Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten

Zusammenfassung

Aufbau einer stabilen Zelllinie überexprimierenden gen des Interesses Genfunktion zu studieren kann durch stabile Transfektion-Kommissionierung einzelnen Klone nach transfecting sie über retroviralen Infektion durchgeführt werden. Hier zeigen wir, dass HT29-DR3 Zelllinien erzeugt auf diese Weise die Mechanismen aufzuklären, welche, die Tod Rezeptor 3 (DR3) zum Mitosehemmstoffen-induzierten Apoptose beiträgt.

Zusammenfassung

Die Funktion eines Gens von Interesse kann erreicht werden, durch die Manipulation der Ebene des Ausdrucks, wie seinen Ausdruck mit Knockdown Zelllinien verringern oder erhöhen ihren Ausdruck mit Überexpression Zelllinien. Transiente und stabile Transfektion sind zwei Methoden, die häufig für exogene Genexpression verwendet werden. Transiente Transfektion eignet sich nur für kurzfristige Ausdruck, während beständigen Transfection erlaubt exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle integriert werden, wo wird es kontinuierlich zum Ausdruck gebracht werden. Infolgedessen wird beständigen Transfection normalerweise für die Forschung in langfristige genetische Regulation eingesetzt. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll um eine stabile Zelllinie überexprimierenden tagged Tod Rezeptor 3 (DR3) DR3 Funktion erkunden zu generieren. Wir entschieden uns für einzelne Klone nach einer retroviralen Infektion um die Homogenität und Reinheit der stabilen Zelllinien erhalten. Die stabilen Zelllinien erzeugt unter Verwendung dieses Protokolls Rendern DR3-defizienten HT29-Zellen empfindlich gegenüber antimitotic Medikamente, somit Neuaufbau der Apoptotic Antwort in HT29-Zellen. Darüber hinaus das FLAG Tag auf DR3 kompensiert die Nichtverfügbarkeit von guten DR3 Antikörper und erleichtert die biochemische Untersuchung des molekularen Mechanismus mit dem antimitotic Agents Apoptose induzieren.

Einleitung

Heterologe Genexpression wird oft eingesetzt, um die Funktion von Genen von Interesse zu untersuchen. Zwei Methoden, transiente und stabile Transfektion werden hauptsächlich in den Zellen und Molekularbiologie verwendet, um ein Segment von DNA oder RNA in einem Host Zelle^1,2einfügen. Transient transfizierten DNA oder RNA werden nicht an Tochterzellen, weitergegeben also die genetische Veränderung nur für einen kurzen Zeitraum beibehalten werden kann. Auf der anderen Seite sind stabil transfizierten Zellen exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle, Erhaltung der seinen Ausdruck in der Zell-Linie integriert. So ist beständigen Transfection eine Methode, die normalerweise reserviert ist für die Erforschung langfristiger Genregulation. Die stabile Zelllinie kann auch transplantiert werden, wie Xenotransplantate in Mausmodellen für in Vivo ³studieren. Beständigen Transfection kann in zwei Kategorien unterteilt werden: virale und nonviral. Im Vergleich zu nonviral Transfektion, kann virale Infektion Gene in einer größeren Vielfalt von menschlichen Zellen mit einer höheren Effizienz^4,5,6,7übertragen. Darüber hinaus bietet eine stabile Zelllinie aus einem einzigen Klon den Vorteil klonalen Reinheit und Homogenität.

Unkontrolliertem Zellwachstum und Division sind die am meisten charakteristischen Merkmale von Krebs. Im klinischen sind antimitotic Agents die primären Behandlungen für viele Arten von Tumoren⁸. Jedoch können nicht einige erheblichen Einschränkungen der antimitotic Agents ignoriert werden. Zuerst diese Chemotherapien können auch normale Zellen zusammen mit den unerwünschten Krebszellen töten und somit schwere Nebenwirkungen⁸führen können. Zweite, antitubulin Medikamente sind nicht wirksam gegen alle Arten von Tumoren, trotz Tubulin der allgegenwärtige Ausdruck in einer Vielzahl verschiedener Gewebe als ein Zellskelett Protein^9,10. Es ist unklar, warum antitubulin Agenten vielversprechende Wirksamkeit gegen zeigte Eierstock-, Lungen- und hämatologischen Krebserkrankungen in der klinischen Behandlung, aber nicht in Niere, Darm oder Pankreaskarzinome¹¹. Schließlich können auch Patienten mit der gleichen Art des Tumors auf die Mitosehemmstoffen anders auf unvorhersehbare Weise reagieren. Gibt es möglicherweise ein wichtiger Effektor-Molekül, das die Empfindlichkeit der verschiedenen Patienten antimitotic Agents, wodurch die unterschiedlichen Ergebnisse in klinischen Behandlung¹²gesehen betrifft. Daher sollte die potenzielle differentielle Befindlichkeiten der Patienten antimitotic Behandlung berücksichtigt werden um therapeutische Interventionen¹³zu optimieren.

Ein Hochdurchsatz-Vollständiggenom SiRNA-Bibliothek-Bildschirm gezeigt, dass DR3 Zuschlag lichtempfindlichen Zellen resistent gegen antimitotic Drogen eine Rolle für DR3 Chemotherapie-induzierte Apoptose¹⁴verwickelt sein könnte. Als Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie berichtet DR3 Zellapoptose in verschiedenen Systemen^15,16,17,18zu vermitteln. So brachen wir zu stabilen Zelllinien überexprimiert DR3 um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, mit denen antimitotic Drogen Apoptose induzieren. Eine entsprechende Zellenmodell für das Studium DR3 Überexpression menschlichen Dickdarm-Krebs-Zelllinie HT29, arrangiert für die DR3-defizienten sein gefunden wurde. Darüber hinaus in der Klinik Doppelpunkt Krebsarten sind unempfindlich gegen Antimitotic Drogen¹⁹.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die Generation eine stabile Zelllinie HT29-DR3 durch retroviral Infektion ermöglicht. Weiter zeigen wir wie man DR3 Ausdruck in diesen Zellen verwenden westliche Beflecken zu validieren und wie die Empfindlichkeit gegenüber antimitotic Agents beurteilt mithilfe einer Zelle Lebensfähigkeit Assay und morphologische Beobachtung. Die Zellen werden aus einzelnen Klone verstärkt und somit haben den Vorteil von einem homogenen genetischen Hintergrund. Darüber hinaus erlaubt die FLAG-Tag auf DR3 zur Visualisierung von zellulären DR3 durch Mikroskopie und Analyse von gen-Ausdruck und Protein-Interaktion durch biochemische Ansätze. Darüber hinaus kann die Zellen xenografted bei Mäusen, Tumorprogression als Reaktion auf Mitosehemmstoffen in Vivo¹⁴weiter zu analysieren.

Die hier vorgestellten HT29-DR3-Zellsystem angeboten ein wirksames Instrument für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der wie Mitosehemmstoffen Krebs Zellen¹⁴töten. Da Überexpression und Knockdown Zelllinien gemeinsamen Werkzeuge für das Studium der Genfunktion sind, kann dieses Protokoll leicht mit anderen Genen von Zinsen oder anderen Zelllinien angepasst und so verwandelte sich in einen extensiv genutzte Ansatz.

Protokoll

Bitte beachten Sie, dass alle Maus-Experimente, die hier beschrieben wurden genehmigt und im Einklang mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Tsinghua University durchgeführt.

1. Generation DR3 Überexpression Zell-Linien

1. Das Plasmid für DR3 Ausdruck (pMXs IRES-DR3-Flag "") zu konstruieren, durch Einfügen von Full-length DR3 cDNA mit 3 x Flagge am C-Terminus in retroviral Vektor Blasticidin IRES pMXs an den Standorten der Beschränkung der BamHI/XhoI.
2. Plat-A Zellen in 60 mm Schalen mit 4 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) wachsen. Am nächste Tag, wenn die Zellen erreichen 80-90 % Zusammenfluss, transfizieren Zellen mit 2 μg des Plasmids pMXs-IRES-DR3-FLAG verwenden Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) gemäß des Herstellers manuelle²⁰.
3. Nach 72 h sammeln des Überstands, Filtrat der Medien mit einem 0,45 μm Sterilfilter und halten die virale Aussetzung im Dunkeln bei 4 ° C.
4. Wachsen Sie HT29-Zellen in DMEM in einer 60 mm Petrischale und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
5. Infizieren Sie am nächsten Tag, wenn die Zellen 30 % - 50 % Zusammenfluss erreichen, die Zellen mit 2 mL virale Suspension in Anwesenheit von 8 μg des 1,5-Dimethyl-1,5-Diazaundecamethylene Polymethobromide pro Milliliter der viralen Suspension. Aspirieren Sie nach 4-6 h Inkubation bei 37 ° C die virale Aussetzung, 4 mL frische DMEM hinzufügen und die Schüssel in den Inkubator zurück.
6. Entsorgen Sie die Medien aus der Gerichte 24 h Postinfection und waschen Sie Zellen mit 2 mL PBS vorgewärmte sorgfältig zu. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA zu den Zellen und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.
7. Stoppen Sie nach der Beobachtung unter dem Mikroskop bei 10facher Vergrößerung, die meisten Zellen getrennt haben die Trypsinization mit 2 mL des kompletten DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Sammeln Sie die Zellsuspension in einer 15 mL Tube und Zentrifugieren der Zellen bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
8. Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL DMEM. Mischen Sie gut durch sanft auf und ab pipettieren. Verdünnen Sie die Zellen durch Faktoren von 30, 100 und 300. Samen der Zellen in 150 mm Schalen mit 20 mL DMEM mit 1 µg/mL Blasticidin. ~ 1-2 Wochen bei einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren.
9. Während dieser Zeit beobachten Sie die Kolonien jeden Tag mit einem inversen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Markieren Sie die gut isolierten Kolonien an der Unterseite der Schale, wenn der Kolonie-Durchmesser ca. 1-2 mm beträgt.
10. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 3 mL vorgewärmten PBS. Fügen Sie 2 Milliliter Trypsin-EDTA in ein 60 Millimeter-Teller. Verwenden Sie sterile Pinzetten abholen autoklaviert sterile Klonen Zylinder, und legen Sie sie in die 60 Millimeter-Teller. Abholung der Zylinder mit Trypsin-EDTA und legen Sie sie sanft über den markierten Kolonien. Stellen Sie sicher alle Klonen Zylinder nur eine Kolonie enthält und Kontamination mit nahe gelegenen Kolonien vermeiden.
11. Das Gericht in den Inkubator für 3 Minuten zurück.
12. Überprüfen Sie nach 3 min die Zellen unter dem Mikroskop bei 10facher Vergrößerung zu sehen, ob sie getrennt haben. Wenn die Zellen erhöht haben, fügen Sie 70 μL Kulturmedium für jeden Zylinder, die Trypsin zu inaktivieren hinzu. Mischen Sie vorsichtig die Zellsuspension mit einer 200 μl Pipette. Achten Sie darauf, nicht den Zylinder während dieses Prozesses zu bewegen.
13. Übertragen Sie die Zellsuspension von jeder Kolonie auf zwei 24-Well-Platten mit 1 mL DMEM pro Bohrloch. Fügen Sie 30 μl Zellsuspension pro Bohrloch in der Platte A und 70 μL in den entsprechenden Bohrungen in Platte B. Label die Platten richtig und setzen Sie sie wieder in den Inkubator.

2. Überprüfung der Überexpression Zelllinie DR3

1. Wenn die Zellen in Platte B am Zusammenfluss von 90 % sind, entfernen Sie das Medium und sorgfältig waschen der Zellen mit 1 mL PBS. Vollständig zu entfernen Sie PBS und lösen Sie die Zellen mit 50 μL von 1 x SDS-PAGE laden Puffer. Übertragen Sie die Zelle Lysates von 24-Well-Platte auf 1,5 mL Zentrifuge Röhren und Kochen Sie die Proben 10 min bei 100 ° C.
2. Laufen Sie die Proben auf 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Gel mit einer konstanten Spannung von 80 V für 15 min und dann bei 120 V für 1 h.
3. Übertragen das Protein zu einer Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran durch nasse Übertragung bei einem konstanten Strom von 400 mA für 2 h.
4. Testausdruck DR3 in verschiedene Klone mit Anti-FLAG Antikörper, Verwendung der Wildtyp HT29-Zellen als Negativkontrolle (Abbildung 1). Verdünnen Sie den primären Antikörper mit einem Faktor von 5.000 bei 5 % fettfreie Milch, die in TBST aufgelöst wird (Tris-gepufferte Kochsalzlösung enthält 0,1 % Tween-20). Über Nacht inkubieren Sie die Membran mit FLAG Antikörper bei 4 ° C.
5. Waschen Sie die Membran mit TBST durch Schütteln es auf einen decoloring Shaker bei 200 u/min bei RT. Aktualisierung TBST alle 5 min für eine Gesamtmenge von 15 min Waschzeit.
6. Inkubieren Sie die Membran mit Anti-Maus Sekundärantikörper verdünnt um den Faktor 10.000 in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C für 5-6 h.
7. Waschen Sie die Membran wieder wie in Schritt 2.5 beschrieben.
8. Erkennen den FLAG-Ausdruck mit westlichen verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Substrat und Bild die Membran mit einem Gel-Dokumentations-System (siehe Tabelle der Materialien). Identifizieren Sie die Klone DR3 als positive Klone auszudrücken.
9. Übertragen Sie die Klone in Platte A, die positive Klone in Platte B zu einem 6-Well-Platte entsprechen und weiterhin die Zellen bis in 10 cm Gerichte wachsen zu verstärken. Gefrorenen Vorräte an die Zellen wachsen aus positive Klone zu machen und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.

3. Bewertung der apoptotische Reaktion der Zellen auf Antimitotic Agents

Hinweis: Diazonamide ist eine neue Klasse von marine Naturprodukt, das hat bemerkenswerte Ereignisse in hemmen Wachstum von Krebszellen, die anderen Tubulin destabilisieren Agenten²¹widerspiegelt. Seine Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Um die zelluläre Reaktion der Zellen auf antimitotic Agents zu testen, wurden Paclitaxel und Diazonamide zur Behandlung von Wildtyp HT29 und HT29-DR3 Zellen. Die Medikamente wurden in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 10 mM Bestände machen gelöst und dann weiter zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM und 10.000 nM in DMSO.

1. Sammeln Sie HT29 und HT29-DR3 Zellen durch Trypsinization. Messen Sie die Zelldichte über eine automatische Zelle Zähler. Dann Samen Sie Zellen in 12-Well-Platten in DMEM bei einer Dichte von 3 x 10⁴ Zellen pro Bohrloch. Am nächsten Tag, fügen Sie 10 nM Diazonamide und verwenden Sie 1 % DMSO als Negativkontrolle zu. Nach 48 h Behandlung Bild der Zellen unter dem Mikroskop bei 10 X Vergrößerung (Abbildung 2).
2. Samen HT29 und HT29-DR3 Zellen in 96-Well-Platten in DMEM bei einer Dichte von 3 x 10³ Zellen pro Bohrloch und lassen sie Sie über Nacht bei 37 ° c wachsen Fügen Sie Dosis-Eskalation Diazonamide Konzentrationen von 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM und 100 nM in jede Vertiefung, mit 1 % DMSO als Negativkontrolle.
3. Messen Sie nach 48 h der Behandlung die Zellviabilität mit einem Lumineszenz-basierte Zelle Lebensfähigkeit Assay Kit laut Handbuch des Herstellers.
   1. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und bei RT für ca. 30 min. stehen lassen. Fügen Sie dann 50 µL Assays Reagenzien in jede Vertiefung schütteln die Platte bei RT für 2 min zur lyse der Zellen und inkubieren Sie die Platte bei RT für eine weitere 10 min. bestimmen die Lumineszenz von jedem Bohrloch mit einer Mikrotestplatte Reader (Abbildung 3).
      Hinweis: Die Zellviabilität stellt die relative Lumineszenzintensität jedes gut zu gut behandelt, die das Steuerelement mit 1 % DMSO.
4. Verwenden Sie sechs Wochen alten weibliche BALB/c nackte Mäusen für eine in Vivo Studie¹⁴.
   Hinweis: Die Mäuse konnten unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen gehalten werden.
   1. Trypsinize HT29 und HT29-DR3 Zelle, und halten Sie dann die Trypsinization mit DMEM bei 37 ° c vorgewärmt Sammeln die Zellsuspension in ein 50 mL-Tube und Zentrifugieren der Zellen bei 1.000 u/min für 10 min bei RT. verwerfen der Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in DMEM Medium ohne FBS. Die Zellen wieder Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit PBS-Puffer.
   2. Zählen der Zellen unter Verwendung eines automatischen Zelle Zählers und verdünnen die Zellen zu einer Konzentration von 2,5 x 10⁷ Zellen/mL mit PBS. Generieren Sie Tumoren durch eine subkutane Injektion von 200 μl Zellsuspension HT29 oder HT29-DR3 in die Rechte Flanke der jede Maus (5 x 10⁶ Zellen/Maus)²².
   3. Das Tumorvolumen (TV) mit Bremssättel jeden 2 d nach der Transplantation zu messen. TV Gerät mit folgender Formel berechnen: TV = 1 / 2L x b x B (hier, W: Tumor Breite, L: Tumor Länge). Wenn das durchschnittliche Tumorvolumen ca. 100 mm³erreicht, zufällig die Mäuse in der Steuerung oder in der behandelten Gruppe (n = 6 pro Gruppe) und die Behandlung einleiten.
   4. Paclitaxel Lösung wie folgt zubereiten. Erstens lösen Sie Paclitaxel in Ethanol bei 5 % des Gesamtvolumens komplett auf, und fügen Sie 5 % von der letzte Band der Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl. Schließlich machen die restlichen 90 % des Volumens mit D5W (5 % Dextrose in Wasser, pH-Wert 7,4).
   5. Injizieren der Paclitaxel intravenös in einer Dosierung von 20 mg/kg 3 X pro Woche für zwei Wochen. Messen Sie das Volumen und Körper Tumorgewicht 3 x eine Woche¹⁴. Beenden Sie das Experiment zu und einschläfern Sie die Tiere, wenn das Körpergewicht verringert sich um 20 % oder das Tumorvolumen etwa 2.000 mm^{3 erreicht}.

Ergebnisse

Eine Charakterisierung der HT29-Zellen stabil auszudrücken DR3 ist in Abbildung 1dargestellt. Die Klone express unterschiedlicher DR3, während die Wildtyp Zellen, die als Negativkontrolle dienen, exogene Genexpression nicht angezeigt werden. Hier zeigen wir nur fünf Klone, darunter Klonen 1 und 5 express DR3 auf höchste Niveau. Wir entschieden uns für Klon 1 und 5 für die folgenden Experimente.

Die ...

Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode um HT29-DR3 stabilen Zelllinien zu generieren. HT29-DR3 Zellen stellen ein Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die DR3, Apoptose induziert durch antimitotic Agents beiträgt. Dieser Ansatz ist vielseitig und wiederholbar. Um den Erfolg des Verfahrens zu gewährleisten, müssen vier Schritte des Protokolls berücksichtigt werden. Zuerst, um einen hohen produzieren genug Virustiter empfiehlt es sich, DNA-Transfektion durchführen, wenn die Plat-A-Zellen am Z...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	Ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicilin/Streptomycin
Lumineszierender Zellviabilitätsassay	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimethylsulfoxid	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Trypsin-EDTA (0,25%)	Invitrogen	25200056
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromid	Santa Cruz	sc-134220
; Transfektionsreagenz	Promega	E2311
Anti-Maus-Sekundärantikörper	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
Anti-Flag-Antikörper	Sigma	F-3165
HT29 Zelllinie	ATCC	HTB-38
plat-A Zelllinie	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
Klonierungszylinder	Sigma	C1059
Multimode-Reader für die Zellbildgebung	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 Inverses Mikroskop	Olympus	CKX53
12-Well-Zellkulturplatten	Nest	712001
60-mm-Zellkulturplatten	Nest	705001
15-ml-Zentrifugenröhrchen	Nest
0,22 μm m Sterilfilter	Millipore	SLGP033RB
Zentrifuge 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 Well Weiße Polystyrol Mikrotiterplatte	Corning	3903
Western ECL Substrat	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Gesundheitswesen	ImageQuant LAS 4000
Entfärbender Schüttler	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
Automatisierter Zellzähler	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium	Thermo	Fisher 31985070

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