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Methodenartikel

Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse

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DOI:

10.3791/58703

⸱

16. Januar 2019

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschrieben hier, ein High-Content bildgebendes Verfahren zur Quantifizierung des Transports von Rhodopsin Mutanten mit Retinitis Pigmentosa verbunden. Eine Multiple-Wellenlänge scoring Analyse wurde zur Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche oder in der ganzen Zelle zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Rhodopsin Fehlfaltung Mutationen führen zum Stab Photorezeptor Tod, die manifestiert als autosomal dominante Retinopathia Pigmentosa (RP), eine Progressive Verblindung Krankheit, die wirksame Behandlung fehlt. Wir vermuten, dass die Zytotoxizität des mutierten fehlgefaltete Rhodopsin gelindert werden kann, indem Sie pharmakologisch stabilisieren das mutierte Rhodopsin-Protein. P23H Mutation, unter die andere Klasse II Rhodopsin Mutationen, kodiert ein strukturell instabil Rhodopsin mutierte Protein, das in das endoplasmatische Retikulum (ER), akkumuliert wird, während das Wildtyp Rhodopsin in der Plasmamembran in Säugetieren transportiert wird Zellen. Wir zuvor eine Lumineszenz-basierte Hochdurchsatz-Screen (HTS) durchgeführt und identifiziert eine Gruppe von pharmakologischen Chaperonen, die den Transport von das P23H Rhodopsin aus ER auf die Plasmamembran gerettet. Hier quantifiziert ein Immunostaining Methode, gefolgt von einer hohen bildgebenden Inhaltsanalyse, wir den mutierten Rhodopsin Protein Betrag in die ganze Zelle und auf die Plasmamembran. Diese Methode ist informativ und effektiv, um wahre Hits aus Fehlalarme nach HTS identifizieren Die High-Content Bildanalyse ermöglichte darüber hinaus mehrere Parameter aus einem einzigen Experiment auszuwertende die pharmakologischen Eigenschaften von jeder Verbindung zu quantifizieren. Mit Hilfe dieser Assay, analysierten wir die Wirkung von 11 verschiedenen Verbindungen in Richtung sechs RP verbundenen Rhodopsin Mutanten, erhalten ein 2-D pharmakologischen Profil für eine quantitative und qualitative Verständnis über die strukturelle Stabilität dieser Rhodopsin-Mutanten und Wirksamkeit verschiedener Verbindungen in Richtung dieser Mutanten.

Einleitung

Protein misfolding ist Muskeldystrophie sowie neuronale Degenerationen und blendende Krankheiten, einschließlich Retinitis Pigmentosa (RP)1beteiligt. RP ist eine vererbte und progressive Degeneration der Netzhaut Mutationen in mehr als 60 Gene beeinflussen die Funktion und die Homöostase des Stabes Photorezeptoren oder die Netzhaut pigmentiert Epithele (RPEs)2,3zugeordnet. Keine wirksame Behandlung gibt es derzeit für RP. Rhodopsin Mutationen entfallen etwa 25-30 % der autosomal-Dominant (n. Chr.) RP-Fällen. Unter den mehr als 150 Rhodopsin Mutationen4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), die Klasse II-Mutationen verursachen die strukturelle Instabilität des Proteins Rhodopsin, die zum Stab Photorezeptor Tod beiträgt und Vision Verlust5,6,7,8. Die P23H ist die häufigste Rhodopsin -Mutation in Nordamerika, die auch ein typisches Beispiel für die Klasse II Rhodopsin Mutationen9,10. Aufgrund seiner inhärenten strukturelle Instabilität ist das fehlgefaltete Rhodopsin in das endoplasmatische Retikulum (ER) in Säugerzellen, angesammelt, während der Wildtyp Rhodopsin auf der Plasmamembran5befindet. Das fehlgefaltete Rhodopsin P23H mutierte Exponate dominant negativen Zytotoxizität, die nicht aufgrund von Haploinsufficiency, sondern bezieht sich auf die Aktivierung der ER Protein Degradation Weg und der unterbrochenen Stab äußere Segment Organisation verbunden. Um die Rute Photorezeptor Zelle Stress zu lindern, ist eine Strategie zur Stabilisierung der native Faltung der mutierten Rhodopsin mit pharmakologische Chaperon.

Um dieses Ziel zu erreichen, führten wir eine zellbasierten Hochdurchsatz-Screen (Cloggings)11,12,13 mit einem β-Galaktosidase Fragment Komplementierung Assay, das P23H Rhodopsin mutierte transportiert auf dem Plasma zu quantifizieren Membran. Die robuste und einfache Protokoll des HTS Assays konnten wir die Aktivitäten der rund 79.000 kleine Moleküle für jeden Bildschirm zu erkunden. Weil dieser HTS Assay Lumineszenz Signale liest, sind falsch positive Ergebnisse, einschließlich der β-gal-Hemmer jedoch farbige oder zytotoxische Substanzen in der Trefferliste, die darauf warten, von einem sekundären Assay identifiziert werden enthalten.

Die traditionelle Immunostaining und Fluoreszenz bildgebenden Verfahren wurden jahrelang zur Studie des Rhodopsin-Transports in Säugerzellen5,14,15,16. Jedoch können nicht diese konventionellen Methoden verwendet werden, um die pharmakologische Wirkungen von mehr als 10 Verbindungen in Richtung Rhodopsin Verkehr zu quantifizieren, da eine zuverlässige bildgebende Analyse erfordert eine große Anzahl von Aufnahmen unter einer sehr konsistent Bedingung, die von der konventionellen bildgebenden Verfahren nicht geändert. Hier entwickelten wir eine Immunostaining basierten High-Content imaging Protokoll als eine sekundäre Assay, der Cell Landverkehre fehlgefaltete Rhodopsin Mutanten11,13,17zu quantifizieren. Rhodopsin auf der Plasmamembran beschriften, wir dem Schritt übersprungen Permeabilisierung der Zellmembran und Immunostained die Rhodopsin-Mutanten durch einen monoklonalen (B6-30) Anti-Rhodopsin erkennen die N-terminale Epitop des Rhodopsin auf der extrazellulären Seite der Zelle Membran-18. Um das mutierte Rhodopsin in der ganzen Zelle zu visualisieren, verschmolzen wir Rhodopsin mit dem Venus-Fluoreszenz-Protein. Durch die Quantifizierung der Fluoreszenz-Intensitäten in verschiedenen Fluoreszenz Kanälen sind wir in der Lage, mehrere Parameter von einem einzigen Experiment einschließlich der gesamten Rhodopsin-Intensität in der ganzen Zelle auf der Zelloberfläche und das Verhältnis von zu erhalten Rhodopsin Fluoreszenz auf der Zelloberfläche, die in der ganzen Zelle. Anwendung dieser Methode zu stabilen Zellen insgesamt sechs fehlgefaltete Rhodopsin durch Mutation entstehende Variationen zum Ausdruck zu bringen, können wir eine pharmakologische Profil der mehrere kleine Molekül Chaperone gegenüber diesen Mutanten erzeugen. In diesem Protokoll alle Zellen sind Immunostained in einem 384-Well-Platte und abgebildet, mit einem automatisierten imaging System unter einer sehr konsistent bildgebenden Bedingung. Eine Bildanalyse erfolgt in jede Vertiefung, mit Bildern von mehr als 600 Zellen Variante aufgrund der Heterogenität der Zellen mit unterschiedlichen Zellebene Form und Protein-Expression zu reduzieren. Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1zusammengefasst. Der Vorteil dieser Methode ist, dass wir hochauflösende Bilder sowie Multi-Parameter-Quantifizierungen aus der Image-basierte Analyse erhalten. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll geändert und angewendet, um den Transport fehlgefaltete Membran Proteins des Interesses zu quantifizieren.

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Protokoll

Hinweis: Das Rhodopsin Transport Assay.

1. Vorbereitung und die Kultur der Zellen

  1. Wiederzubeleben Sie Cryo-erhalten U2OS stabile Zellen mit dem Ausdruck der Wildtyp (WT) oder mutierte Maus Rhodopsin-Venus Fusionsproteine. Auftauen der Zellen bei 37 ° C, bis nur kleine Eiskristalle in der Flasche übrig sind.
    Hinweis: Die U2OS Zellen sind in diesem Protokoll verwendet, da gibt es keine Photorezeptor-Zell-Linie für in-vitro- Studien und die Pre-ciliary Biosynthese von Rhodopsin ähnlichen molekularen Mechanismen in Säugetierzellen unterliegt. Darüber hinaus die U2OS Zellen legen fest auf der Unterseite der Platte und haben große Zelle Körper, sie sind also ideal für die Rhodopsin-Transport-Assay. Sieben U2OS stabile Zellen mit dem Ausdruck der WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N und P267L Rhodopsin Mutanten dienen hier als ein Beispiel für die Qualität und Zuverlässigkeit des Tests zeigen. Stabile Zellen mit dem Ausdruck andere Rhodopsin-Mutanten oder andere Membranproteine können je nach Ziel des Tests verwendet werden. Stabile Zellen mit dem Ausdruck menschlicher Rhodopsin können falls vorhanden in diesem Test verwendet werden. Die Maus Rhodopsin wurde hier verwendet, da Maus und menschlichen Rhodopsin Proteine 95 % Homologie teilen, und die Verbindungen von diesem Test identifiziert werden getestet in Vivo mit einem Mausmodell AdRP tragen das Rhodopsin P23H Mutation8. Die stabile Zellen entstanden bereits19beschrieben. WT und mutierten Rhodopsin Transkripte wurden durch die Q-PCR quantifiziert und die Klone des stabilen Zellen auszudrücken vergleichbarem WT und mutierten Rhodopsin Transkripte wurden für diesen Test ausgewählt. Die Expression von Proteinen Rhodopsin bestätigte Immunoblot und Immunostaining. Im Laufe der in diesem Test verwendeten Zellen sollte kleiner als 20 sein.
  2. Übertragen Sie jede Zeile der Zellen in einer 15 mL konische Röhrchen mit 10 mL Wachstumsmedium (hohe Glukose Dulbecco modifiziert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 5 µg/mL Plasmocin).
  3. Zentrifugieren der Röhre bei 200 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL der Zelle Wachstumsmedium für jede Zelllinie. Jede Zeile der Zellsuspension in einer Kulturschale 60 mm Gewebe übertragen und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2.
  4. Subkultur der Zellen erreicht die Gewebekultur-Schüssel 90 % Zusammenfluss als Referenz12beschrieben.

2. Aussaat Zellen bei 5.000 Zellen pro Bohrloch

Hinweis: Führen Sie die folgenden Verfahren in einer Gewebekultur-Haube.

  1. Die Platte mit Poly-Lysin zu behandeln.
    1. Einen Tag vor der Aussaat der Zellen behandeln eine schwarze-Wand und klare unten 384-Well-Platte mit 20 µL/Well Poly-Lysin-Lösung für 30 min.
    2. Abzusaugen Sie die Flüssigkeit und erlauben Sie alle Brunnen trocknen für 1 Stunde Platte Deckel zurückgestellt und speichern Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht für die Zelle Saat.
  2. Bereiten Sie die Zellsuspension.
    1. Jede Zelllinie im Wachstumsmedium in der Kulturschale 100 mm Gewebe bis zu 90 % Zusammenfluss Kultur.
    2. Waschen Sie jedes Gericht mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und lösen die Zellen mit 0,05 % 1 mL Trypsin bei 37 ° C.
    3. Jede Zeile der Zellen in 10 mL Assay Medium (High-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin) aufzuwirbeln.
    4. Zählen der Zellen und jede Zeile von Zellen auf 1,25 x 105 Zellen/mL mit dem Assay-Medium zu verdünnen.
  3. Samen der Zellen.
    1. Verwenden Sie eine elektronische Mehrkanal-Pipette oder einem automatisierten Reagenz Dispenser 40 µL/Well der Zellsuspension auf drei Spalten pro Zell-Linie und Füllung Spalten 1-21 von 384-Well-Platte (Abbildung 2) zu verzichten.
    2. Hinzufügen von 40 µL/Well des U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) Spalten 22-23 und 40 µL/Well des U2OS (Rhodopsin-Venus) Spalte 24, als Steuerelemente.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte 300 X g für 30 s, um alle Zellen am unteren Rand der 384-Well-Platte zu bringen.
      Hinweis: Vermeiden Sie Erschütterungen auf die Platte nach der Aussaat der Zelle. Andernfalls Zellen werden zu einer Ecke jedes gut zerkleinert werden, und die Platte werden nicht geeignet für High-Content-Bildgebung.
    4. Inkubieren Sie 384-Well-Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 3 h für die Zellen an der Unterseite der Platte befestigen.

3. Behandlung der Zellen mit Verbindungen

  1. Erstellen Sie eine Platte Karte mit Behandlungsbedingungen wie in Abbildung 2dargestellt.
  2. Bereiten Sie 300 µL 5 x Gebrauchslösungen von bis zu 15 Verbindungen in einer 96-Well-Platte.
    1. Verdünnen Sie cps 1 bis 15 mit dem Assay Medium bis fünfmal ihre endgültige Konzentrationen in Brunnen A1, G2 von 96-Well Platte (Abbildung 2A). 300 µL Assays Medium in gut H2 hinzufügen.
      Hinweis: Die Endkonzentration von jeder Verbindung bei der wirksamste Konzentration dient für den Transport von das P23H Rhodopsin Rettung durch das HTS12,13.
    2. Hinzufügen von 100 µL pro Bohrloch von 2 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 25 µM 9 -Cis-Retinal, die mittelfristig Assay Spalten 11 und 12, bzw. verdünnt werden. Fügen Sie 9 -Cis-retinal bei schwachem Licht.
  3. Hinzufügen von 10 µL pro Bohrloch 5 x funktionierende Lösungen, die 384-Well-Platte mit den Zellen (Abb. 2 b) kultiviert.
    1. Verwenden Sie eine elektronische Multi-Kanal-Pipette hinzu Verbindungen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 Zeilen A, C, E, G, ich, K, M und O aus Spalten 1 bis 21 (Abbildung 2). Hinzufügen von Verbindungen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 und M Zeilen B, D, F, H, J, L, N und P aus Spalten 1 bis 21.
    2. Spalten, 22 und 24 10 µL pro Bohrloch von 2 % DMSO hinzufügen. Fügen Sie 10 µL pro Bohrloch von 25 µM 9 -Cis-retinal Spalte 23.
      Hinweis: DMSO ist als eine Fahrzeugkontrolle verwendet, da alle Verbindungen wie Aktien zunächst in DMSO gelöst sind. Spalte 22 mit DMSO behandelt Zellen mit dem Ausdruck der P23H Rhodopsin als die 0 %-Steuerelement verwendet wird. 9 -Cis-retinale behandelte Zellen mit dem Ausdruck des P23H Rhodopsin wird als 100 % ige Kontrolle verwendet.
  4. Decken Sie 384-Well-Platte mit Alu-Folie ab und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 24 h.

4. Immunostaining ohne Membran Permeabilisierung Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche zu beflecken.

Hinweis: Vermeiden Sie Reinigungsmittel im gesamten Immunostaining Prozess Zellmembran intakt zu halten.

  1. Bereiten Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) durch eine Verdünnung der 16 % PFA mit PBS in einer 1:4-Volumen-Verhältnis in einem chemischen Abzug. Übertragen Sie die 4 % PFA in einem Reagenz-Reservoir.
  2. Nehmen Sie die 384-Well-Platte in einem dunklen Raum mit roten Dämmerlicht. Verwenden Sie eine 8-Kanal-Absauganlage mit einem Vakuum Sammelflasche verbunden, um sanft das Medium Aspirieren. Mit Hilfe einer elektronischen Mehrkanal-Pipette hinzu 20 µL pro Bohrloch von frisch zubereiteten 4 % PFA, die gesamte 384-Well-Platte und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zur Vermeidung von Zelle Ablösung immer zeigen Sie die Spitzen der Absauganlage auf der gleichen Seite von jedem Bohrloch während Bestrebungen. Berühren Sie nicht den mittleren unteren Bereich des jedes gut. Bei der Einnahme von Bildern wählen Sie Felder aus die Region durch die Absauganlage berührt zu vermeiden. Decken Sie für Inkubationen länger als 10 min die 384-Well-Platte mit dem Deckel um Verdunstung zu vermeiden.
    Hinweis: Zellen sind fixiert in einem dunklen Raum Immunofluoreszenz von regenerierten Isorhodopsin zu vermeiden, die das Ergebnis von 100 % Kontrolle auswirkt. Nach der Fixierung kann die 384-Well-Platte unter normalem Licht herausgenommen werden.
  3. Verwenden Sie eine 8-Kanal-Absauganlage Aspirieren der PFA in jede Vertiefung und mit Hilfe einer elektronischen Multi-Kanal-Pipette hinzu 50 μL pro Well von PBS. Wiederholen Sie die zweimal drei Wäschen mit PBS durchführen.
    Achtung: Die Abfälle Flüssigkeit enthaltenden PFA werden in einer verschlossenen Flasche gesammelt und nach dem Experiment als ein gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden soll.
  4. Blockieren Sie die Zellen zu, indem Sie die gesamte 384-Well-Platte 20 µL pro Bohrloch von 5 % Ziegenserum hinzufügen und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
  5. 5 % Ziegenserum Aspirieren und Zeilen A O. hinzufügen 15 µL pro Bohrloch von 1 % Ziegenserum Zeile P für den sekundären Antikörper nur Kontrollgruppe 15 µL pro Bohrloch von 20 µg mL-1 B6-30 Anti-Rhodopsin Antikörper in 1 % Ziegenserum hinzufügen.
  6. Über Nacht inkubieren Sie die 384-Well-Platte bei Raumtemperatur für 90 min oder bei 4 ° C. Decken Sie die 384-Well-Platte mit Alu-Folie, Immunofluoreszenz die Fluorophore zu vermeiden.
  7. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 50 µL pro Bohrloch von PBS.
  8. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 15 µL pro Bohrloch 5 µg mL-1 Ziege Cy3 konjugierten Anti-Maus IgG Antikörper hinzu. 384-Well-Platte mit Alufolie abdecken und bei Raumtemperatur 1 h oder bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
  9. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 50 µL pro Bohrloch von PBS. Fügen Sie 50 µL pro Bohrloch von PBS mit 1 µg mL-1 Hoechst 33342 Kerne bei Raumtemperatur 15 min. Fleck.
  10. 384-Well-Platte mit einer transparenten Folie vor Bildgebung zu versiegeln. Decken Sie 384-Well-Platte mit Alufolie ab und bei 4 ° C bis zu einer Woche zu speichern Sie, wenn Bilder sofort getroffen werden.

(5) Imaging.

Hinweis: Dieses High-Content bildgebende Verfahren wird an das Abbildungssystem aufgeführt in der Tabelle des Materialsangepasst. Verfahren können wenn andere High-Content bildgebenden Systemen unterscheiden.

  1. Entfernen Sie den Deckel und 384-Well-Platte in den High-Content-Imager mit A1 auf der oberen linken Ecke der Platte positioniert.
  2. Öffnen Sie die Bild-Datenerfassungs-Software für die Bildaufnahme einstellen.
    1. Die Platte Erwerb Setup-Fenster zu öffnen und neue Einstellung erstellen oder Laden einer bestehenden Setup-Datei.
    2. Wählen Sie die 20 X Objektiv und richten Sie Pixel binning 2, so dass die kalibrierten Pixelgröße 0,80 x 0,80 µm. Stellen Sie die Scanlinien als 2.000 und die Bildgröße (W x H) 1.000 x 1.000 Pixel (800,00 x 800,00 µm) pro Seite.
    3. Wählen Sie den Teller, abgebildet werden. Verwenden Sie die Informationen des Herstellers von 384-Well-Platte, um in den Dimensionen der Platte zu füllen.
    4. Wählen Sie die Vertiefungen für die 384-Well-Platte abgebildet werden.
    5. Wählen Sie aus vier Seiten pro Bohrloch abgebildet werden. Vermeiden Sie die Seite des gut gerührt von der Aspiration-Tipps.
    6. Wählen Sie Anregung Laser als 405, 488 und 561 nm. Wählen Sie Emission Filter für DAPI, FITC und Texas Red-Kanäle. Optimieren Sie die Laserleistung und Gewinne von jedem Kanal, um die Helligkeit der Bilder aus der Positivkontrolle Brunnen sicherzustellen sind kleiner als die Sättigung-Schwellenwert.
    7. Wählen Sie gut-zu-gut-Fokus für den Autofokus. Wählen Sie die erste Bohrung als erster gut für die Suche nach Proben erworben. Set Seite Autofokus an allen Standorten.
    8. Wählen Sie aus vier Durchschnittswerte pro Zeile für jeden Kanal. Optimieren Sie den Z-Offset-Wert für jeden Kanal.
    9. Test 2-3 Brunnen an den diagonalen Ecken von 384 well-Platte um sicherzustellen, dass die Bilder sind im Vordergrund für alle getestete Brunnen, Bilder von allen Seiten pro Bohrloch Zellen mit mehr als 40 % Confluence und Fluoreszenz-Intensitäten aller Kanäle haben etwa die Hälfte in der 100 % gesättigt sind Kontroll-Vertiefungen.
    10. Speichern Sie das Bild Erwerbsmethode.
  3. Führen Sie die gesamte Platte. Den Imager zu sehen, bis es beendet, Aufnahmen aus der ersten Spalte der Platte auf die Bildqualität überprüfen vor dem Verlassen des Imagers. 384-Well-Platte herausnehmen und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
    Hinweis: Abhängig von der Anzahl der Seiten pro Brunnen und Kanäle genommen ausgewählt, dauert es 40 min bis 3 h, imaging ein 384-Well-Platte zu beenden.

(6) Bildanalyse.

  1. Ziehen Sie die Bilddaten mit einer High-Content Bildanalyse-Software. Wählen Sie eine der 100 % ige Kontrolle Brunnen (Spalte 23) einstellen.
  2. Wählen Sie die Multi-Wellenlänge Zelle Scoring als Analysemethode und Einstellungen konfigurieren.
    1. Definieren Sie die Kerne mit Bildern aus der DAPI-Kanal. Vorschau anzeigen Sie, um sicherzustellen, dass die definierten Kerne Formen in den ausgewählten passt gut auch mit den Kernen Bildern.
    2. Definieren Sie die Form der Zelle in der FITC-Kanal wo Rhodopsin-Venus abgebildet wird.
    3. Definieren Sie das Rhodopsin Zellbereiche Oberfläche Fleck im Texas Rot-Kanal.
    4. Testen Sie die aktuelle Algorithmus in 5 Brunnen um festzustellen, ob die Einstellungen optimiert werden. Speichern Sie die Einstellungen und schließen Sie das Konfigurationsfenster .
  3. Führen Sie alle Brunnen mit der optimierten Analysemethode.
  4. Exportieren Sie Objektnummer als intakte Zellennummer. Die Durchschnittliche Intensität der FITC-Kanal als Rhodopsin-Venus Intensität (Rhodopsin-Venus INT) exportieren. Die Durchschnittliche Intensität des Texas Red Kanals als Rhodopsin Intensität auf der Zelloberfläche (Rhodopsin INT auf der Zelloberfläche) exportieren.
  5. Öffnen Sie die exportierten Daten in eine Tabellenkalkulation. Teilen Sie die Rhodopsin-Intensität auf der Zelloberfläche durch die Rhodopsin-Venus INT als MEM-insgesamt Verhältnis. Berechnen Sie die Z'-Faktoren für jeden Parameter zur Bewertung der Assay-Qualität. Z′ = 1−3X (STD+100 % KontrolleSTD0 % Steuern) / | Meine100 % ige Kontrolle−Mean0 % Steuern|
    Hinweis: Z'-Faktor höher als 0 steht für eine moderate Assay ausreichend für einen High-Content-Bildschirm und ein Z' Faktor zwischen 0,5 und 1 schlägt einen herausragenden Assay für eine Hochdurchsatz-Bildschirm20,21erforderlich.
  6. Verwenden Sie der Tabellenkalkulations-Software zum Generieren einer Zweifarben-Heatmap für jeden Parameter. Ordnen Sie den Namen des Zell-Linien auf der X-Achse und die Verbindungen auf der Y-Achse.

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Ergebnisse

Wir zeichnen die Rhodopsin-Transport mit drei Parameter: die Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (Rhodopsin-Venus INT), die Immunostaining Intensität des Rhodopsin auf der Plasmamembran (Rhodopsin INT auf der Zelloberfläche) und das Verhältnis von Rhodopsin Fleck auf der Zelloberfläche Rhodopsin-Venus-Intensität in der ganzen Zelle (MEM-Total-Ratio). Ein repräsentatives Ergebnis des Rhodopsin-Transport-Assays ist in Abbildung 3 und

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Diskussion

Hier zeigten wir einen High-Content imaging Assay verwendet für die Charakterisierung von Hits aus einem HTS identifiziert Die einzige Automatisierung dieser Protokolle beteiligt ist der High-Content-Imager. Die Immunostaining und Fluoreszenz-Bildgebung des Rhodopsin haben häufig verwendet, um die Lokalisierung von Rhodopsin5,14,15,16zu charakterisieren. Allerdings ist die Quantifizierung der A...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei Dr. Mark E. Schurdak und University of Pittsburgh Drug Discovery Institute für die Bereitstellung von High-Content Imager und erste Schulungen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) teilten großzügig 1-4 und B630 Anti-Rhodopsin Antikörper. Das Plasmid enthält die cDNA Maus Rhodopsin-Venus Konstrukt wurde von Dr. Nevin Lambert (Augusta Universität) geteilt. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant EY024992 YC und P30EY008098 von der University of Pittsburgh Vision Forschung Core Grant unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
U2OS-Zellen (Rhodopsin-Venus)NANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (T4R-Rhodopsin-Venus)-ZellenNANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (P23H-Rhodopsin-Venus)-ZellenNANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (P53R-Rhodopsin-Venus)-ZellenNANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (C110Y-Rhodopsin-Venus)NANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (D190N-Rhodopsin-Venus)-ZellenNANA Stabile Zellen aus U2OS-Zellen
U2OS-Zellen (P267L-Rhodopsin-Venus)-ZellenNANAStabile Zellen aus U2OS-Zellen
DMEM mit hohem GlukosegehaltGenesee Scientific25-500Mit L-Glutamin, Natrium Pyruvat
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco16140071Hitzeinaktiviertes
PlasmocinInvivoGenant-mptMykoplasmen-Eliminierungsreagenz
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco15140122100X konzentrierte Antibiotikalösungen zur Verhinderung einer bakteriellen Kontamination von Zellkulturen
Trypsin-EDTAGenesee Scientific25-5100,25%, 1mM EDTA in HBSS ohne Calcium und Magnesium
Poly-L-Lysin-LösungSigma-AldrichP4707-50MLMol wt 70.000-150.000, 0,01%, sterilfiltriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
CellCarrier-384 Ultra MicroplatesPerkinElmer6057300384-Well-Mikrotiterplatten mit Cuutre-Behandlung mit Black-Well-Wänden und einem optisch klaren zyklischen Olefinboden für die Bildgebung von Zellen in der High-Content-Analyse
Sterile 96-Well-PlatteEppendorf30730119Gewebekultur, behandelt mit flachem Bodendeckel, steril, frei von nachweisbaren Pyrogenen, Rnase, DNase und DNA. Nicht-zytotoxisches
phosphatgepuffertes Sailin (PBS)InvitrogenAM962510 x PBS-Puffer, pH 7,4
DMSOSigma-AldrichD4540>99,5%, Zellkulturtests
9-cis-retinalSigma-AldrichR5754
Getestete VerbindungenSelleckchem/Life Chemicals/Custom synthetisierteNA-Verbindungenwurden gekauft von verschiedene Anbieter oder kundenspezifisch synthetisierter
B6-30 Anti-Rhodopsin-AntikörperNovusNBP2-25160Geschenk von Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-SekundärantikörperJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc115-165-146
16% ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908Methanolfrei
10% Normales ZiegenserumThermo Fisher Scientific50062ZBlockierungspuffer
Hoechst 33342, TrihydrochInvitrogenH3570Lösung zum Färben von Kernen
High-Content-ImagerMolecular DevicesImageXpressImageXpress® Mikrokonfokales High-Content-Imaging-System
MetaXpress High-Content-Bilderfassungs- und AnalysesoftwareMolekulare BauelementeMetaXpressHigh-Content-Bilderfassungs- und Analysesoftware
Mehrkanalpipette (0,5-10 & Mikro; L)Rainin17013802Manuelle 8-Kanal-Pipette, 0,5-10 & Mikro; L
Mehrkanalpipette (0,5-10cRainin17013805Manuelle 8-Kanal-Pipette, 20-200 & Mikro; L
Elektronische Mehrkanalpipette (10-200 μ L)Thermo Scientific14-3879-56BTElektronische Multichanenelpipette für 96- und 384-Well-Mikrotiterplatten-Pipettieraufgaben
50 ml ReagenzreservoirGenesee Scientific28-125Reagenzienreservierer für die Mehrkanal-Pippte-Dispensation
8-Kanal-AspiratorABC ScientificEV5038-Kanal-Edelstahladapter zum Ansaugen von Flüssigkeiten von 96- oder 384-Well-Platten
Excel TabellenkalkulationssoftwareMicrosoftExcel2016Die Tabellenkalkulationssoftware für die Datenanalyse und die Erstellung
Heatmaps Origin2018 Software für die wissenschaftliche Datenanalyse und grafische DarstellungOriginLabOrigin2018Die Datenanalysesoftware zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurven
von

Referenzen

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
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