Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion

Zusammenfassung

Die Komplementkomponente C1q ist ein in der Gewebemikroumgebung hochgradig exprimiertes pro-inflammatorisches Molekül, das mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, die Zellhaftung beeinflusst.

Zusammenfassung

Es wurde zunehmend gezeigt, dass die Tumormikroumgebung eine aktive Rolle bei Neoplasiewachstum und Metastasen spielt. Durch verschiedene Wege können Tumorzellen stromale, Immun- und Endothelzellen effizient rekrutieren, indem sie stimulierende Faktoren, Chemokine und Zytokine sezernieren. Im Gegenzug können diese Zellen die Signaleigenschaften der Mikroumgebung verändern, indem sie wachstumsfördernde Signale, Metaboliten und extrazelluläre Matrixkomponenten freisetzen, um eine hohe Proliferation und metastasierende Kompetenz aufrechtzuerhalten. In diesem Zusammenhang identifizieren wir, dass die Komplementkomponente C1q, die lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren stark exprimiert wird, wenn sie mit der extrazellulären Matrix Hyaluronsäure interagiert, das Verhalten von Primärzellen stark beeinflusst, die aus dem menschlichen Tumor isoliert sind. Exemplare. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure (HA) gebunden ist, die Adhäsion von Tumorzellen beeinflusst, was der Tatsache zugrunde liegt, dass die biologischen Eigenschaften der Wichtigsten komponenten der extrazellulären Matrix (in diesem Fall HA) durch bioaktive Signale in Richtung Tumor geformt werden können. Fortschreiten.

Einleitung

Die Tumormikroumgebung (TME) beeinflusst die Entwicklung und Progression von Krebs, da sie eine freizügige Nische für Zellüberleben, Wachstum und Invasion bieten kann. Die Identifizierung neuer Schlüsselakteure in TME kann für die Entdeckung neuer molekularer Werkzeuge für die Zieltherapie nützlich sein. TME umfasst ein komplexes und dynamisches Netzwerk von nicht-bösartigen Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems, eingebettet in die umgebenden extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Kollagene, Laminine, Fibronectine, Proteoglykane und Hyaluronane. Sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumorzellen synthetisieren und sezernieren ECM-Komponenten zusammen mit Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren und entzündlichen und Matrix-Remodeling-Enzymen, die insgesamt die physikalischen, chemischen und signalischen Eigenschaften von TME verändern. Unter diesen Bestandteilen, Hyaluronsäure (HA) hat sich herausgebildet, um eine entscheidende Rolle in der Tumorbiologie zu üben. Trotz seiner einfachen chemischen Zusammensetzung kann HA zusammen mit seinen HA-bindenden Molekülen (Hyaladherinen) Angiogenese, Reaktionsfähigkeit des Immunsystems und ECM-Umbau in einer größen- und konzentrationsabhängigen Weise modulieren¹.

Das Komplementsystem (C) ist auch Teil der lokalen TME, die in letzter Zeit zunehmend Beachtung gefunden hat. Das C-System umfasst eine Reihe von löslichen und membrangebundenen Proteinen, die an der ersten Verteidigungslinie gegen Nicht-Selbstzellen, unerwünschte Wirtselemente und Krankheitserreger beteiligt sind. Funktionell verbindet das C die Zweieffekterarme angeborener und adaptiver Systeme, um entweder die direkte Zelltötung oder die Montage einer Entzündungsreaktion zu fördern². C-Aktivierung kann Tumorwachstum unterdrücken, indem krebsartige Zellen zerstört oder ihr Auswuchs hemmt, aber es ist immer klarer geworden, dass es eine tumorfördernde Aktivität besitzen kann, indem es chronische Entzündungen aufrechterhält und die Etablierung eines immunsuppressives Milieu, die Angiogenese induzieren und krebsbedingte Signalwege aktivieren³. In diesem Zusammenhang hat sich C1q, das erste Erkennungsmolekül des klassischen Signalwegs des C-Systems, herausgebildet, um wichtige Funktionen in der Tumormikroumgebung unabhängig von c-Aktivierung⁴auszuüben. C1q hat sich gezeigt, lokal durch eine Reihe von menschlichen bösartigen Tumoren ausgedrückt werden, wo es Krebszelladhäsion, Migration und Proliferation zusätzlich zu Angiogenese und Metastasierung⁵bevorzugen kann. Interessanterweise interagiert C1q mit einem hauptbestandteil des ECM wie HA.

Wir entwickelten eine Technik, um die primären Krebszellen von der Tumormasse zu isolieren. Darüber hinaus haben wir die Matrix entwickelt, die die Tumormikroumgebung stimulieren kann, insbesondere die Wechselwirkung zwischen C1q und hochmolekularer Hyaluronsäure. C1q gebunden an HA war in der Lage, Adhäsion der Tumorzellen zu induzieren.

Protokoll

Gewebeproben von Patienten wurden nach Zustimmung der Informierten nach Genehmigung der ethischen Erwägungen durch das Institutional Board des Universitätsklinikums Triest, Italien, entnommen.

1. Tumorzellisolierung und -kultur (Tag 1)

1. Isolieren Sie menschliche Mesotheliomzellen aus mPM-Festkörperproben. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Fräser fein hacken, um Fragmente von ca. 2-3 mm² in der Größe zu erhalten und in 5 ml Verdauungslösung zu brüten, bestehend aus Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), ergänzt mit 0,5 mM Ca²⁺/Mg^2+,0,5% Trypsin und 50 g/ml DNase I, über Nacht bei 4 °C.
2. Tumorzellisolierung und -kultur (Tag 2)
   1. Nach der nächtlichen Inkubation das verdaute Gewebe 30 min in einen 37 °C-Inkubator mit sanftem Schütteln legen.
   2. Ersetzen Sie die Verdauungslösung bei Zentrifugation (250 x g) durch 3 mg/ml Kollagenase Typ 1 gelöst in 5 ml Medium 199 mit HBSS und weiter für 30 min bei 37 °C mit sanftem Schütteln inkubieren.
   3. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) hinzufügen. Setzen Sie die Zellen sehr sorgfältig mit einer 5 ml Pipette aus, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Filtern Sie dann die Zellsuspension durch einen 100-m-Porenfilter.
   4. Säen Sie die Zellen in einem 12,5 cm² Kolben und kultichen Sie sie bei 37 °C mit menschlichen Endothelzellen serumfreies Medium (HESF), mit 10% FBS und ergänzt mit EGF (10 ng/mL), Basis FGF (20 ng/ml) und 1% Penicillin- Streptomycin.
      HINWEIS: Ersetzen Sie alle 2-3 Tage durch frisches Medium.

2. HA-Beschichtung (Tag 1)

1. Hochmolekulares HA (1,5 kDa) in doppelt destilliertem Wasser in der Konzentration von 1 mg/ml⁶wieder aufsetzen.
2. HA-Stammlösung in Karbonat/Bicarbonat-Puffer (0,1 M, pH 9,6) mit sanfter Pipettierung auf 50 g/ml verdünnen.
3. Beschichten Sie die 96-Well-Platte mit 100 l verdünnter HA-Lagerlösung pro Brunnen über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Hyaluronsäure war ein freundliches Geschenk von Professor Ivan Donati, Department of Life Sciences, Universität Triest⁷.

3. C1q-Beschichtung (Tag 2)

1. Vakuum aspirieren die behandelten Brunnen nach über Nacht und waschen die 96-Well-Platte mit 100 L von Dulbeccos PBS (dPBS) pro Brunnen.
2. C1q (25 g/ml oder unterschiedliche Konzentrationen für Dosisreaktionsexperimente) oder BSA (als Negativkontrolle) an kunststoffimmobilisiertes-HA binden lassen, indem diese Proteine in einer Konzentration von 25 g/ml in 100 l dPBS + 0,5% BSA und 0,7 mM Ca²⁺/Mg²⁺ . Dann über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Vakuum-Aspirieren sie die Brunnen und waschen Sie die 96-Well-Platte mit 100 l/Well von dPBS.

4. Zellbeschriftung mit FAST DiI

1. Resuspend 1 x 10⁵ Tumorzellen in 500 l dPBS mit 10 g/ml des Fluoreszenzfarbstoffs FAST DiI. 15 min bei 37 °C in einem 5% v/v CO2-Inkubator für die Etikettierung inkubieren, manuell nach 5 min Intervallen mischen.
   1. Um überschüssiges FAST DiI zu entfernen, fügen Sie 10 ml dPBS, Pipette sanft nach oben und unten und Zentrifuge bei 250 x g für 7 min. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml des menschlichen endothelialen Serum-freien Mediums mit 0,1% BSA (HESF + 0,1% BSA) auf.

5. Zellhaftung auf HA/C1q-Matrizen (Tag 1)

1. Vakuum-Aspirat der mit den verschiedenen Matrizen beschichteten Brunnen (Bohrungen wurden in Schritt 3.2 beschichtet).
2. Verteilen Sie 100 l der markierten Zellsuspension auf die beschichteten Brunnen und inkubieren Sie die Platte für 35 min bei 37 °C in 5% v/v CO2-Inkubator.
3. Entfernen Sie die nicht haftenden Zellen, indem Sie den Überstand anheben. Einmal mit dPBS mit 0,5% BSA, 0,7 mM Ca²⁺ und 0,7 mMMg²⁺waschen.
4. Lyse die anhaftenden Zellen durch Zugabe von 200 l/Well von 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,1% v/v SDS und sofort die 96-Well-Platte mit einem Fluoreszenzleser (544 nm, Emission 590 nm) mit einer Kalibrierkurve durch die Lyse einer zunehmenden Anzahl von markierten Zellen.

Ergebnisse

HA ist ein negativ geladenes hochmolekulares Polysaccharid, das aus sich wiederholenden (1-4)-D-Glucuronsäure-(1-3)-N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharid-Einheiten besteht (Abbildung 1B)⁷. Das Auftreten der Bindung von HA auf der 96-Well-Platte sowie die Effizienz ihrer Immobilisierung wurden unter Ausnutzung von biotinyliertem HA (bio-HA) getestet. Verschiedene Konzentrationen von Bio-HA, die von 10 g/ml bis 1 mg/ml reichten, wurden in 100...

Diskussion

Wir beschreiben eine einfache Methode, um zu untersuchen, wie die Komplementkomponente C1q, die mit Hyaluronsäure interagiert, in der Lage ist, das Verhalten von Primärzellen zu modulieren, die aus menschlichen Tumorgeweben isoliert sind. Sowohl HA als auch C1q sind sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen reichlich in der Gewebemikroumgebung vorhanden und nehmen an mehreren zellbiologischen Prozessen teil. Zum Beispiel, C1q hat sich gezeigt, in der Mikroumgebung der Plazenta vorhanden zu se...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100&dünnsp; &Mikro; m Porenfilter	BD Falcon	352360
Amphotericin B Lösung (Pilzzone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Grundlagen FGF	Immunologische Wissenschaften	GRF-15595
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C-4901
Kollagenase Typ I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldbsp;	60-00-4
EGF	Immunologische Wissenschaften	GRF-10544
FAST DiI	Molekulare Sonden, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fötales Rinderserum	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronektin	Roche	11051407001
Kolben für Zellkulturen	Corning	430639	Sterile, belüftete
Gentamicin-Lösung	Sigma-Aldbsp;	G1397-10ML
Hank' s Ausgewogene Salzlösung (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Ergänzt mit EDTA, Glukose, Penicillin-Streptamicin, Gentamicin und Fungizone
Hyaluronsäure mit hohem Molekulargewicht	Freundliches Geschenk von Prof. Ivan Donati
Humanes endotheliales Serum ohne Medium	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Ergänzt mit EGF (5& ng/mL), basischer FGF (10  ng/mL) und  1% Penicillin– Streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesiumchlorid	Carlo Erba	13446-18-9
Medium 199 mit Hank' s	Salz Sigma-Aldbsp;	M7653
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Zeitraffer-Mikroskopie	Nikon	Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	Nr. T4674