Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.

Zusammenfassung

MicroRNA (MiRNA) Profilerstellung ist von Interesse für Forscher arbeiten in verschiedenen Forschungsgebieten der Biologie und der Medizin geworden. Aktuelle Studien zeigen eine viel versprechende Zukunft der Verwendung von MiRNAs bei der Diagnose und Betreuung von Lungenerkrankungen. Hier definieren wir ein Protokoll für MiRNA profiling um die relative Häufigkeit einer Gruppe von MiRNAs voraussichtlich im Lungengewebe von von einem Mausmodell Ozon-induzierte Atemwege Entzündung entzündlichen Gene regulieren zu messen. Weil sich gezeigt hat, dass zirkulierenden Sexualhormone die Regulierung der angeborenen Immunität Lungenkrebs bei Frauen beeinflussen kann, ist der Zweck dieser Methode zu beschreiben, eine entzündliche MiRNA profiling Protokoll bei weiblichen Mäusen, unter Berücksichtigung des Estrous Zyklus Bühne der einzelnen Tiere zum Zeitpunkt der Ozonbelastung. Wir befassen uns auch geltenden Bioinformatik Ansätze zur MiRNA-Entdeckung und Ziel Identifizierungsmethoden mit Limma, ein R/Bioconductor-Software, und Funktionsanalyse Software zu verstehen, die biologischen Kontext und Wege zugeordnet differenzielle MiRNA Ausdruck.

Einleitung

Micro-RNAs (MiRNAs) sind kurze (19 bis 25 Nukleotide), natürlich vorkommende, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sequenzen von MiRNAs sind evolutionär konserviert über Artgrenzen, was auf die Bedeutung der MiRNAs bei der Regulierung der physiologischen Funktionen¹. MicroRNA Expression profiling ist nachgewiesen worden, zur Identifizierung von MiRNAs, die wichtig sind bei der Regulierung der eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Zelldifferenzierung, Entwicklungsprozesse und Apoptose²hilfreich sein. Vor kurzem wurden MiRNAs für ihre mögliche Verwendung in der Krankheit Diagnostik und Therapie anerkannt.....

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Penn State University genehmigt.

1. Beurteilung des Estrous Zyklus-Phase

1. Zurückhalten Sie richtig ein Weibchen C57BL/6 die einhändige Maus Zurückhaltung Technik in Machholz Et Al.¹⁰beschriebenen Maus (8 – 9 Wochen alt) zu verwenden.
2. Füllen Sie die sterile Pipette aus Kunststoff mit 10 μL ultrareines Wasser.
3. Kunststoff Pipettenspitze in die Vagina einführen.
4. Sanft spülen die Flüssigkeit 4 – 5 Mal auf die Probe zu sammeln.
5. Legen Sie die letzte Spülung mit Scheid....

Ergebnisse

Die verschiedenen Zelltypen in Ausstrichen beobachtet werden verwendet, um die Maus Estrous Zyklus-Phase (Abbildung 1) zu identifizieren. Diese sind durch Zellmorphologie gekennzeichnet. Während Proestrus sind Zellen fast ausschließlich Trauben von runden, wohlgeformten kernhaltigen Epithelzellen (Abbildung 1A). Wenn die Maus in die Brunst ist, sind Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, in dichten Büscheln (

Diskussion

MicroRNA profiling ist eine vorteilhafte Technik für Diagnose von Krankheiten und mechanistische Forschung. In dieser Handschrift haben wir definiert ein Protokoll zur Evaluierung des Ausdrucks von MiRNAs, die voraussichtlich entzündlichen Gene in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt Ozon in verschiedenen Estrous Zyklus Stufen regulieren. Methoden zur Bestimmung des Estrous Zyklus, wie die visuelle Erkennungsmethode wurden beschrieben¹⁶. Aber diese verlassen sich auf einmalige Messungen und.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6J Mäuse	The Jackson Laboratory	000664	8 Wochen alt
Reinstwasser	Thermo Fisher Scientific	10813012
Sterile Kunststoffpipette	Fisher Scientific	13-711-25	Kapazität: 1,7 mL
Frosted Mikroskop Objektträger	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Lichtmikroskop	Mikroskop Welt	MW3-H5	10x und 20x Ziel
Ketathesia-Ketamin HCl Injektion USP	Henry Schein Animal Health	55853	90 mg/kg. Kontrollierte Droge.
Xylazin Sterile Lösung	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg. Kontrollierte Droge.
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100	Mit Wasser auf 70 % Ethanol verdünnen.
21 G Nadel	BD Biosciences	305165
Spritze	Fisher Scientific	329654	1 mL
Operationsschere	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, Scharf/Blunt, Gebogen und 9 cm, Gerade, Pinzette mit feiner Spitze
Nizette Set	World Precision Instruments	504616
Spectrum  Bessman Gewebepulverisierer	Fisher Scientific	08-418-1	Kapazität: 10 bis 50 mg
RNase-freie Mikrofuge-Röhrchen	Thermo Fisher Scientific	AM12400	1,5 mL
TRIzol-Reagenz	Thermo Fisher Scientific	15596026
Direct-Zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
Maus Entzündungsreaktion & Autoimmunität miRNA PCR Array	Qiagen	MIMM-105Z
Dünnwandige, DNase-freie, RNasefreie PCR-Röhrchen	Thermo Fisher	Scientific AM12225	für 20 μ; L-Reaktionen
miRNeasy Serum/Plasma-Spike-in-Kontrolle	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Thermocycler oder Kühl-/Heizblock	General Lab Lieferant
Mikrozentrifuge	General Lab Lieferant
Real-time PCR Cycler	General Lab Lieferant
	General Lab Lieferant
RNA-Waschpuffer	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
DNA-Aufschlusspuffer	Zymo Research	E1010-1-4	4 mL
RNA Pre-Wash Puffer	Zymo Research	R1020-2-25	25 mL
Ultraviolett-Ozon-Analysator	Teledyne API	Modell T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Massendurchflussregler	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

Mehrkanal-Pipettierer