Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in Lymph- und Leberfeldern zu beantworten, wie z. B. wie lymphatische Endothelzellen oder LECs auf bestimmte Reize reagieren und wie dies zur Pathogenese bei Krankheiten beiträgt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir den phänotyp und die Funktion der Leberlymphe-Endothelzell-Phänotyp und -funktion pro Zelle bewerten und nach der Zellsortierung für Down-Stream-Anwendungen eingesetzt werden können. Obwohl diese Methode Einblick in die Leberlymphbiologie geben kann, kann es auch verwendet werden, um lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Geweben, wie Haut und Brustdrüse zu bewerten.

Demonstriert wird das Verfahren von Jeffrey Finlon, einem professionellen wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor. Um eine einzellige Suspension aus isolierten Leberzellen vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Maus mit siebzig Prozent Ethanol zu besprühen und die Pfoten an einer Sezierplatte zu sichern. Verwenden Sie eine Sezierschere, um die Haut etwa einen Zentimeter über dem Anus zu schneiden und die Haut mit Zahnzangen vom Körper wegzuheben.

Legen Sie die Scherenspitzen zwischen der Haut und dem Peritoneum ein und öffnen Sie die Schere, um das Gewebe zu trennen, bevor Sie den Hautschnitt bis zum Hals fortsetzen. Befestigen Sie die Haut an der Sezierplatte unter jedem Vorderglied und über jedem Hinterglied, und ziehen Sie den Peritonealsack nach oben, um den Schnitt in Richtung des Halses zu verlängern. Greifen Sie die Lappen der Leber und schneiden Sie direkt unter dem Brustbein, um eine Zerlegung um die Leber zu ermöglichen.

Dann übertragen Sie das Organ in vier Milliliter von Clicks EHAA-Medium. Verwenden Sie das Skalpell, um die Leber in etwa einen Millimeter Durchmesser Stücke zu schneiden und verdauen Sie die Stücke in fünfhundert Mikroliter frisch zubereitete Verdauungslösung und fünfhundert Mikroliter DNase 1. Nach fünfzehn Minuten bei siebenunddreißig Grad Celsius, verwenden Sie eine fünfhundert Milliliter Pipette, um das Gewebe gründlich zu mischen und den Behälter für weitere 15 Minuten in den Inkubator zurück.

Am Ende der Inkubation die verdaute Probe durch ein hundert Mikron Sieb in ein fünfzig Milliliter konisches Rohr übertragen und den Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze verwenden, um die restlichen Gewebestücke vorsichtig durch das Netz zu drücken. Waschen Sie den Filter mit fünf MilliliterN Isolationspuffer und drücken Sie das verbleibende Gewebe vorsichtig durch das Sieb. Sammeln Sie die isolierten Leberzellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in vier Millilitern roter Blutkörperchen Lysepuffer wieder auf.

Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen in zehn Milliliter Isolationspuffer waschen und die Zellen auf dem Hämozytometer zählen, um die volle Leberzahl zu bestimmen. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter n.20 Prozent Iodixanol wieder auf und überlagern Sie die Zellsuspension mit einem Milliliter PBS. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradiententrennung und ernten Sie die Schicht zwischen dem PBS und dem Iodixanol.

Dann filtern Sie die Zellen durch ein hundert Mikrometer Sieb in eine neue fünfzig Milliliter konische Röhre. Waschen Sie die Zellen in zehn Milliliter nfrischem Isolationspuffer und setzen Sie das resultierende Pellet in fünfhundert Mikroliter PBS wieder auf, ergänzt durch zweiprozentige fetale Rinderserum oder FBS. Nach dem Zählen, aliquot etwa fünf mal zehn bis die sechste nicht-parenchymale Zellen in jeder Kontrolle und experimentellen Brunnen einer neunundneunzig Brunnenplatte für zentrifugation und re-suspend die Pellets in neunzig Mikroliter PBS plus FBS pro Brunnen.

Fügen Sie die entsprechenden experimentellen und kontrollierenden Primärantikörper-Cocktails zu jedem Brunnen hinzu und färben Sie alle Brunnen mit einem geeigneten Lebensfähigkeitsmarker. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die richtige Titration der Antikörper und die Verwendung von Eistyp-Kontrollen und Fluoreszenz-1-Kontrollen, um die Färbung zu validieren. Nach dreißig Minuten bei vier Grad Celsius waschen Zentrifuge die Zellen mit hundert Mikroliter PBS plus FBS pro Brunnen und übertragen die Zellen von jedem Bohrplatz in einzelne Fünf-Milliliter-Rund-Boden-Flow-Zytometrie-Röhren auf ein vierhundert Mikroliter Endvolumen von PBS plus FBS pro Tube.

Verwenden Sie dann ein kleines Volumen von Zellen, um die Laser- und Kompensationseinstellungen auf dem Durchflusszytometer anzupassen und alle Ereignisse für jede Röhre zu lesen. Wenn alle Rohre gelesen wurden, importieren Sie die Daten in ein entsprechendes Analyseprogramm für die Durchflusszytometrie. Gate auf lebenden Zellen basierend auf der Lebensfähigkeit Marker Farbstoff, wo negative Expression als lebend betrachtet wird.

Gate auf den lebenden Zellen basierend auf der Größe und Granularität der Zellen sowie ihrer Lebensfähigkeit Marker Farbstoffexpression, gefolgt von Gating auf der CD45 negative CD31 positive Zellpopulation mit der entsprechenden Isotyp-Kontrolle und Fluoreszenz-1-Daten, um die positiven und negativen Populationen zu bestimmen. Dann gate die CD45 negative CD31 positive Zellen nach ihrer CD16/32 und Podoplanin-Expression, um die Identifizierung der CD45 negative CD31 positive, CD16/32 negative Podoplanin positive lymphatische endotheliale, und CD45 negative CD31 positive, CD16/32 positive Podoplanin negative Leber sinusoidal endotheliale Zellpopulationen zu ermöglichen. Emphatische Endothelzellen drücken lymphatische Gefäß und endotheliale Hyaluronan ein, aber nicht CD146.

Leberisolierte CD31-positive CD16/32-positive, wie gezeigte cd146-positive und podoplanin-positive, während die CD31-positiven CD16/32-Negativzellen in erster Linie CD146-negativ und entweder podoplaninpositiv oder negativ sind. Die Positivität wurde auf der Grundlage der Fluoreszenz-1-Färbung bestimmt. Die Leberlymphatische Endothelzellen sind CD146 negativ und PDPN-positiv.

Weder das vaskuläre Endothel noch die murinen Lebermakrophagen drücken Podoplanin aus. Podoplanin Färbung kann auch verwendet werden, um Cholangiozyten von Lymphgefäßen basierend auf den unterschiedlichen kerntechnischen Strukturen der Gallengänge sowie durch Cytokeratin 7 Färbung zu unterscheiden. Da nur lymphatische Endothelzellen den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 und das Prospero-Homeobox-Protein 1 in der Leber ko-expressieren, können diese Marker weiter verwendet werden, um die Reinheit der sortierten leberlymphen Endothelzellpopulation zu bestätigen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell zu arbeiten und Zellen auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Flusssortierung von LEC-Populationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. transkriptionelle Profilerstellung von LECs. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der leberspezifischen Lymphbiologie, um zu erforschen, wie Lymphatik Lebererkrankungen bei Mäusen und Menschen beeinflusst.

Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird kämpfen, weil lymphatische Endothelzellen sind eine seltene, allmähliche Bevölkerung in einer Leber und die Methode muss schnell durchgeführt werden.