Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.
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Methodenartikel
Raumzeitlich kontrollierte nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekulare Leime als Photoactivatable Tags
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. Im Käfig Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. Im Käfig Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.
Einleitung
Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische 1,2,3-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)4,5,6 allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jed....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Gäste mit KäfigKleber-R Stichwörter
- CagedKleber-NBD Lösung ansetzen.
- CagedKleber-NBD (Abbildung 1) nach dem Verfahren beschriebenen20zu synthetisieren.
- Bereiten Sie eine Stammlösung CagedKleber-NBD (10 mM) in trockenen Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
Hinweis: Bewahren Sie die Stammlösung in Dunkelheit. Die Lösung kann mit wässrigen Puffer oder Zellkulturmedien nach Gebrauch verdünnt werden.
- CagedKleber-QD Lösung ansetzen.
- Synthetisieren CagedKleber-Dibenzocylooctyne (Ca....
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Ergebnisse
Vor Photoirradiation, Hep3B Zellen inkubiert mit CagedKleber-NBD ausgestellt punctata Fluoreszenzemission von ihrem inneren (λExt = 488 nm; Abbildungen 4A und 4 C, grün). Eine analoge Schliffbild erhielt nach Anregung bei 543 nm für rot fluoreszierenden Farbstoff (Zahlen 4 b und 4 C, rot), darauf hinweist, dass CagedKleber-NBD in den Endosomen lokalisiert. Dement.......
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Diskussion
Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS7,8,9erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Diese Funk.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir anerkennen das Zentrum für NanoBio Integration, der University of Tokyo. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (26810046), K.O. und teilweise unterstützt von Beihilfe für speziell gefördert Forschung (25000005), t.a. r.m. Dank der Research Fellowships der Japan Society für die Förderung der Wissenschaft (JSPS ) für junge Wissenschaftler und das Programm für die führenden Graduate Schools (GPLLI).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Azid-PEG4-NHS-Ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| regenerierte Zellulosemembran (MWCO 3.500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Regenerierte Zellulosemembran (MWCO 25.000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B-Zellen | ATCC | HB-8064 | |
| 8-Kammer-Glassubstrat | Nunc | 155411JP | |
| 96-Well-Kulturplatte | Nunc | 167008 | |
| Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (D-PBS) | Wako Pure Chemical Branchen | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Carl-Zeiss | LSM 510 | Ausgestattet mit Zwei-Photonen-Anregungslaser (Mai Tai Laser, Spectra-Physics) |
| Konfokaler Laser Rastermikroskop | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon-Lichtquelle | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Mikroplatten-Reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
Referenzen
- Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
- Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
- Verma, I. M., Weitzman, M....
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Nachdrucke und Genehmigungen
