Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

Summary

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die mit Standbildern, fluoreszierenden Bildern und hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopbildern untersucht wird. Hier wird veranschaulicht, wie quantitative Daten solche qualitativen Informationen ergänzen können.

Abstract

Um eine Cryptococcus-Infektion zu simulieren, kann Amöbe, das natürliche Raubtier von Kryptokokkenzellen in der Umgebung, als Modell für Makrophagen verwendet werden. Dieser räuberische Organismus, ähnlich wie Makrophagen, verwendet Phagozytose, um verinnerlichte Zellen abzutöten. Mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops werden Bilder erfasst, die interaktive Momente zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben darstellen. Die Auflösungskraft des Elektronenmikroskops hilft auch, die ultrastrukturellen Details von Kryptokokkenzellen zu enthüllen, wenn sie im Amöben-Lebensmittelvakuum gefangen sind. Da Phagozytose ein kontinuierlicher Prozess ist, werden quantitative Daten in die Analyse integriert, um zu erklären, was zum Zeitpunkt der Erfassung eines Bildes geschieht. Um genau zu sein, werden relative Fluoreszenzeinheiten gelesen, um die Effizienz von Amöben bei der Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden Kryptokokkenzellen mit einem Farbstoff gefärbt, der sie fluoreszieren lässt, sobald sie in der sauren Umgebung des Nahrungsvakuums gefangen sind. Wenn sie zusammen verwendet werden, können Informationen, die durch solche Techniken gesammelt werden, wichtige Informationen liefern, um Schlussfolgerungen über das Verhalten und das Schicksal von Zellen zu ziehen, wenn sie durch Amöben und möglicherweise durch andere phagozytische Zellen verinnerlicht werden.

Introduction

Mikroben haben sich im Laufe der Zeit entwickelt, um in verschiedenen ökologischen Nischen wie den offenen physikalischen Grenzen des Bodens und des Wassers, unter anderem¹, zu besetzen und zu gedeihen. In diesen Nischen liefern sich Mikroben häufig den direkten Wettbewerb um begrenzte Ressourcen; wichtig für Nährstoffe, die sie zur Unterstützung ihres Wachstums oder Raumes verwenden, die sie benötigen, um die wachsende Bevölkerung unterzubringen^2,3. In bestimmten Fällen, einige holozoische Organismen wie Amöben können sogar auf Kryptokokken-Zellen als eine Möglichkeit, Nährstoffe aus i....

Protocol

Cryptococcus neoformans und einige Acanthamoeba castellanii Stämme gelten als Biosicherheits-Level-2 (BSL-2) Krankheitserreger; Daher müssen die Forscher bei der Arbeit mit diesen Organismen angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Beispielsweise sollte das Laborpersonal über spezielle Schulungen und persönliche Schutzausrüstungen (PSA) wie Labormäntel, Handschuhe und Augenschutz verfügen. Ein biologischer Sicherheitsschrank (Stufe-2) sollte für Verfahren verwendet werden, die eine Infektion verursachen können¹⁴.

1. Kultivierung und Standardisierung von Pilzzellen (modifiziert von Madu et al.

Results

Mikroben sind mikroskopische Organismen, die nicht mit bloßem Auge wahrgenommen werden können. Ihre Auswirkungen können jedoch zu beobachtbaren klinisch offensichtlichen Krankheiten wie Hautinfektionen führen. Bei der Untersuchung bestimmter Aspekte von Mikroben, die von ihrer Morphologie, Nebenprodukten und Wechselwirkungen reichen, ist es von größter Bedeutung, Bild- und Videobeweise liefern zu können.

Wir versuchten zuerst, d.......

Discussion

In dem Papier wurden verschiedene Techniken erfolgreich eingesetzt, um das mögliche Ergebnis zu enthüllen, das entstehen kann, wenn Amöben mit Kryptokokkenzellen interagieren. Außerdem waren wir daran interessiert, die Auswirkungen von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf das Ergebnis von Cryptococcus-Amöben-Wechselwirkungen zu zeigen.

Die erste verwendete Technik war die konfokale Mikroskopie, die Standbilder wiedergab. Der hauptnachteil dieser Technik hier war, dass sie uns nur Informationen g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octan	Sigma-Aldrich	D27802-1,5-mL
Kunststofftube	Thermo Fisher Scientific	69715-15
ml Zentrifugenröhrchen	Thermo Fisher Scientific
7252018-50-ml-Zentrifugenröhrchen	Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Well Kammerobjektträger		Thermo Fisher Scientific	1109650-Aceton
	Merck	SAAR1022040LC-Amöbenstamm
	ATCCÒ	30234TM
ATCC medium 712	ATCCÒ	712TM	Amöbenmedium
Schwarz 96-Well-Mikrotiterplatte	Thermo Fisher Scientific
152089-Zentrifuge	Hermle	-
-Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432-Konfokalmikroskop
	Nikon	Nikon TE 2000-Epoxidharz
:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221 Harz	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-Dimethylaminoethanol)	[4] ALS	[4] R1067-Fluorescein-Isothiocyanat
	Sigma-Aldrich	F4274-Ameisensäure
	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Mikroplatten-Reader
Glukose	Sigma-Aldrich	G8270-Glutaraldehyd
	ALS	R1009	-
Hämozytometer	Boeco	-
-Bleicitrat	ALS
	Thermo Fisher Scientific-Methanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Orbitalschüttler
	Lasec	-	-
Osmiumtetroxid	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	Dies ist der pH-empfindliche Farbstoff
Physiologische Pufferlösung	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Rotationsschüttler
	Labcon	-
-Natriumphosphat-Puffer:
[1] Dinatriumhydrogenorthophosphat-Dihydrat	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] Natriumdihydrogenorthophosphat-Dihydrat	[2] Merck	[2] 106345
Transmissionselektronenmikroskop	Philips	Philips EM 100	-
Trypanblau	Sigma-Aldrich	T8154-Ultramikrotom
	Leica	EM UC7-Uranylacetat
	ALS	R1260A-Vakuum-Exsikkator
	Lasec	-	-
Fläschchen	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec	239210-YPD-Agar
	Sigma-Aldrich	Y-1500	-