Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber¹ und Krankheit²auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs³gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen^{4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen^14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie¹⁷LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs¹⁸bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.

Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen¹⁹, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen¹⁸ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 - CD31 + und Podoplanin + (PDPN)¹⁶. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 - CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs¹⁸) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen²⁰ mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen²¹) wurden Kandidaten Marker.

Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
2. Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien.
3. Wärmen Sie die Verdauung Mischung bei 37 ° C für 30 min vor dem Gebrauch.
4. Machen eine Isolierung Puffer durch Zugabe von 4,8 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), Hanks ausgewogenen Salzlösung (HBSS).
5. Lyse der Erythrozyten (RBC) Puffer zu machen, durch Zugabe von Ammoniumchlorid 100 mM, 10 mM KHCO₃und 0, 1 mM EDTA, H₂O. destilliert

2. Vorbereitung einer einzelligen Suspension aus einer Maus-Leber

1. Die Maus mit CO₂ und zervikale Dislokation einschläfern.
2. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol zu sein Fell nass. Heften Sie der Maus Füße eine Dissektion Board.
3. Mit einer Dissektion Schere schneiden Sie die Haut ca. 1 cm über den After, achten Sie darauf, nur durch die Haut (ca. 1 mm) schneiden. Ziehen Sie die Haut vom Körper weg mit gezahnten Zangen und legen Sie die Schere zwischen Haut und Bauchfell. Öffnen Sie die Schere um das Peritoneum die Haut trennen und dann schneiden Sie die Haut vor dem Einschnitt an den Hals.
4. Heften Sie die Haut um die Dissektion-Board mit einem Pin unter jeden Arm und jedes Bein. Die Peritonealdialyse Sac hochziehen und nach oben in Richtung Hals geschnitten. Schnappen Sie sich die Lappen der Leber und schneiden nur unter dem Brustbein.
   Hinweis: Vorsicht ist geboten werden, wenn eines der Leber für Immunhistochemie (IHC) verwendet wird.
5. Um die Leber schneiden Sie und entfernen Sie die Leber von der Maus und legen Sie sie in 4 mL klicken Sie auf die EHAA Medien.
6. Mit einem Skalpell schneiden Sie die Leber in ~ 1 mm Durchmesser Stücke.
7. Hinzufügen von 500 µL der Verdauung Mischung und 500 µL der DNase I (2 mg/mL), um die Leber.
8. Inkubieren Sie die Leber für 30 min bei 37 ° c Mischen Sie nach 15 min die Flüssigkeit mit einer 5 mL-Pipette.
9. Übertragen Sie nach 30 min Inkubation verdaute Probe durch ein 100 µm-Sieb auf eine 50 mL konische Rohr.
10. Schieben Sie die restlichen Stücke durch den Filter mit den Kolben einer 1-mL-Spritze.
11. Waschen Sie den Filter mit 5 mL Isolierung Puffer und schieben Sie das Gewebe durch das Sieb mit der Rückseite des einen Kolben aus eine 1 mL Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Filter mit 25 mL Isolierung Puffer gewaschen wird.
12. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g , für 5 min. sorgfältig aus der Überstand abgesaugt.
13. Das Pellet mit 4 mL des RBC Lyse Puffer aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 5 min bei Raumtemperatur.
14. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
15. Zählen der Zellen auf eine Hemocytometer um die Anzahl der vollen Leber festzustellen.
16. Aufschwemmen Sie Zellen in 5 mL 20 % Iodixanol und Ebenen Sie anordnen mit 1 mL PBS.
17. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 15 min ohne Bremse.
18. Entfernen Sie die Schicht zwischen der PBS und der Iodixanol, und legen Sie sie, durch einen 100 µm-Filter in ein neues 50 mL konische Röhrchen.
19. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL Isolierung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 5 Minuten.
20. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS).

(3) durchflusszytometrischen Analyse einzelner Zellen aus der Leber

1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und einem Mikroskop verwenden Trypan blau Ausgrenzung, um lebensfähige Zellen zu messen. 10 µL Trypan blau 10 µL der Zellen hinzufügen und sofort auf ein Hemocytometer legen und die lebenden Zellen (nicht blau) unter dem Mikroskop zählen. Dann berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Mikroliter.
2. Etwa 5 Millionen Aliquot der verbleibenden Nonparenchymal Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min.
4. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 90 µL PBS mit 2 % FBS.
5. Hinzufügen von Anti-CD45 (1: 200), Anti-CD146 (1: 200), Anti-CD31 (1: 200) und PDPN (1: 200) in 10 µL 10 x 2.4G2 oder Anti-CD16/32 (1: 200) verdünnt.
   Hinweis: Kein Fc-Block (2.4G2) diente als Anti-CD16/32-markierten Antikörper verwendet wurde.
6. Um festzustellen, wo positive und negative Toren festgelegt werden soll, gehören Sie eine Fluoreszenz minus 1 (FMO) Fleck für jede Farbe und einen Isotype Kontrolle Antikörper.
7. Um live gegen abgestorbene Zellen zu bestimmen, färben Sie mit einem Lebensfähigkeit Marker (z. B. Ghost rot 780). Inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C für 30 min.
8. Waschen Sie die Zellen mit 100 µL PBS mit 2 % FBS.
9. Verwenden Sie eine kleine aliquoten Zellen um die Einstellungen für Laser und Entschädigung auf das Durchflusszytometer anzupassen. Färben Sie die Zellen mit einem Antikörper zu jeder einzelnen Fluorophor und ohne irgendwelche Antikörper.
   Hinweis: Je nach dem Durchflusszytometer verwendet wird sollte eine Vergütungsmatrix eingerichtet werden, um spektrale Überlappung zu entfernen.
10. Legen Sie das Probenröhrchen auf die Cytometer Sonde und sammeln zeichnen Sie alle Ereignisse auf.

(4) Datenanalyse

1. Blick auf Seite-Streuung vs. Forward Scatter Gegend, Tor auf "live" Zellen basierend auf Größe und Granularität und Lebensfähigkeit Marker-Farbstoff.
2. Als Nächstes verwenden CD45 brillant violett 510 und CD31 PerCp Cy5.5, Tor auf die CD45 - CD31 +-Zellen mit dem Isotype Kontrollen und FMO um zu positive und negative Populationen zu bestimmen.
3. Zu guter Letzt mit CD146 v450 oder CD16/32 FITC und PDPN APC, nehmen Sie den CD146 - PDPN + oder CD16/32-PDPN +-Zellen, wieder mit Isotype Kontrollen und FMO, um positive und negative Populationen zu bestimmen. Diese Zellen sind die LECs.

Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vorarbeiten erfolgte mittels Liberase DL (Kollagenase i-II-und-Dispase) und DNase-1 kombiniert mit der mechanischen Trennung von Lymphknoten Gewebe mit Nadeln14,16. Daher das gleiche Protokoll der Verdauung auf Lebergewebe diente oder Kollagenase IV und DNase-1 verwendet wurde, wie zuvor beschrieben, für Immunzelle isoliert von der Leber22 und die Verdauung mit einem Dichte Gradienten Trennung (Iodixanol) Schritt, gefolgt Entfernen von Hepatozyten und erhöhen Sie die Häufigkeit von anderen Zelltypen innerhalb der Leber (Abbildung 1A). Nach Leber Verdauung und Zentrifugation mit der Dichtegradient wurden die Zellen mit CD45, CD31, PDPN und CD16/32 gebeizt. CD16/32 ist beschrieben worden, um durch ausgereifte LSEC Bevölkerungen, aber nicht LEC Populationen18ausgedrückt werden. So wurden LECs als CD45-CD31 + CD16/32 gated-, PDPN + Zellen, während LSECs als CD45-CD31 + CD16 eingezäunt waren / 32 + und PDPN-(Abbildung 1A). Tore waren auf lebende Zellen (rote Geist negativ) und basierend auf Isotype Kontrollen und FMO Färbung (Abbildung 1A). LYVE-1 APC auf der LEC-Bevölkerung wurde auch bestätigt (Abbildung 1 b). Beide Methoden erlaubt die Visualisierung der LEC Bevölkerung innerhalb der Leber; die Färbung Profil der Zellen war jedoch optisch besser, bei der Verwendung von Kollagenase IV und DNase-1 als Kollagenase ich-II-und-Dispase (Abbildung 1). Daher wurden alle zukünftigen Manipulationen durchgeführt mit Kollagenase IV und DNase-1, wie im Protokoll beschrieben. Im Durchschnitt erhielten wir rund 1.300 LECs pro Gramm des Lebergewebes oder 2.200 LECs pro naiv Leber, mit dieser Methode der Verdauung.

Zur Optimierung der gating-Strategie und die Kombination von Fluorophore und Kontamination von LSECs zu beseitigen, wurden CD16/32 und CD146 verwendet. CD16/32 ist Fc-Gamma-Rezeptoren II und III und drückt sich auf ältere LSECs aber nicht auf LECs18. CD16/32 könnte unterscheiden die PDPN + CD16/32-Zellen aus dem PDPN-CD16 / 32 + Zellen, vor allem wenn APC oder PE konjugiert mit PDPN und CD16/32 konjugiert, FITC (Abbildung 1A), aber weniger gut als PDPN an PE-Cy7 (Abbildung 1) konjugiert war. Der Ausdruck des CD16/32 befindet sich nicht auf LECs jedoch findet sich auf LSECs. FC-Block verwendet den CD16/32-Antikörper, um die Fc-Rezeptor-Bindung und Nonantigen spezifische Bindung der Immunglobuline an die Fc-Rezeptoren zu minimieren. Da CD16/32 verwendet wurde, um LSECs zu visualisieren, die unspezifische Bindung von Immunglobulinen war höher und CD146 als Alternative zur LSECs Messung optimiert wurde. Daher haben wir CD146 konjugiert, V450, hoch von LSECs und anderen vaskulären endothelialen Zellen20 , aber mit niedrigen bis kein Ausdruck von LECs23geäußerten vaskulären endothelialen Zellen Marker getestet. Wir zunächst optimiert die Färbung des CD146 mit Steuerelementen FMO und Isotype für CD16/32 und CD146 (Abbildung 2A). Wenn wir nur die CD16 ausgewertet / 32 + Zellen oder die CD16/32-Zellen, die CD16 / 32 + Zellen waren alle CD146 + / PDPN, während die CD16/32-Zellen in erster Linie CD146 - und PDPN- oder PDPN + (Abb. 2 b waren). Um zu bestätigen, diese Färbung, diente der FMO. PDPN aus den Fleck zu entfernen, verschwunden die PDPN + Bevölkerung (Abbildung 2). Interessanterweise gab es keine CD146 + PDPN + Zellen, bestätigt, dass CD146 nicht oder sehr gering durch PDPN + LECs zum Ausdruck kommt. So sind wir zuversichtlich, dass entweder dieser Marker verwendet werden kann zum Tor, vaskulären endothelialen Zellen in der Leber.

Um weiter zu validieren, dass PDPN einen geeigneten Marker für LECs, waren Leber Abschnitte von Mäusen mit PDPN (grün) und F4/80 (braun) (Abbildung 3A) gefärbt. Gefäßendothels weder die Makrophagen in der murinen Leber PDPN ausgedrückt. Wir waren auch in der Lage, Cholangiocytes, zu unterscheiden, die für PDPN von Lymphgefäße, basierend auf unterschiedlichen atomaren Strukturen der Gallengänge und von Cytokeratin 7 Färbung positiv beflecken können (Abbildung 3 b; rot: Cytokeratin 7, grün: PDPN). Da mehrere Marker für Durchflusszytometrie, z. B. CD31, verwendet werden, die nicht durch Cholangiocytes24ausgedrückt wird, sind wir zuversichtlich, dass wir sind Zellen aus der Analyse entfernt, dadurch bestätigt, dass Zellen aus der Leber, die CD45-CD31 + CD146 Lo/Neg, CD16/32-, und PDPN + LECs sind. Schließlich um nachzuweisen, dass die gefärbten Zellen LECs sind, sortiert diese Population von Zellen und qualitative Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion verwendet, um die Vegfr3 und Prox-1 Ausdrücke auswerten. Vegfr3 und Prox-1 wurden ausgewertet, da diese Protokolle von anderen Zellen in der Leber exprimiert werden —prox1 von Hepatozyten und Vegfr3 von LSECS (unter anderem) – aber keine anderen Zellen neben LECs express beide. Der Ausdruck dieser beiden Marker war signifikant höher in der sortierten Bevölkerung als in der kultivierten murinen Makrophagen-Zell-Linie (RAW264.7) die drückt diese Markierungen nicht normalerweise, aber ähnlich im Ausdruck kultivierten murinen LECs (Abbildung 3 ).

Abbildung 1 : Repräsentative Flow Cytometry Analyse Kollagenase ich-II-Dispase und Kollagenase IV verdaut murinen Lebergewebe. (A) dieses Panel zeigt die gating Strategie, Fluoreszenz abzüglich einer Färbung und Isotype regelt das Verfahren. (B) dieses Panel zeigt die LYVE-1-Färbung des CD16/32-PDPN +-Zellen. (C) dieser Bereich zeigt die endgültige Flow Cytometry Tor nach Maus Lebern mit entweder Kollagenase ich-II-Dispase (z.B., Liberase DL) zu verdauen oder Kollagenase IV und Bewertung CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 wo LECs CD16/32 sind- und PDPN +. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Identifikation von CD146 und PDPN als geeignete Marker für Leber lymphatische Endothelzellen. (A) dieses Panel zeigt Fluoreszenz minus eins und Isotype Steuerelemente für CD16/32 (links) und CD146 (rechts). (B) zeigt dieses Panel gated CD16/32 positive oder negative Zellen aus Panel Aermittelt. Dargestellt ist CD146XPDPN aus beiden Populationen. (C) zeigt dieses Panel Fluoreszenz minus eins für PDPN zu zeigen, dass die Färbung ist nicht vorhanden, wenn die Antikörper nicht hinzugefügt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Identifikation des Flusses PDPN + Zellen als lymphatische Endothelzellen. (A) dieses Panel zeigt repräsentative Immunohistochemistry von einer Maus Leber gebeizt mit PDPN (blau/grün) und F4/80 (braun). Das Lymphgefäßsystem (LV), Blutgefäß (BV) und Makrophagen (MF) sind gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 100 µm. Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebe war für 20 Minuten in Xylol entparaffiniert. Gewebe wurden durch einen Farbverlauf von Ethanol Wasser hydratisiert und Antigen-Retrieval erfolgte mittels pH 6 Antigen Abruf Puffer in einem Schnellkochtopf für 15 min. Gewebe blockiert wurde mit 0,1 % BSA und befleckt mit Anti-Maus-PDPN und Anti-Maus F4/80 für 1 h bei Zimmer Temperatur. Anti-Hamster IgG HRP und Anti-Kaninchen-IgG-HRP dienten als sekundäre Antikörper. 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) + und Vina grün wurden verwendet, um die F4/80 und PDPN, bzw. zu erkennen. Gewebe wurde counterstained mit Hämatoxylin und am Mikroskop abgebildet. (B) dieses Panel zeigt das gleiche Experiment durchgeführt wie in Feld A, außer hier, PDPN in grün, Cytokeratin 7 in rot und 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in blau angezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. Gewebe wurde blockiert, mit 5 % Esel und 5 % Ziegenserum und befleckt mit Anti-Maus PDPN (8.1.1) 1: 100 und Anti-Maus Cytokeratin 7 1: 200 für 1 h bei Raumtemperatur. Anti-Hamster AF647 IgG und Anti-Kaninchen IgG-PE dienten als sekundäre Antikörper. Gewebe wurde counterstained mit DAPI und abgebildet. Maßstabsleiste = 100 µm. Das Lymphgefäßsystem (LV), Blutgefäß (BV) und Gallenwege (BD) sind gekennzeichnet. (C) dieses Panel zeigt eine Log-Falte ändern in Vegfr3 und Prox-1 Ausdruck von sortierten Leber LECs basierend auf die Färbung des Protokolls (CD45 - CD31 +, CD146lo/Negund PDPN +) im Vergleich zum RAW Zellen oder primären murinen Lymphknoten LECs. Sortierte Zellen wurden durch ein Biopolymer-Schreddern-Spalte übergeben, RNA wurde mit einem RNA-Extraktion-Kit extrahiert und cDNA erfolgte mit einem reversen Transkription-Kit. Transkript Fülle wurde auf das Zimmermädchen-gen, Gapdh, für jede Probe normalisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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