Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.
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Methodenartikel
Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In der Leber Lymphgefäße befinden sich innerhalb des Portals Dreiklang, und ihre beschriebene Funktion soll interstitielle Flüssigkeit aus der Leber, die Lymphknoten zu entfernen, wo Zelltrümmer und Antigene befragt werden. Wir sind sehr daran interessiert, zu verstehen wie das lymphatische Gefäßsystem in Entzündung und Immunzelle Funktion innerhalb der Leber beteiligt sein könnten. Jedoch sehr wenig veröffentlicht wurden zur Gründung Verdauung Protokolle für die Isolierung von lymphatische Endothelzellen (LECs) aus der Leber oder spezifischer Marker, die verwendet werden, um die Leber zu bewerten LECs pro Zelle. Daher haben wir eine Methode für die Verdauung und das Beflecken der Leber für die Beurteilung die LEC-Bevölkerung in der Leber optimiert. Wir sind zuversichtlich, dass die hier beschriebene Methode nützlich für die Identifizierung und Isolierung von LECs aus der Leber ist und stärkt unser Verständnis wie LECs auf die Leber Mikroumgebung reagieren.
Einleitung
Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber1 und Krankheit2auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs3gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierte....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
- Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien.
- Wärmen Sie die Verdauung Mischung bei 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch.
- Machen eine Isolierung Puffer durch Zugabe von 4,8 % Rinderserumalbumi....
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Ergebnisse
Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vorarbeite.......
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Diskussion
Die allgemeine Bedeutung der LECs immun Homöostase und Verordnung ist vor kurzem zum leichten25gekommen. Ein Großteil der veröffentlichten lymphatischen Literatur konzentriert sich auf Haut und Lymphknoten; Allerdings Lymphgefäße findet man überall in den Körper-26 und unser Verständnis ihrer Bedeutung in verschiedenen Organen ist also erforderlich. Hier zeigen wir eine Methode in der LECs in der Leber untersucht werden können auf eine Zelle für Zelle Basis ihren gleichzeit.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten den GI und Leber angeborene Immune Programme für finanzielle Unterstützung dieses Projektes danken. B.A.J.T. wird auch von R01 AI121209 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 Anti Maus CD146 (Klon ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC Anti-Maus CD146 (Klon ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanat (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31 (Klon 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31 (Klon 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-Chlorophyll Proteine-Cyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (Klon 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), Podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC Anti-Maus CD16/32 (Klon 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanat (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 Anti-Maus CD16/32 (Klon 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-Chlorophyll-Proteine-Cyanin 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| Ghost Red 780 Lebensfähigkeitsfarbstoff | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrischer Hamster IgG (Klon SHG-1) | Bioleged | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 Ratte IgG2a (Klon RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC Ratte IgG2 (Klon eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti-Maus LYVE1 (Klon 223322) | R& D-Systeme | FAB2125A | |
| Anti-Maus Cytokeratin (Klon EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| Anti-Maus F4/80 (Klon Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (Fraktion V) | Fischer | BP1600-100 | Rinderserum Albumin (BSA) |
| Ziegenserum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Eselsserum | Jackson Immunforschung | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -für Erythrozyten-Lysepuffer |
| Ammoniumchlorid | Fischer | A687-500 | für Erythrozyten-Lysepuffer |
| Kaliumbicarbonat | Fischer | P184-500 | für Erythrozyten-Lysepuffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μ m-Zell-Sieb | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | im Haus/ATCC | ATCC HB-197 | FC-Block zur Hemmung der unspezifischen Bindung an Fc-gamma+-Zellen -hergestellt aus Hybridom |
| Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| 96-Well-Platte | Corning | 3788 | |
| 6-Well-Platte | Corning | 3506 | |
| 50 mL konisch | Truline | TR2004 | |
| 15 mL konisch | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipettenspitze | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 & micro; L Pipettenspitze | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µ L Pipettenspitze | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriologisch 10 mL Pipette | Greiner bio-one | 607107 | |
| seriologisch 5 mL Pipette | greiner bio-one | 606107 | |
| Zellinkubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II Durchflusszytometer | BD Biosciences | ||
| Klinische Zentrifuge | Beckman Schar | Modell X-14R |
Referenzen
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
