Der Locus Coeruleus ist eine kleine Ansammlung von Nervenzellen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Maus Gehirn Abschnitte auf das Studium der Proteine und Metalle in diesem Kern vorzubereiten.
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Methodenartikel
Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Locus Coeruleus (LC) ist ein bedeutender Knotenpunkt von Noradrenalin produzierenden Neuronen, die eine Reihe von physiologischen Funktionen zu modulieren. Strukturelle oder funktionelle Anomalien der LC Einfluss auf verschiedene Gehirnregionen einschließlich Kortex, Hippocampus und Kleinhirn und können dazu beitragen, Depressionen, bipolare Störungen, Angst, sowie Morbus Parkinson und Alzheimer-Krankheit. Diese Erkrankungen sind häufig mit Metall Ungleichgewichtigkeit verbunden, aber die Rolle der Metalle in LC ist nur teilweise verstanden. Morphologische und funktionelle Studien von LC sind erforderlich, um besser zu verstehen, die menschliche Pathologien und den Beitrag von Metallen. Mäuse sind ein weit verbreitetes experimentelles Modell, aber die Maus LC ist klein (~0.3 mm Durchmesser) und schwer zu erkennen, für nicht-Experten. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt Immunohistochemistry-basiertes Protokoll um die LC im Gehirn Maus zu lokalisieren. Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), und Alternativ Tyrosin Hydroxylase (TH), beide Enzyme, die hoch in den LC ausgedrückt werden als immunhistochemischen Marker in Hirnschnitten verwendet. Abschnitte neben LC-haltigen Abschnitte können zur weiteren Analyse, einschließlich Histologie für morphologische Studien, Ergospirometrie, sowie Metall-Bildgebung von Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM) verwendet werden.
Einleitung
Der Locus Coeruleus (LC) ist eine wichtige Region im Hirnstamm und ein wichtiger Standort von Noradrenalin (NE) Produktion1. Die LC sendet Projektionen im gesamten Gehirn2 an den Kortex, Hippocampus und dem Kleinhirn3 und regelt wichtige physiologische Prozesse, einschließlich zirkadianen Rhythmus4,5, Aufmerksamkeit und Gedächtnis6, betonen Sie7, kognitive Prozesse8und Emotion9,10. Dysfunktion des LC hat in neu....
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Protokoll
Studien von Tieren von Johns Hopkins Universität Animal Care und Nutzung (ACUC) Protokollnummer M017M385 gebilligt wurde.
1. Gehirn aufschneiden
- Um zu immobilisieren, Mäuse durch die Anwendung von 3 % Isofluran zu betäuben.
- Genießen Sie einen Wattebausch mit Tropfen Isoflurane und legen Sie sie in einem 15 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie das Tier Nase in das Rohr und lassen sie die Isofluran zu inhalieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Narkose durch den Mangel an Reaktion auf Zehe-Prise.
- Legen Sie das Tier auf dem Rücken und durch Festhalten der Extremitäten nach unten mit einem T-Pin beim Zugr....
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Ergebnisse
Änderungen in Metall Homöostase (z. B. Cu, Fe, Zn und Mn) werden oft in neurologische Störungen, einschließlich Änderungen in der LC-34,-35beobachtet. So ist die Bestimmung von Metall-Spiegel im Gehirn notwendig für das Verständnis der Krankheitsmechanismen. Die Gehirn-Abschnitte mit den beschriebenen Protokoll generiert können zur Quantifizierung der Ebenen von Cu und anderen Metallen in der LC und im Vergleich zu den Ebenen in R.......
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Diskussion
Richtig ausrichten der Probekörpers ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwendest, um LC (Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigen Colliculus) zu finden, ist es wichtig, dass die Teile richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei richtig einstellen das Gehirn in die Maus Gehirn Schneidemaschine Matrix. Es wird empfohlen, ~ 500 μm mehr Gewebe schneiden, Front- und Seitenzahnbereich, LC zu vermeiden, den Zellkern fehlt. Der häu.......
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Danksagungen
Wir danken Abigael Muchenditsi für die Wartung der Maus Kolonie. Verwendung von Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory wurde unterstützt von der US-Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften, unter Vertragsnummer: DE-AC02-06CH11357. Wir danken Olga Antipova und Dr. Stefan Vogt für User-Support und Unterstützung bei der Advanced Photon Source. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant 2R01GM101502 SL finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zivic Instruments | BSMAS001-1 | ||
| Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 (Quelle - Esel) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Objektträger aus geladenem Glas | Genesee | 29-107 | |
| Konfokalmikroskop | Zeiss | LSM 800 | |
| Kryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Kryostat Schneidklingen | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Schere Mini, 9,5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamin β-Hydroxylase (DBH) Antikörper - Eigenproduktion (Quelle - Kaninchen) | B. Eipper | - | |
| Dopamin β-Hydroxylase (DBH) Antikörper - kommerziell erhältlich (Quelle - Kaninchen) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon Röhrchen, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Foran (Isofluoran) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Pinzette Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset Einbettmedien | EM sciences | 17984-24 | |
| Mikroskop | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-Well-Platten, 24 Wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimale Schnitttemperatur Compound (OCT) | VWR/ Tissue Tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyd (PFA)/ Formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way Einweg-Einbettformen | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Bleistiftbürste | |||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Rasierklingen | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatel | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| Das Mäusegehirn in stereotaktischen Koordinaten, Paxinos und Franklin, 3. Auflage | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (zur Vorbereitung von PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper (Quelle - Kaninchen) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralen-Dünnschicht für RFA | SPEX Probenvorbereitung | 3525 | |
| Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
Referenzen
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
