Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen

Summary

Fehlende Standardisierung für murine Gewebe Verarbeitung reduziert die Qualität der murinen histopathologische Analyse im Vergleich zu menschlichen Exemplare. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur histopathologischen Untersuchung der murinen entzündet und uninflamed Kolon Gewebe auf die Machbarkeit von Robotersystemen routinemäßig verwendet für die Verarbeitung und Einbettung von humanen Proben durchführen.

Abstract

Das Verständnis der menschlichen Krankheiten wurde durch die Studie von Tiermodellen stark ausgebaut. Histopathologische Beurteilung der experimentellen Modellen muss allerdings so streng wie die Humanproben angemeldete sein. In der Tat, ist zuverlässig und präzise Schlussfolgerungen kritisch die Qualität des Gewebes Abschnitt Vorbereitung beeinflusst. Hier beschreiben wir ein Protokoll für histopathologische Analyse der murinen Geweben, die mehrere automatisierte Schritte während des Verfahrens, von der anfänglichen Vorbereitung zur Paraffin Einbettung der murinen Proben implementiert. Die Reduzierung der methodischen Variablen durch strengen Protokoll Standardisierung von automatisierten Verfahren trägt zur erhöhten Zuverlässigkeit der murinen pathologische Analyse. Insbesondere dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der automatischen Verarbeitung und Einbettung Robotersysteme, routinemäßig für die Gewebe-Verarbeitung und Paraffin Einbetten von humanen Proben zur murine Proben von Darmentzündungen zu verarbeiten. Wir schlussfolgern, dass die Zuverlässigkeit der histopathologischen Untersuchung der murinen Gewebe mit der Einführung des standardisierten und automatisierten Techniken deutlich erhöht wird.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt, um die pathogenen Mechanismen führen zu Krankheiten beim Menschen^1,2zu sezieren. Bei der Beurteilung die schwere einer Krankheit müssen Forscher bewerten die Wirkung einer Behandlung und der zytologischen und histologischen architektonische Variationen oder die Höhe der Entzündung³zu studieren. Um auf diesen experimentellen Modellen durchzuführen, sind detaillierte histopathologische Analysen nötig, oft vergleichen murinen und menschlichen Proben^4,5.

Protocol

Tierische Verfahren wurde vom italienischen Gesundheitsministerium (auth. 127/15, 27/13) genehmigt und folgte die Tierbetreuung Leitlinien des European Institute of Oncology IACUC (institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss)

1. chronische Kolitis Induktion durch sich wiederholende DSS-Verwaltung

1. Separate Alter und Geschlecht abgestimmt Mäuse in 2 Gruppen (Behandlung DSS vs. Kontrolle H₂O, mindestens 5 Mäuse Wurfgeschwistern pro Versuchsgruppe).
2. Verwalten von 2,5 % DSS (40 kDa) in das Trinkwasser für 7 Tage in der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe Wasser.
   Hinweis: Dieses Modell....

Results

Experimentelle chronischer Kolitis induziert durch wiederholte Gabe von DSS im Trinkwasser ist ein Mausmodell der Darmentzündung sehr ähnlich menschlichen IBD^8,9. Abbildung 1 beschreibt die Auswirkungen der DSS Behandlung, einschließlich Doppelpunkt Verkürzung (Abbildung 1A), einen weit verbreiteten Parameter, das Vorhandensein von DSS-induzierte Entzündung und Kolon Expr.......

Discussion

Wir nutzen verschiedene automatisierte Schritte bei der Vorbereitung der murinen Gewebe zur histologischen Analyse. Dieses Protokoll bezweckt die Erbringung von technischen Hinweise um die Reproduzierbarkeit und die Standardisierung des gesamten Prozesses, wodurch die Gesamtqualität der histopathologischen Abschlussbewertung zu steigern. Wir realisiert automatisierte Instrumente und Methoden für die Vorbereitung und Einbettung von Geweben, routinemäßig in Pathologie Kern Anlagen für die Erforschung der menschlichen Probe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol wasserfrei	Carlo Erba	414605	Reagenz
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L	Reagenz
Aluminium Kaliumsulfat	SIGMA	A6435	Reagenz
Anilinblau	SIGMA	415049	Reagenz
Carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	Reagenz
CD11b (Klon M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	Antikörper
CD20 IHC (Klon SA275A11)	Biolegend	150403	Antikörper
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	Antikörper
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	Antikörper
CD45.2 (Klon 104)	BioLegend	109837	Antikörper
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	Antikörper
Citrat Buffer pH 6 10x	SIGMA	C9999	Reagenz
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	Reagenz
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	Reagenz
DSS	TdB Consultancy	DB001	Reagenz
EDTA	SIGMA	E9884	Reagenz
EnVision Flex Peroxidase-Blocking-Reagenz	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrat	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	Reagenz
F4/80 (Klon BM8)	BioLegend	123108	Antikörper
Formalin	PanReac	2.529.311.215	Reagenz
Eisessig	SIGMA	71251	Reagenz
Ziegen-anti-Ratten-HRP	Agilent DAKO	P0448	Antikörper
Hämatoxylin	DIAPATH	C0303	Reagenz
LEICA Rotationsmikrotom (RM2255)	Leica	RM2255	Ausrüstung
Ly6g (Klon 1A8)	BD Biosciences	551459	Antikörper
Quecksilber II Oxid	SIGMA	203793	Reagenz
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	Reagenz
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	Reagenz
Orange G	SIGMA	O3756	Reagenz
Paraffin	Sakura	7052	Reagenz
Peloris	LEICA		Gerät
Percoll	SIGMA	P4937	Reagenz
RPMI 1640 ohne L-Glutamin		Microgem L0501-500	Reagenz
STS020	Leica		Gerät
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	Gerät
Tissue-Tek Automatisierter Paraffineinbetter	Sakura		Ausrüstung
Xylol	J.T.Baker	8080.1000	Reagenz