Wir beschrieben hier, ein High-Content bildgebendes Verfahren zur Quantifizierung des Transports von Rhodopsin Mutanten mit Retinitis Pigmentosa verbunden. Eine Multiple-Wellenlänge scoring Analyse wurde zur Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche oder in der ganzen Zelle zu quantifizieren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Rhodopsin Fehlfaltung Mutationen führen zum Stab Photorezeptor Tod, die manifestiert als autosomal dominante Retinopathia Pigmentosa (RP), eine Progressive Verblindung Krankheit, die wirksame Behandlung fehlt. Wir vermuten, dass die Zytotoxizität des mutierten fehlgefaltete Rhodopsin gelindert werden kann, indem Sie pharmakologisch stabilisieren das mutierte Rhodopsin-Protein. P23H Mutation, unter die andere Klasse II Rhodopsin Mutationen, kodiert ein strukturell instabil Rhodopsin mutierte Protein, das in das endoplasmatische Retikulum (ER), akkumuliert wird, während das Wildtyp Rhodopsin in der Plasmamembran in Säugetieren transportiert wird Zellen. Wir zuvor eine Lumineszenz-basierte Hochdurchsatz-Screen (HTS) durchgeführt und identifiziert eine Gruppe von pharmakologischen Chaperonen, die den Transport von das P23H Rhodopsin aus ER auf die Plasmamembran gerettet. Hier quantifiziert ein Immunostaining Methode, gefolgt von einer hohen bildgebenden Inhaltsanalyse, wir den mutierten Rhodopsin Protein Betrag in die ganze Zelle und auf die Plasmamembran. Diese Methode ist informativ und effektiv, um wahre Hits aus Fehlalarme nach HTS identifizieren Die High-Content Bildanalyse ermöglichte darüber hinaus mehrere Parameter aus einem einzigen Experiment auszuwertende die pharmakologischen Eigenschaften von jeder Verbindung zu quantifizieren. Mit Hilfe dieser Assay, analysierten wir die Wirkung von 11 verschiedenen Verbindungen in Richtung sechs RP verbundenen Rhodopsin Mutanten, erhalten ein 2-D pharmakologischen Profil für eine quantitative und qualitative Verständnis über die strukturelle Stabilität dieser Rhodopsin-Mutanten und Wirksamkeit verschiedener Verbindungen in Richtung dieser Mutanten.
Einleitung
Protein misfolding ist Muskeldystrophie sowie neuronale Degenerationen und blendende Krankheiten, einschließlich Retinitis Pigmentosa (RP)1beteiligt. RP ist eine vererbte und progressive Degeneration der Netzhaut Mutationen in mehr als 60 Gene beeinflussen die Funktion und die Homöostase des Stabes Photorezeptoren oder die Netzhaut pigmentiert Epithele (RPEs)2,3zugeordnet. Keine wirksame Behandlung gibt es derzeit für RP. Rhodopsin Mutationen entfallen etwa 25-30 % der autosomal-Dominant (n. Chr.) RP-Fällen. Unter den mehr als 150 Rhodopsin Mutationen....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Hinweis: Das Rhodopsin Transport Assay.
1. Vorbereitung und die Kultur der Zellen
- Wiederzubeleben Sie Cryo-erhalten U2OS stabile Zellen mit dem Ausdruck der Wildtyp (WT) oder mutierte Maus Rhodopsin-Venus Fusionsproteine. Auftauen der Zellen bei 37 ° C, bis nur kleine Eiskristalle in der Flasche übrig sind.
Hinweis: Die U2OS Zellen sind in diesem Protokoll verwendet, da gibt es keine Photorezeptor-Zell-Linie für in-vitro- Studien und die Pre-ciliary Biosynthese von Rhodopsin ähnlichen molekularen Mechanismen in Säugetierzellen unterliegt. Darüber hinaus die U2OS Zellen legen fest auf der Unterseite der....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wir zeichnen die Rhodopsin-Transport mit drei Parameter: die Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (Rhodopsin-Venus INT), die Immunostaining Intensität des Rhodopsin auf der Plasmamembran (Rhodopsin INT auf der Zelloberfläche) und das Verhältnis von Rhodopsin Fleck auf der Zelloberfläche Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (MEM-Total-Ratio). Ein repräsentatives Ergebnis des Rhodopsin-Transport-Assays ist in Abbildung 3 und
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Hier zeigten wir einen High-Content imaging Assay verwendet für die Charakterisierung von Hits aus einem HTS identifiziert Die einzige Automatisierung dieser Protokolle beteiligt ist der High-Content-Imager. Die Immunostaining und Fluoreszenz-Bildgebung des Rhodopsin haben häufig verwendet, um die Lokalisierung von Rhodopsin5,14,15,16zu charakterisieren. Allerdings ist die Quantifizierung der A.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Dr. Mark E. Schurdak und University of Pittsburgh Drug Discovery Institute für die Bereitstellung von High-Content Imager und erste Schulungen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) teilten großzügig 1-4 und B630 Anti-Rhodopsin Antikörper. Das Plasmid enthält die cDNA Maus Rhodopsin-Venus Konstrukt wurde von Dr. Nevin Lambert (Augusta Universität) geteilt. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant EY024992 YC und P30EY008098 von der University of Pittsburgh Vision Forschung Core Grant unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| U2OS-Zellen (Rhodopsin-Venus) | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| U2OS-Zellen (T4R-Rhodopsin-Venus)-Zellen | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| U2OS-Zellen (P23H-Rhodopsin-Venus)-Zellen | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| U2OS-Zellen (P53R-Rhodopsin-Venus)-Zellen | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| U2OS-Zellen (C110Y-Rhodopsin-Venus) | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| U2OS-Zellen (D190N-Rhodopsin-Venus)-Zellen | NA | NA Stabile Zellen aus U2OS-Zellen | |
| U2OS-Zellen (P267L-Rhodopsin-Venus)-Zellen | NA | NA | Stabile Zellen aus U2OS-Zellen |
| DMEM mit hohem Glukosegehalt | Genesee Scientific | 25-500 | Mit L-Glutamin, Natrium Pyruvat |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Gibco | 16140071 | Hitzeinaktiviertes |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mykoplasmen-Eliminierungsreagenz |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X konzentrierte Antibiotikalösungen zur Verhinderung einer bakteriellen Kontamination von Zellkulturen |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0,25%, 1mM EDTA in HBSS ohne Calcium und Magnesium |
| Poly-L-Lysin-Lösung | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, sterilfiltriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-Well-Mikrotiterplatten mit Cuutre-Behandlung mit Black-Well-Wänden und einem optisch klaren zyklischen Olefinboden für die Bildgebung von Zellen in der High-Content-Analyse |
| Sterile 96-Well-Platte | Eppendorf | 30730119 | Gewebekultur, behandelt mit flachem Bodendeckel, steril, frei von nachweisbaren Pyrogenen, Rnase, DNase und DNA. Nicht-zytotoxisches |
| phosphatgepuffertes Sailin (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS-Puffer, pH 7,4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99,5%, Zellkulturtests |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Getestete Verbindungen | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthetisierte | NA-Verbindungen | wurden gekauft von verschiedene Anbieter oder kundenspezifisch synthetisierter |
| B6-30 Anti-Rhodopsin-Antikörper | Novus | NBP2-25160 | Geschenk von Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% Paraformaldehyd | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanolfrei |
| 10% Normales Ziegenserum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blockierungspuffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Lösung zum Färben von Kernen |
| High-Content-Imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Mikrokonfokales High-Content-Imaging-System |
| MetaXpress High-Content-Bilderfassungs- und Analysesoftware | Molekulare Bauelemente | MetaXpress | High-Content-Bilderfassungs- und Analysesoftware |
| Mehrkanalpipette (0,5-10 & Mikro; L) | Rainin | 17013802 | Manuelle 8-Kanal-Pipette, 0,5-10 & Mikro; L |
| Mehrkanalpipette (0,5-10c | Rainin | 17013805 | Manuelle 8-Kanal-Pipette, 20-200 & Mikro; L |
| Elektronische Mehrkanalpipette (10-200 μ L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Elektronische Multichanenelpipette für 96- und 384-Well-Mikrotiterplatten-Pipettieraufgaben |
| 50 ml Reagenzreservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagenzienreservierer für die Mehrkanal-Pippte-Dispensation |
| 8-Kanal-Aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Kanal-Edelstahladapter zum Ansaugen von Flüssigkeiten von 96- oder 384-Well-Platten |
| Excel Tabellenkalkulationssoftware | Microsoft | Excel2016 | Die Tabellenkalkulationssoftware für die Datenanalyse und die Erstellung |
| Heatmaps Origin2018 Software für die wissenschaftliche Datenanalyse und grafische Darstellung | OriginLab | Origin2018 | Die Datenanalysesoftware zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurven |
Referenzen
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
