Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Summary

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Abstract

Seit vielen Jahren ist die außergewöhnlich starke und rasch gebildete Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin erfolgreich für die partielle Reinigung der biologisch wichtigen RNA/Proteinkomplexe verwendet worden. Diese Strategie leidet jedoch einen großen Nachteil, die die breitere Nutzung begrenzt: die Biotin/Streptavidin-Interaktion kann gebrochen werden, nur unter denaturierenden Bedingungen, die die Integrität der eluierten komplexe, so dass auch stören ihre anschließenden Funktionsanalyse und/oder weitere Reinigung durch andere Methoden. Darüber hinaus sind die eluierten Proben häufig mit Hintergrund-Proteine verunreinigt, die nonspecifically mit Streptavidin-Perlen, erschwert die Analyse der gereinigten komplexe durch silberne Färbung und Massenspektrometrie zuordnen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Variante der Biotin/Streptavidin-Strategie in dem Biotin ist eine RNA-Substrat über einen Foto-spaltbaren Linker angebracht und die komplexe an Streptavidin Perlen immobilisiert sind selektiv eluiert Lösung in einer nativen Form durch langwellige UV, so dass die Hintergrund-Proteine auf die Perlen. Kürzere RNA bindenden Substraten können chemisch mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker kovalent an das 5'-Ende der RNA angeschlossen synthetisiert werden, während längeren RNA Substrate mit den beiden Gruppen von komplementären Oligonukleotids bereitgestellt werden können. Diese beiden Varianten der UV-Elution Methode zur Reinigung der U7 SnRNP-abhängige Verarbeitung komplexe, die Histone Pre-mRNAs am 3'-Ende cleave getestet wurden und beide bewiesen, günstig im Vergleich zu anderen zuvor Reinigungsverfahren entwickelt. Die UV-eluiert Proben enthalten leicht nachweisbare Mengen an der U7-SnRNP, die frei von großen Protein Verunreinigungen und geeignet für die direkte Analyse von Massenspektrometrie und funktionelle Assays wurde. Das beschriebene Verfahren kann leicht für die Reinigung der andere RNA-bindende komplexe angepasst und verwendet in Verbindung mit Einzel- und Doppelstrang-DNA-Bindungsstellen zur Reinigung von DNA-spezifische Proteine und makromolekulare komplexe.

Introduction

In den Eukaryotes unterzogen RNA-Polymerase II-generierte mRNA Vorstufen (Pre-mRNAs) mehrere Reifung Ereignissen im Zellkern vor immer voll funktionsfähige mRNA-Vorlagen für die Proteinsynthese im Zytoplasma. Eines dieser Ereignisse ist 3' End-Verarbeitung. Für die überwiegende Mehrheit der Pre-mRNAs umfasst 3' Ende Verarbeitung Spaltung an Polyadenylation gekoppelt. Diese zweistufige Reaktion ist katalysiert durch ein relativ reichlich Komplex bestehend aus mehr als 15 Proteine¹. Tier-Replikation-abhängige Histon Pre-mRNAs werden am 3'-Ende durch einen anderen Mechanismus verarbeitet in denen die Schlüsselrolle von U7 SnRNP, eine niedrige Füll....

Protocol

(1) Substrataufbereitung

Hinweis: RNA Substrate kürzer als ~ 65 Nukleotide mit Biotin (B) und der Foto-spaltbaren (pc)-Linker (zusammen bezeichnet als Foto-spaltbaren Biotin oder pcB) kovalent an die RNA 5'-Ende (Cis -Konfiguration) befestigt chemisch synthetisiert werden können. RNA-Substrate, enthält deutlich mehr Bindungsstellen generierten in Vitro durch T7 (oder SP6) Transkription sein müssen und anschließend geglüht, eine kurze ergänzende Adapter Oligonukleotid mit pcB glyko-am 5'-Ende (trans -Konfiguration) (Abbildung 1).

1. Für Bindungsstellen bestehend aus weniger als ....

Results

Die UV-Elution Methode wurde getestet mit zwei chemisch synthetisierte RNA-Substraten kovalent befestigt am 5'-Ende der Platine glyko-(Cis -Konfiguration): pcB-SL (Abbildung 1) und pcB-dH3/5 m RNAs (Abbildung 2). 31-Nukleotid-pcB-SL-RNA enthält eine Haarnadelstruktur, gefolgt von einen 5-Nukleotid einzelne gestrandeten Schweif und seiner Sequenz ist identisch mit dem 3' Ende der Reife Histon mRNA (i.e., nach der.......

Discussion

Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert und neben der Einbeziehung eines Foto-spaltbaren Linkers und der UV-Elution Schritt unterscheidet sich nicht von den gängigen Methoden, die die extrem starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin nutzen. Der UV-Elution Schritt ist sehr effizient, in der Regel die Freigabe mehr als 75 % der immobilisierten RNA und Proteine aus Streptavidin Perlen, hinterlässt einen hohen Hintergrund von Proteinen, die unspezifisch an die Perlen zu binden verbunden. Durch den Wegfal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
Hochintensive, langwellige UV-Lampe	Cole-Parmer	UX-97600-00
Ersatzlampe	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Watt Quecksilberlampe H44GS-100M mit 366 nm UV-Licht (Sylvania)
RNAs und Oligonukleotide, die Biotin und photospaltbaren Linker in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) oder Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Angebot anfordern in Dharmacon
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RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 Polymerase)	Promega	P1280
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