Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

Micro-RNAs (MiRNAs) sind kurze (19 bis 25 Nukleotide), natürlich vorkommende, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sequenzen von MiRNAs sind evolutionär konserviert über Artgrenzen, was auf die Bedeutung der MiRNAs bei der Regulierung der physiologischen Funktionen¹. MicroRNA Expression profiling ist nachgewiesen worden, zur Identifizierung von MiRNAs, die wichtig sind bei der Regulierung der eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Zelldifferenzierung, Entwicklungsprozesse und Apoptose²hilfreich sein. Vor kurzem wurden MiRNAs für ihre mögliche Verwendung in der Krankheit Diagnostik und Therapie anerkannt. Für Forscher, die Mechanismen der Genregulation kann messen MiRNA Ausdruck aufklären Systemebene Modelle der regulatorischen Prozesse, vor allem beim MiRNA Informationen mit mRNA profiling und andere Genom angelegten Daten³. Auf der anderen Seite MiRNAs haben auch gezeigt, dass stabiler als mRNAs in verschiedensten Probenarten und auch sensibler als Proteine⁴messbar sind. Dies führte zu erheblichen Interesse an der Entwicklung von MiRNAs als Biomarker für unterschiedliche molekulare diagnostische Anwendungen, einschließlich Lungenerkrankungen.

In der Lunge MiRNAs eine wichtige Rolle in den Entwicklungsprozessen und die Aufrechterhaltung der Homöostase. Darüber hinaus wurde ihre abnormen Ausdruck der Entstehung und Progression von verschiedenen Lungenkrankheiten⁵zugeordnet. Entzündliche Lungenerkrankungen induziert durch Luftverschmutzung hat gezeigt, mehr schwere und schlechtere Prognose bei Frauen, die darauf hinweist, dass Hormone und den Estrous Zyklus Lunge angeborene Immunität und MiRNA Ausdruck als Reaktion auf ökologische Herausforderungen regulieren können ⁶. in diesem Protokoll verwenden wir Ozonbelastung, das ist ein wichtiger Bestandteil der Luftverschmutzung, um eine Form der Lungenentzündung bei weiblichen Mäusen zu induzieren, das auftritt, in Ermangelung der adaptiven Immunität. Durch die Verwendung von Ozon, sind wir die Entwicklung der Atemwege Hyperreaktivität induziert, die Atemwege Epithelzelle Schaden und eine Erhöhung der Neutrophilen und Entzündungsmediatoren im proximalen Airways⁷zugeordnet ist. Derzeit gibt es keine gut beschriebenen Protokolle zu charakterisieren und zu analysieren MiRNAs über den Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt.

Im folgenden beschreiben wir eine einfache Methode zur Ermittlung Estrous Zyklus Phasen und MiRNA Ausdruck im Lungengewebe von weiblichen Mäusen Ozon ausgesetzt. Wir sprechen auch effektive Bioinformatik Ansätze zur MiRNA Entdeckung und Target Identifizierung mit dem Schwerpunkt Bioinformatik. Wir analysieren die Microarray-Daten mithilfe von Limma, eine R/Bioconductor-Software, die eine integrierte Lösung bietet für die Analyse von Daten aus gen Ausdruck Experimente⁸. Analyse von PCR-Arraydaten aus Limma hat einen Vorteil in Bezug auf Leistung gegenüber t-basierte Testverfahren bei der geringen Anzahl von Arrays/Proben Verwendung Ausdruck zu vergleichen. Um biologische Zusammenhang mit MiRNA Ausdrucksergebnisse zu verstehen, haben wir dann die funktionale Analyse-Software verwendet. Um die Mechanismen zur Regulierung transcriptional Änderungen zu verstehen und wahrscheinlich Ergebnisse vorherzusagen, kombiniert die Software MiRNA-Ausdruck Datasets und wissen aus der Literatur-⁹. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu Software, die für die statistische Anreicherung in überlappenden Gruppen von MiRNAs schauen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Penn State University genehmigt.

1. Beurteilung des Estrous Zyklus-Phase

1. Zurückhalten Sie richtig ein Weibchen C57BL/6 die einhändige Maus Zurückhaltung Technik in Machholz Et Al.¹⁰beschriebenen Maus (8 – 9 Wochen alt) zu verwenden.
2. Füllen Sie die sterile Pipette aus Kunststoff mit 10 μL ultrareines Wasser.
3. Kunststoff Pipettenspitze in die Vagina einführen.
4. Sanft spülen die Flüssigkeit 4 – 5 Mal auf die Probe zu sammeln.
5. Legen Sie die letzte Spülung mit Scheidenflüssigkeit auf einen Objektträger.
6. Die ungefärbte vaginale Spülung unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu beobachten.
   Hinweis: Tiere, die nicht in regelmäßigen Zyklen durch Scheinträchtigkeit oder andere Ursachen-show aus dem Experiment ausgeschlossen werden müssen. Es wird empfohlen, täglich Vaginalsekret für mindestens drei aufeinander folgenden Zyklen Zyklizität bestätigen durchführen.

2. Belastung durch Ozon

1. Legen Sie maximal 4 Mäuse in zwei 1,2 L Glasbehälter mit Wire Mesh Deckel und Wasser ad libitum.
2. Setzen Sie einen Glasbehälter in der Ozon-Kammer und der andere in der gefilterten Luftkammer Exposition.
3. Die Ozonkonzentration um 2 ppm und Monitor Ozonwerte regelmäßig anzupassen.
   Hinweis: Das Ozon-Gerät liefert einen geregelten Luftstrom (> 30 Luft Änderungen/h) mit kontrollierten Temperatur (25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %). Das System erzeugt Ozon durch eine elektrische Entladung Ozonisators, die überwacht und gesteuert durch ein UV-Ozon-Analysator und Massendurchflussregler, wie oben beschrieben¹¹.
4. Entfernen Sie Glasbehälter nach 3 h Ozon/gefilterte Luft ausgesetzt. Tiere, mit Bettwäsche, Nahrung und Wasser ad libitum Käfig zurück.

(3) Lunge Sammlung

1. 4 h nach der Belichtung zu betäuben Tiere mit einer intraperitonealen Injektion eine Ketamin/Xylazin cocktail (90 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin).
   Hinweis: Um einen angemessenen Grad an Anästhesie zu bestätigen, überprüfen Sie die Maus für ein Pedal reflex (feste Zehe Prise) und die Narkose nach Bedarf anpassen.
2. Die Maus Haut mit 70 % Ethanol zu dämpfen.
3. Machen Sie einen 2 cm Mittellinie Schnitt mit einem operativen Scheren und chirurgische Pinzetten, um die untere Hohlvene verfügbar zu machen.
4. Opfern Sie Mäuse durch Durchtrennung der Vena Cava und Aorta. Bei Bedarf legen Sie 21 G-Gauge-Nadel in der Vena Cava oberhalb der renale Adern Blut vor dem Entbluten zu sammeln. Alternativ sammeln Sie Blut über Herz durchbohren nach standard-Protokolle.
5. Verwenden Sie eine chirurgische Schere aufschneiden der Bauchhöhle und Haut/obere Muskel, verschieben nach oben in Richtung der Rippen entfernen.
6. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Membran zu durchbohren.
   Hinweis: Lungen werden von der Membran zusammenbrechen.
7. Schneiden Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere, um Herz und Lunge verfügbar zu machen.
8. Mit Pinzette, nehmen Sie eine 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch und Tauchen Sie es in flüssigem Stickstoff, das Rohr zu füllen.
   Hinweis: Verwenden Sie Schutzbrille und Schutzhandschuhe, flüssigen Stickstoff behandeln.
9. Entfernen Sie der Lunge zu, legen Sie sie in die RNase-freie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit flüssigem Stickstoff zu Snap-das Gewebe Einfrieren, und warten Sie einige Sekunden, bis die Flüssigkeit verdampft.
10. Schließen Sie den Schlauch Deckel und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.

(4) RNA-Vorbereitung

1. Ganze Lunge mit einer Edelstahl-Gewebe Pulverisator zu pulverisieren.
   Hinweis: Das Gewebe Pulverisator muss in flüssigem Stickstoff vor der Anwendung platziert werden. Reinigen Sie den Zerstäuber nach jedem Gebrauch mit RNAse-Lösung.
2. Die pulverisierten Lungen aufgeteilt und legen Sie in zwei 1,5 mL Röhrchen (halbe Lunge).
3. 500 µL Guanidinium-Thiocyanat pro Probenröhrchen und verrühren.  Jede Probe mit 18 G, 21 G und 23 G Nadeln bzw. zu homogenisieren.
   Hinweis: Proben können mit 5,6 x 10⁸ Kopien (von einer anderen Spezies) bevor mit der Extraktion ein kleines RNA Spike-im Steuerelement versetzt werden.
4. Jede Probe und Vortex für 15 500 µL Ethanol hinzufügen s.
5. Last die Mischung in einer Spin-Spalte in einem Sammelrohr und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten.
6. Für DNase ich Behandlung (in Spalten);
   1. 400 µL RNA Wash Buffer und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min hinzufügen.
   2. Fügen Sie in eine RNase-freies Rohr 5 µL der DNase I und 75 µL 1 x DNA Verdauung Puffern und mischen. Fügen Sie die Mischung direkt in die Spalte Matrix.
   3. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
7. Die Spalte und die Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten 400 µL RNA eingespült Lösung hinzu, und wiederholen Sie diesen Schritt.
8. Hinzufügen der Spalte 700 µL Waschpuffer RNA und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. Entsorgen der durchströmten.
9. Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g für 2 min, verbleibende Puffer zu entfernen. Übertragen Sie die Spalte in eine RNase-freies Rohr.
10. Um RNA eluieren, 35 µL DNase/RNase-freies Wasser direkt hinzufügen der Spalte Matrix und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1,5 min.
11. Total RNA-Konzentration zu messen (260 nm) und Reinheit mit einem Spektralphotometer. Befolgen Sie die Anweisungen zum RNA Quantifizierung in einer 1,5 µL Probe aliquoten durchführen. Das Instrument mit DNase/RNase-freies Wasser zur Elution leer.
    Hinweis: ~2.0 260/280 Verhältnis gilt allgemein als "rein" für RNA. Typische RNA-Konzentration reicht in der Regel zwischen 750 und 2.500 ng/µL.
12. Shop bei-80 ° C.

5. MiRNA Profiling

1. Retro-kleine RNAs, Einsatz 200 ng von Gesamt-RNS transkribieren.
   1. Bereiten Sie die Reverse Transkription Reaktion Mischung auf Eis (Gesamtvolumen pro Reaktion beträgt 20 µL). Fügen Sie für jede Reaktion 4 µL 5 x Puffer, 2 µL 10 X Nukleotide-Mix, 2 µL Reverse Transkriptase und 2 µL RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Komponenten und Aliquot in 600 µL RNAse-freie Kunststoff-Rohre (10 µL-Mix pro Reaktion).
      Hinweis: Die Reverse Transkription-master-Mix enthält alle Komponenten, die erforderlich für die erste-Strang cDNA Synthese außer Vorlage RNA.
      Hinweis: Berechnen Sie überschüssige Volumen (10 %), bei der Vorbereitung der master-Mix.
   2. Fügen Sie die Vorlage RNA (200 ng in 10 µL) auf jedes Röhrchen mit Reverse Transkription master-Mix. Mix, Zentrifuge für 15 s bei 1000 X g, und speichern sie auf Eis bis in Thermocycler oder trockene Block platzieren.
   3. 60 min bei 37 ° c inkubieren
   4. 5 min bei 95 ° C inkubieren Sie und die Rohre auf Eis.
   5. Verdünnen Sie die cDNA durch Zugabe von 200 µL RNase-freies Wasser zu jeweils 20 µL Reverse Transkription Reaktion.
2. Durchführen Sie Real-Time PCR unter Verwendung der Maus Entzündungsreaktion und Autoimmunität MiRNA PCR Array.
   1. Bereiten Sie eine Reaktion Mischung (Gesamtvolumen 1100 µL): für jede Reaktion hinzufügen, 550 µL 2 X PCR-master-Mix, 110 µL 10 x universal Grundierung Mischung, 340 µL RNase-freies Wasser und 340 µL Vorlage cDNA (verdünnte Reaktion von Schritt 5.1.5).
   2. Jede Vertiefung des vorinstallierten MiRNA PCR-Array mit einem Mehrkanal-Pipette fügen Sie 10 µL Reaktion Mischung hinzu.
   3. Versiegeln Sie die MiRNA Array PCR Platte mit optischen Klebefolie.
   4. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.000 X g bei Raumtemperatur um Luftblasen zu entfernen.
   5. Programmieren Sie die Echtzeit-Thermocycler, PCR Erstaktivierung Schritt für 15 min bei 95 ° C, 3-Stufen-Radsport enthaltenden Denaturierung für 15 s bei 94 ° C, Glühen für 30 s bei 55 ° C und Erweiterung für 30 s bei 70 ° C für 40 Zyklen Reihe.
      Hinweis: Folgen des Herstellers Radfahren Bedingungen Anweisungen zum Einrichten der Echtzeit-Cycler. Führen Sie die Dissoziation Kurve Schritt in die Echtzeit-Cycler-Software integriert.
   6. Datenanalyse.

(6) Datenanalyse

1. Ct-Werte aus der Real-Time PCR Software für jede Probe in einer Analyse-Software zu extrahieren.
   Hinweis: Ein CT-Wert von 34 gilt als Cut-off. Wenn Proben Spike-Steuerelement (z. B., Cel-Mir-39) enthalten, normalisieren Sie Ct-Werte, die Spitze in der Steuerung für jede Probe. Grenzwerte müssen manuell eingestellt werden. Ausgangswerte werden automatisch eingestellt.
2. Ct-Werte, die durchschnittliche Ct von sechs MiRNA-Housekeeping-Steuerelementen zu normalisieren: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, unter Verwendung der folgenden Gleichung:
   ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
3. Für Falte ändern Sie Berechnungen, berechnen Sie ΔΔCt Werte mit einer bestimmten Probe als das Steuerelement, mit dem relativen Ausdruck Gleichung¹²:
   MiRNA relativen Ausdruck:
   2^-∆∆Ct, wo - ∆∆Ct =-[∆Ct Test - ∆Ct Kontrolle]
   Hinweis: Eine Falte Änderung von 200 gilt als Cut-off.
4. Export-Falte ändern Ausdruckswerte auf R mit dem Limma -Paket Bioconductor⁸statistische Analysen durchzuführen.
5. Für multiple Vergleiche anhand der Benjamini-Hochberg Methode¹³zu korrigieren.
   Hinweis:  Eine Kopie der R-Skript ist abrufbar: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasets und analysierten Daten stehen auch an der Gene Expression Omnibus unter Nummer GSE111667 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. Analyse: Funktionelle Analysesoftware

1. Ordnen Sie das Dataset. Enthalten Sie MiRNAs mit ihren jeweiligen Ausdruck Log Verhältnisse und p-Werte. Siehe Tabelle 1 für die Formatierung von bestimmten Dataset.
2. Offenen Funktionsanalyse Software (Version 10/01).
3. Laden Sie das Dataset mithilfe des folgenden Formats: Dateiformat: "Flexible Format", enthält Spaltenüberschrift: "Ja", wählen Sie Bezeichnertyp: "MiRBase (alt)" Array-Plattform für Experimente verwendet: Wählen Sie die Array-Plattform.
   Hinweis: Akzeptierte Dateiformate sind txt (Registerkarte "getrennte Textdateien), XLS (excel-Dateien), und .diff (Cuffdiff Dateien).
4. Wählen Sie "Beobachtungen ableiten" und überprüfen Sie, ob die experimentelle Gruppe Beschriftung korrekt ist.
5. Gehen Sie zu "Dataset Zusammenfassung", den Gesamtbetrag der zugeordneter und nicht zugeordneter MiRNAs zu überarbeiten.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche "neu" am oberen linken Ecke des Programms. Wählen Sie "Neue MicroRNA Ziel Filter" und laden Sie ein MicroRNA-Dataset.
   1. Legen Sie Quelle: TarBase, Einfallsreichtum Experten Erkenntnisse, MiRecords.
   2. Vertrauen gesetzt: experimentell beobachteten oder hohe (vorausgesagt).
   3. Wählen Sie "Spalten hinzufügen", um eine Vielzahl von biologischen Informationen zu den Zielgruppen wie Arten, Krankheiten, Gewebe, Wege und mehr umfassen.
   4. Um Ziele zu konzentrieren, die Ausdruck im Experiment geändert haben, wählen Sie "hinzufügen / ersetzen mRNA Dataset". Verwenden Sie "Ausdruck Pairing", um Micro-RNAs mit dem gleichen oder einem anderen Ausdruck zu finden.
      Hinweis: Die Filter-Analyse liefern MicroRNA-Namen und Symbole, mRNA-Ziele, die Quelle, die Ziel-Beziehung und das Konfidenzniveau der vorhergesagten Beziehung (Abbildung 2) beschreibt.
7. Klicken Sie auf "Hinzufügen zu mein Weg" zum Senden der gefilterten Datensatz auf einer Leinwand weg und mehr biologische Zusammenhänge zu erforschen.
8. Verwenden Sie Weg Designer Publikation Qualitätsmodell MicroRNA-Effekte zu erstellen.
9. Eine Alternative ist die Schaffung eine Kern-Analyse.
   1. Wählen Sie für Kern-Analyse "Expression Analysis".
   2. Wählen Sie für Messung "Expr Log Ratio".
   3. Analyse Filter Zusammenfassung: betrachten nur Moleküle bzw. Beziehungen wo: (Art = Maus) und (Vertrauen = experimentell beobachteten) AND (Datenquellen = "Einfallsreichtum Experte Ergebnisse", "Einfallsreichtum ExpertAssist Ergebnisse", "MiRecords", "TarBase", oder " Zielscan Mensch").
   4. Wählen Sie eine Abschaltung der p-Wert = 0,05.
   5. Führen Sie die Analyse.
      Hinweis: Der Bericht umfasst: kanonische Pfade, vorgelagerten Regulierungsbehörden Analyse, Krankheiten und Funktionen, Regler Effekte, Netzwerke und Moleküle.

Die verschiedenen Zelltypen in Ausstrichen beobachtet werden verwendet, um die Maus Estrous Zyklus-Phase (Abbildung 1) zu identifizieren. Diese sind durch Zellmorphologie gekennzeichnet. Während Proestrus sind Zellen fast ausschließlich Trauben von runden, wohlgeformten kernhaltigen Epithelzellen (Abbildung 1A). Wenn die Maus in die Brunst ist, sind Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, in dichten Büscheln (Abbildung 1 b) vorhanden. Während Metestrus, verhornten Epithelzellen und polymorphkernige Leukozyten gesehen (Abbildung 1). Im Diestrus sind Leukozyten (kleine Zellen) in der Regel häufiger (Abbildung 1).

Wir extrahieren RNA aus vier Maus Lungen nach dem zuvor beschriebenen Protokoll. Die Nukleinsäure-Konzentration (ng / µL) lag zwischen 1197.9 und 2178.1 mit einem Durchschnitt von 1583.1 ± 215 (Tabelle 1). Die durchschnittliche A260/A280 Verhältnis schwankte von 2.010 2.020 mit einem Durchschnitt von 2.016 ± 0,002. Auf der anderen Seite die beobachteten A260/A230 Verhältnisse schwankte zwischen 2.139 und 2.223 mit einem Durchschnitt von 2.179 ± 0,018.

Tabelle 2 zeigt differentielle Expression-Ergebnisse mit Limma auf R. Wir berechnen Top differentiell exprimierten MiRNAs zwischen Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in Proestrus (mit dem Befehl Toptable)14. Die erste Spalte gibt den Wert der log2-Falte Falte Änderung in MiRNA Ausdruck zwischen Ozon und gefilterte Luft ausgesetzt Tiere. Die Spalte t stellt die moderate t-Statistik berechnet für jede MiRNA im Vergleich. Die Spalten p.value und adj.p.value stellen zugeordneten p-Werte für jeden Vergleich vor und nach mehreren Tests Anpassung bzw.. Anpassung für Mehrfachvergleiche erfolgte mit der Benjamini und Hochberg Methode false Discovery Rate15steuern. Spalte B stellt die Log-Chancen, die die MiRNA differentiell ausgedrückt8.

Wir führten die MiRNA soll Filter und Kern-Analyse, die der Anreicherung Pathway Analyse beinhaltet. Nach dem Hochladen einer Liste der 14 MiRNAswith der Ausdruck Log Verhältnis und p-Wert, wurden alle von ihnen vom MiRNA Ziel Filter (Tabelle 3) zugeordnet. Die Ergebnisse gefiltert und sortiert werden, um bestimmte Wege, in diesem Fall die "zelluläre Immunantwort" bekommen. Die Kern-Analyse lieferte Informationen über kanonische Pfade, Krankheiten und Funktion, Regulierungsbehörden und Netzwerke (Tabelle 4). Die funktionelle Analyse-Software produziert eine Netzwerk-Analyse, die zeigt, das Verhältnis zwischen der MiRNAs von Interesse und anderen Molekülen (Abbildung 3).

Abbildung 1: Identifizierung des Estrous Zyklus Phasen. (A) Proestrus (überwiegend kernhaltigen Epithelzellen); (B) Östrus (überwiegend Anucleated verhornten Zellen); (C) Metestrus (alle drei Arten von Zellen); und (D) Diestrus 2 (Mehrheit der Leukozyten). Maßstabsleiste = 100 µm. Vergrößerung = 20 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: funktionelle Analyse Software repräsentative Ergebnisse: MiRNA Ziel Filter. Umfassendes Profil von MiRNAs in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus. Nach der Durchführung MiRNA Filter, liefert die Software detaillierte Listen von Genen und Verbindungen verwickelt in Krankheiten und anderen Phänotypen, die Filter und Sortierung kommt man zu bestimmten Wege, in diesem Fall "Zelluläre Immunantwort" sein kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Funktionsanalyse Software repräsentative Ergebnisse: Netzwerke. Vergleich der Netze durch gefilterte Luft oder Ozon Exposition bei Frauen in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus betroffen. Schematische Darstellung biologischer Netzwerke MiRNAs in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt gefilterte Luft gegen Ozon in Proestrus (A) oder nicht-Proestrus Phasen (B) zugeordnet. Diese Zahl wurde von Fuentes Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Beispiel der RNA-Konzentrationen und Absorption bei 260, 230 und 280 nm von gereinigten Lunge Gewebeproben von vier Mäuse. Konzentrationen wurden mit einem Spektralfotometer gemessen.

Tabelle 2: Limma Analyse-Ergebnisse für differentiell exprimierten MiRNAs bei Frauen gegenüber Ozon ausgesetzt vs . gefilterte Luft in der Proestrus.

Tabelle 3: Beispielformat für Multi-Beobachtung Upload von Datasets Funktionsanalyse Software. Mehrere experimentelle differenzielle Ausdrücke in einer einzigen Tabelle zusammengefasst und hochgeladen werden können, und so viele Beobachtungen nach Bedarf hinzugefügt werden können. Spalten: 1) MiRNAs ID; (2) Beobachtung 1: Expr Log-Verhältnis; (3) Beobachtung 1: P-Wert; (4) Beobachtung 2: Expr Log-Verhältnis; (5) Beobachtung 2: P-Wert.

Tabelle 4: funktionelle Analyse-Software Zusammenfassung der Weibchen, Ozon in der nicht-Proestrus vs. Proestrus Stufen ausgesetzt. Die funktionelle Analyse-Software ermöglicht die Analyse der Top kanonische Pfade, vorgelagerten Regulatoren, Krankheiten & Funktionen, Top-Funktionen, Regler Effekt Netzwerke und mehr. Diese Tabelle wurde von Fuentes Et Al.6geändert.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.