
    2. Bewegen Sie das Farbfeld (in diesem Bereich ist das Signal sichtbar) in die gewünschte Position mit dem Trackball. Falls erforderlich, ändern Sie die Größe des Feldes durch Update drücken und bewegen Sie den Trackball (auf der rechten Seite/nach oben = größer, auf der linken Seite/unten = kleiner). Wenn die Box die richtige Größe hat, drücken Sie wählen.
    3. Einzelbilder oder Cineloops zu speichern, wie in Schritt 4.3.1.1 beschrieben.
  5. Pulswelle (PW) doppler-Modus, Blutfluss durch die Gefäße in die Arteria Uterina (uterine Arterie, UA) zu quantifizieren und UmA
    1. Suchen Sie die Region von Interesse in der Farbe doppler Erwerb.
      Hinweis: Die UA liegt kaudalen in die Blase und der oberen Speicherbereich befindet sich zwischen dem Fötus und Plazenta.
    2. Presse PWund eine gestrichelte Linie erscheint. Verschieben Sie diese Zeile in das Blutgefäß von Interesse und stellen Sie den Winkel der Linie mit dem Knopf "Doppler-Winkel" im Einklang mit den Blutfluss. Drücken Sie auf Update.
      Hinweis: Der Winkel zwischen der Richtung des Blutflusses und der Wandler muss bei allen Tieren, konsistent sein, insbesondere bei Verwendung von mehr als 60 ° Winkel (hier 70° für UAs und 45° für UmAs verwendet wurden).
    3. Speichern Sie eine Cineloop der erscheinenden doppler Linien in der PW doppler Erfassungsfenster.

5. Überprüfung und Abschluss der Datenerfassung und speichern eine Reihe

  1. Um Daten zu überprüfen, drücken Sie Studienmanagement. Wählen Sie die Miniaturansicht von Interesse und doppelklicken Sie auf Update.
  2. Drücken Sie zuerst Studienmanagement dann nah im Browser-Fenster zur Datenerfassung beenden und speichern Sie eine aufgezeichneten Serien.
    Hinweis: Nach dem Schließen einer Reihe, ist es nicht zum Speichern von Frames oder Cineloops in dieser Serie nicht mehr möglich.

6. Umgang mit Übernahme von Daten der Maus

  1. Entfernen Sie das Gel vom narkotisierter Tier mit Hilfe der trockenen Kompressen.
  2. Nehmen Sie die chirurgische Klebeband vorsichtig aus der Pfoten.
  3. Schließen Sie das Isofluran-Rohr (Konzentration 0 %).
  4. Fahren Sie mit folgenden Ultraschall-Analyse bei gd5, 8, 10 und 12.
    1. Legen Sie das Tier allein in einem Käfig für ein Minimum von 5 min so es ist Zeit aufzuwachen und zu orientieren.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den ursprünglichen Käfig.
      Hinweis: Schalten Sie nicht den Isofluran vor Entfernen der Gel und chirurgische Band, da Mäuse sehr schnell aufwachen (ca. 20 s) nach dem Ausschalten der Isofluran.
  5. Fahren Sie mit der folgenden Ultraschall-Analyse bei gd14.
    1. Das Weibchen zu opfern, bevor es durch zervikale Dislokation aufwacht. Öffnen Sie das Tier, entfernen Sie die Gebärmutter zu, trennen Sie die Föten und der Plazenta und Messen Sie fetalen und plazentaren Gewichte zu.

7. kopieren und Importieren von Daten

  1. Markieren einer oder mehreren Reihen durch Klicken auf Exportieren nach und wählen Sie den Speicherplatz, Daten auf eine Festplatte zu kopieren.
  2. Öffnen Sie die Software auf einem Computer und klicken Sie auf Kopieren aus und wählen Sie die Studienreihe von der Festplatte auf eine Studienreihe in die Software importieren.
  3. Analysieren Sie die Daten mit der Software.

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Ergebnisse

Einzelkomponenten der Ultraschall-System verwendet in dieser Handschrift sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt Vertreter Ultraschallbilder im B-Modus zu gd5, 8, 10 und 12 (B) und entsprechenden Implantation Flächenmessung Ergebnisse (A), zeigen einen deutliche reduzierte Implantation Bereich erworben Anti-CD122-behandelten Cpa3Cre / + Mäuse aus gd10 ab.

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Diskussion

Mit unserem Ultraschallsystem haben wir bewiesen fetale Wachstumsretardierung bei MC/NK-defizienten Müttern aus gd10 auf. Darüber hinaus bei gd10 und 12, wir beobachteten reduzierte plazentare Abmessungen und bei gd14 das Fehlen oder die Umkehrung der Ende diastolischer Strömung in die UmAs einige Föten von uMC/uNK-defizienten Mäusen. Dieses Zeichen der schlechten Vaskularisation war verbunden mit einem nennenswerten Widerstand Index der Arterien IUGR angibt. Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der uMCs und uNKs in ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Vielen Dank an die Imaging Instrument Company (insbesondere für Magdalena Steiner, Katrin Suppelt und Sandra Meyer) für ihre angenehme und schnelle Unterstützung und alle unsere Fragen bezüglich der Imaging-System und dessen Nutzung unverzüglich und vollständig zu beantworten. Wir sind dankbar, Prof. Hans-Reimer Rodewald und Dr. Thorsten Feyerabend (DKFZ Heidelberg, Deutschland) für die Bereitstellung der Cpa3-Kolonie. Darüber hinaus bedanken wir uns bei Stefanie Langwisch, wer war verantwortlich für die Maus-Kolonien und generiert, die die Bilder in Abbildung 1.

Die Arbeit und das Imaging System wurden durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), A.C.Z. (ZE526/6-1 und AZ526/6-2) finanziert, die Projekte eingebettet in die DFG Priorität Programm 1394 "Mastzellen in Gesundheit und Krankheit."

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)BioLegend123204Klon TM-β 1; 500 & Mikro; g
Vevo 2100 System  FujiFilm VisualSonics Inc.Wandler  MS550D-0421
Vevo LAB Software  FujiFilm VisualSonics Inc.
IsofluranBaxterPZN: 6497131
ElektrodengelParker12_8
OP-Band3M Transpore1527-1
AugencremeBayerPZN: 1578675
Applikatoren mit WattespitzeRaucotupf11969100 Stück
EnthaarungscremeReckitt Benckiser
KompressenNobamed Paul Danz AG85611010 x 10 cm
UltraschallgelGello GmbH246000
2077626

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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