Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen

Summary

Fehlende Standardisierung für murine Gewebe Verarbeitung reduziert die Qualität der murinen histopathologische Analyse im Vergleich zu menschlichen Exemplare. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur histopathologischen Untersuchung der murinen entzündet und uninflamed Kolon Gewebe auf die Machbarkeit von Robotersystemen routinemäßig verwendet für die Verarbeitung und Einbettung von humanen Proben durchführen.

Abstract

Das Verständnis der menschlichen Krankheiten wurde durch die Studie von Tiermodellen stark ausgebaut. Histopathologische Beurteilung der experimentellen Modellen muss allerdings so streng wie die Humanproben angemeldete sein. In der Tat, ist zuverlässig und präzise Schlussfolgerungen kritisch die Qualität des Gewebes Abschnitt Vorbereitung beeinflusst. Hier beschreiben wir ein Protokoll für histopathologische Analyse der murinen Geweben, die mehrere automatisierte Schritte während des Verfahrens, von der anfänglichen Vorbereitung zur Paraffin Einbettung der murinen Proben implementiert. Die Reduzierung der methodischen Variablen durch strengen Protokoll Standardisierung von automatisierten Verfahren trägt zur erhöhten Zuverlässigkeit der murinen pathologische Analyse. Insbesondere dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der automatischen Verarbeitung und Einbettung Robotersysteme, routinemäßig für die Gewebe-Verarbeitung und Paraffin Einbetten von humanen Proben zur murine Proben von Darmentzündungen zu verarbeiten. Wir schlussfolgern, dass die Zuverlässigkeit der histopathologischen Untersuchung der murinen Gewebe mit der Einführung des standardisierten und automatisierten Techniken deutlich erhöht wird.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt, um die pathogenen Mechanismen führen zu Krankheiten beim Menschen^1,2zu sezieren. Bei der Beurteilung die schwere einer Krankheit müssen Forscher bewerten die Wirkung einer Behandlung und der zytologischen und histologischen architektonische Variationen oder die Höhe der Entzündung³zu studieren. Um auf diesen experimentellen Modellen durchzuführen, sind detaillierte histopathologische Analysen nötig, oft vergleichen murinen und menschlichen Proben^4,5.

Darüber hinaus Humanproben häufig verarbeitet und erzielte durch Histopathologie Kern Einrichtungen und erfahrenen menschlichen Pathologen durch standardisierte histopathologischen Kriterien und Methoden. Umgekehrt werden murinen Gewebe in der Regel behoben, eingebettet und von Forschern mit begrenzter Erfahrung der histopathologischen Protokolle analysiert. Die Qualität und Zuverlässigkeit der histopathologischen Untersuchung beginnt mit der Vorbereitung der qualitativ hochwertigen Gewebeschnitten. Mehrere Faktoren tragen kritisch zu erhöhen oder verringern die Qualität der endgültigen Analyse, einschließlich Fixierung, makroskopischen Schnitt, Verarbeitung, paraffin einbetten und Einbettung der Proben^6,7.

Alle diese Stellen mit Manipulation der Probe werden manuelle Fehler, einschließlich manueller Einbettung der Proben und, in geringerem Maße, manuelle Mikrotom schneiden und Färbung unterzogen. Derzeit setzt der gesamte Prozess der murinen Gewebe Vorbereitung für histologische Auswertung auf Protokolle, die von Labor zu Labor variieren und manuelle Protokolle. Das Ziel dieser Studie ist es, standardisierte automatisierten Protokolle zur Reduzierung von Fehlern und Variabilität in murinen histopathologische Untersuchung zu implementieren.

Nach unserem Kenntnisstand beschreiben wir hier die ersten Protokolle für vollautomatische Gewebe Verarbeitung und für die histologische Auswertung der murinen Gewebe einbetten; Diese werden routinemäßig in Pathologie Einheiten für die Analysen der menschlichen Proben verwendet. Als ein praktisches Beispiel für die Durchführbarkeit der Methode ein Mausmodell der Darmentzündung wurde analysiert, d. h., das Modell chronischer Kolitis verursacht durch wiederholte Gabe von Dextran Natriumsulfat (DSS) in der Trinkwasser-^{8 ,9}. Diese experimentelle Einstellung eng ähnelt menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) Krankheiten¹⁰ da DSS-behandelten Tieren Anzeichen einer Darmentzündung, z. B. Gewichtsverlust, weichem Stuhl oder Durchfall und Verkürzung der Doppelpunkt und die Fibrose ^{aufweisen 8,9,11}. Wie für menschliche IBD-Patienten beobachtet, erzeugt DSS Behandlung eine komplexe Krankheitsverlauf. In diesem Zusammenhang sind aufwendige histologische Auswertungen erforderlich, die tiefgreifende Veränderung die Gewebearchitektur verstehen. Damit die Umsetzung der beschriebenen Protokolle zur Steigerung der Probenqualität Vorbereitung könnten Forscher unter Berufung auf die Interpretation der histologischen profitieren und immunhistochemische Analysen für murine experimentelle Einstellungen. Murinen experimentelle Modelle menschlicher Erkrankungen mit Veränderungen der Gewebearchitektur, das Vorhandensein von Zellgewebe infiltrieren oder Entzündungen in verschiedenen Geweben und Organe (Darm, Gehirn, Leber, Haut) können die erhöhte Qualität der Probenvorbereitung für die histopathologische Untersuchung.

Protocol

Tierische Verfahren wurde vom italienischen Gesundheitsministerium (auth. 127/15, 27/13) genehmigt und folgte die Tierbetreuung Leitlinien des European Institute of Oncology IACUC (institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss)

1. chronische Kolitis Induktion durch sich wiederholende DSS-Verwaltung

1. Separate Alter und Geschlecht abgestimmt Mäuse in 2 Gruppen (Behandlung DSS vs. Kontrolle H₂O, mindestens 5 Mäuse Wurfgeschwistern pro Versuchsgruppe).
2. Verwalten von 2,5 % DSS (40 kDa) in das Trinkwasser für 7 Tage in der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe Wasser.
   Hinweis: Dieses Modell führt zu einer chronischen Transmural Darmentzündung⁹.
3. Nach 7 Tagen DSS Behandlung abbrechen und Wasser zu beiden Gruppen für 14 Tage geben. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-Mal.
   Hinweis: Wiederholte Verabreichung von DSS induziert Veränderungen der Dickdarmschleimhaut sehr ähnlich menschlichen IBD, d. h. Fibrose⁹.
4. Mäuse nach dem Verfahren autorisiert durch die institutionellen IACUC, d.h., durch CO₂ Inhalation zu opfern.
5. Öffnen Sie das Maus-Bauch und Bauchfell mit einem Skalpell.
   Hinweis: Sterilität ist empfehlenswert aber nicht unbedingt erforderlich.
6. Trennen Sie den Doppelpunkt aus dem Dünndarm mit Zangen und Pinzetten. Verbrauchssteuern Sie Dickdarms mit Pinzette und Zange.
   Hinweis: Doppelpunkt Längenmessung (Abbildung 1A) ist eine Methode, um festzustellen, ob in DSS-behandelten Mäusen ulcerosa aufgetreten.
7. Spülen Sie den Doppelpunkt in einer Petrischale mit 10 mL kalten 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) und drücken Sie sanft, um fäkal Material zu entfernen.

(2) murinen Gewebe Fixierung

1. Tauchen murinen Doppelpunkt Proben in 10 mL 10 % Neutral gepufferte Formalin (NBF) bei RT (Raumtemperatur).
   Hinweis: Sterilität ist empfehlenswert aber nicht unbedingt erforderlich.
2. Beheben Sie das Gewebe für 18 – 24 h bei RT

(3) Colon-Schnitt und Gewebe-Vorbereitung

1. Festes Gewebe aus dem NBF-Container mit kleine Pinzette entfernen und steckte sie in eine Petrischale. Ein strukturierendes Arbeitsplatte des Dickdarms mit einer kleinen Pinzette aufgesetzt.
2. Geschnitten Sie Doppelpunkte in Fragmente (0,2 cm bis 0,3 cm Länge) mit einem sterilen Skalpell. Dieses Fragmentlänge ist optimal, um nicht die Dicke der Kassette nicht überschreiten.
3. Holen Sie einen Doppelpunkt Segment mit kleinen Pinzetten (Abbildung 2A). Setzen Sie einen Doppelpunkt Segment in eines der Kunststoff hervorstehenden Spitzen der orientierte Paraffin einbetten Kassette mit kleinen Pinzetten (Abb. 2 b).
4. Wiederholen Sie den Vorgang (3.2-3.3) mit einem zusätzlichen 3 Doppelpunkt Segmente pro Kassette. Einlegen der Segmente in angrenzenden hervorstehenden Tipps zur Minimierung der Überlappung des Gewebes zu vermeiden
5. Dicht schließen der Kassette vorsichtig drücken Sie die vier Kanten (Abbildung 2). Vermeiden Sie, drückte das Gewebe um Gewebeschäden zu vermeiden.
6. Legen Sie das Raster in tragenden Kunststoffrahmen. Beschriften Sie den Tragrahmen um die Probe zu identifizieren. Wiederholen Sie für jede biologische Probe.

(4) Gewebe Verarbeitung

1. Schalten Sie die automatische Prozessor durch Drücken der Power-Taste (Abb. 3A, 3 b).
2. Warm-up für 1 h bis Paraffin Wachs schmelzen zu gewährleisten. Warten Sie, bis das Gerät, dass das Paraffin vollständig geschmolzen ist bestätigt, indem man beobachtet, das Vorhandensein von engagierten Symbol (Abbildung 3).
3. Setzen Sie jedes orientierten Kassette (enthält die Gewebeproben) manuell in den Metallkorb zur Verfügung gestellt durch den automatisierten Prozessor (Abbildung 3D). Stellen Sie die Kassetten senkrecht durch Futter sie in der Nähe von einem zum anderen die Korb-Belegung optimieren.
4. Schließen Sie den Metallkorb (Abbildung 3E).
5. Öffnen Sie den Deckel der Retorte (Abbildung 3F). Die Retorte ist der Ort, wo der Korb in die Maschine eingesetzt wird. Legen Sie den Korb in das eigene Gehäuse des Prozessors (Abbildung 3). Schließen Sie den Deckel der Retorte (Abbildung 3 H).
6. Verwenden Sie den Touch-Screen auf dem Instrument Computer Arbeitsprotokoll (Abbildung 3I) definieren. Wählen Sie die Reihenfolge der Lösungen, Timing und Temperatur nach dem Schema in Tabelle 1enthaltenen umgesetzt werden.
7. Weisen Sie das Protokoll auf die Retorte mit dem Korb durch Klicken auf die dedizierten Computer-Symbol (Abbildung 3J) ausgeführt werden. Starten Sie das Protokoll, durch Klicken auf die Schaltfläche "Start" (Abbildung 3 L).
8. Warten Sie, bis das Instrument am Ende des Protokolls, bestätigt durch die Beobachtung des Vorhandensein des Symbols gewidmet und durch das hören der Alarmton aus der Maschine.
9. Öffnen Sie den Deckel der Retorte. Entfernen Sie den Korb aus dem Prozessor (Abbildung 3 M).

(5) Gewebe einbetten

1. Schalten Sie die automatisierte Embedder drücken Sie den ein-/Ausschalter (Abb. 4A).
2. Warm-up für 1 h bis Paraffin Wachs schmelzen zu gewährleisten. Warten Sie, bis das Gerät, dass das Paraffin vollständig geschmolzen ist bestätigt, durch die Beobachtung der Temperatur das Paraffinbad durch das interne Thermometer des Gerätes angezeigt.
3. Manuell übertragen Sie die verarbeiteten Kassetten aus dem Prozessor Korb Embedder Rack. Jedes Rack kann bis zu 32 Kassetten enthalten. (Abbildung 4 b, 4 C).
4. Öffnen Sie den wichtigsten Embedder-Deckel (Abbildung 4, 4D, 4E).
5. Verwenden des Touchscreens auf dem Instrument-Computer, um den Roboter zu signalisieren-System, das eine Rack wird eingefügt (Abb. 4F).
6. Öffnen Sie den Einlass Gehäusedeckel (Abbildung 4). Das Rack in das Einlass-Gehäuse einsetzen. Jedes Embedder kann gleichzeitig bis zu 4 Racks enthalten (Abbildung 4 H, 4I). Schließen Sie den Einlass Gehäusedeckel (Abbildung 4J).
7. Verwenden Sie den Touch-Screen auf dem Instrument Computer, den Einbettungs-Vorgang starten nach Tabelle 2 (Abbildung 4 K).
   Hinweis: Jedes Rack mit 32 Kassetten dauert 45 min. eingebettet werden.
8. Warten Sie, bis das Instrument am Ende des Protokolls, bestätigt durch die Beobachtung der Präsenz des Symbols gewidmet (Abbildung 4 L).
9. Entfernen Sie den Auslass-Ständer (Abbildung 4 M). Schließen Sie den Deckel der wichtigsten Embedder.
10. Entfernen Sie die eingebettete Blöcke (mit Ausrichtung Gitter) aus dem Rack. Übertragen Sie die eingebetteten Blöcke in einer Aufbewahrungsbox Pappe.

(6) Mikrometer-Schnitt

1. Schalten Sie die Kühlplatte Mikrotom. Stellen Sie die Temperatur zwischen-8 und-10 ° C.
2. Schalten Sie die thermostatischen Wasserbad Mikrotom, mit 2 L destilliertes Wasser. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbads zwischen 42-45 ° C.
3. Ort das Paraffin eingebettet Blöcke auf der Kühlplatte. Warten Sie mindestens 5 min um die Blöcke, um cool zu ermöglichen.
4. Nehmen Sie einen Block von der Kühlplatte und legen Sie sie in das Mikrotom-Block-Halter.
5. Legen Sie das Mikrotom Schneiden Dicke bis zu 10 µm. Trim den Block von 6 Mal bei 10 µm Dicke schneiden.
6. Ändern Sie die Dicke Einstellung der Mikrotom von 10 µm bis 3 µm. Schnitt 3 µm-Teil für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung.
7. Sammeln Sie Abschnitt 3 µm mit einer kleinen Bürste. Setzen Sie im Abschnitt 3 µm im Wasserbad, legte sie sorgfältig auf die Wasseroberfläche, Gewebe Falten zu reduzieren. Sammeln Sie Abschnitt Gewebe aus dem thermostatisch gesteuerte Wasserbad auf einen einzigen Glasobjektträger.
   1. Wenn nötig, schneiden Sie zusätzliche Abschnitte.
8. Beschriften Sie den Objektträger durch das Schreiben der Probenidentifikation.
9. Legen Sie die Folien in einem 37 ° C Ofen mindestens 10 min lang.
10. Gestelle für sofortige Analysen oder in Aufbewahrungsboxen Glas-Objektträger umgesetzt.

7. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung

1. Die automatisierte Stainer durch Drücken der Power-Taste einschalten. Lassen Sie die Initialisierung des Roboterarms, durch die Änderung der Ladebalken auf dem Instrument Monitor beobachten.
2. Legen Sie die Glas-Folien in Stainer Rack vertikal bis zu 30 Folien einfügen.
3. Beschriften Sie das Gestell mit dem entsprechenden Radiofrequenz-Identifikation (RFID) Kunststoff-Tag. RFID-tagging ist ein System der Identifizierung der richtigen Färbung Protokolls in der Stainer Computer geladen.
4. Die Stainer stecken Sie Rack. Lassen Sie den Computer automatisch laden und starten der Färbung Protokolls nach der Anerkennung des RFID-Tags.
   Hinweis: Das Protokoll für H & E Färbung ist beschrieben in Tabelle 3.

(8) immunhistochemische Färbung

1. Durchführen Sie immunhistochemische und Mallory trichrome Färbung als zuvor beschriebenen⁷.

Results

Experimentelle chronischer Kolitis induziert durch wiederholte Gabe von DSS im Trinkwasser ist ein Mausmodell der Darmentzündung sehr ähnlich menschlichen IBD^8,9. Abbildung 1 beschreibt die Auswirkungen der DSS Behandlung, einschließlich Doppelpunkt Verkürzung (Abbildung 1A), einen weit verbreiteten Parameter, das Vorhandensein von DSS-induzierte Entzündung und Kolon Expr...

Discussion

Wir nutzen verschiedene automatisierte Schritte bei der Vorbereitung der murinen Gewebe zur histologischen Analyse. Dieses Protokoll bezweckt die Erbringung von technischen Hinweise um die Reproduzierbarkeit und die Standardisierung des gesamten Prozesses, wodurch die Gesamtqualität der histopathologischen Abschlussbewertung zu steigern. Wir realisiert automatisierte Instrumente und Methoden für die Vorbereitung und Einbettung von Geweben, routinemäßig in Pathologie Kern Anlagen für die Erforschung der menschlichen Probe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol wasserfrei	Carlo Erba	414605	Reagenz
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L	Reagenz
Aluminium Kaliumsulfat	SIGMA	A6435	Reagenz
Anilinblau	SIGMA	415049	Reagenz
Carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	Reagenz
CD11b (Klon M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	Antikörper
CD20 IHC (Klon SA275A11)	Biolegend	150403	Antikörper
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	Antikörper
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	Antikörper
CD45.2 (Klon 104)	BioLegend	109837	Antikörper
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	Antikörper
Citrat Buffer pH 6 10x	SIGMA	C9999	Reagenz
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	Reagenz
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	Reagenz
DSS	TdB Consultancy	DB001	Reagenz
EDTA	SIGMA	E9884	Reagenz
EnVision Flex Peroxidase-Blocking-Reagenz	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrat	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	Reagenz
F4/80 (Klon BM8)	BioLegend	123108	Antikörper
Formalin	PanReac	2.529.311.215	Reagenz
Eisessig	SIGMA	71251	Reagenz
Ziegen-anti-Ratten-HRP	Agilent DAKO	P0448	Antikörper
Hämatoxylin	DIAPATH	C0303	Reagenz
LEICA Rotationsmikrotom (RM2255)	Leica	RM2255	Ausrüstung
Ly6g (Klon 1A8)	BD Biosciences	551459	Antikörper
Quecksilber II Oxid	SIGMA	203793	Reagenz
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	Reagenz
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	Reagenz
Orange G	SIGMA	O3756	Reagenz
Paraffin	Sakura	7052	Reagenz
Peloris	LEICA		Gerät
Percoll	SIGMA	P4937	Reagenz
RPMI 1640 ohne L-Glutamin		Microgem L0501-500	Reagenz
STS020	Leica		Gerät
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	Gerät
Tissue-Tek Automatisierter Paraffineinbetter	Sakura		Ausrüstung
Xylol	J.T.Baker	8080.1000	Reagenz