Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.
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Methodenartikel
Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gen Störung Studien sind weitgehend benutzt worden, um die Rolle einzelner Gene in AML-Pathogenese zu untersuchen. Für das komplette gen Störung erreichen, haben viele dieser Studien gemacht komplexe gen Knockout Modelle verwenden. Während dieser Studien mit Knockout-Mäusen eine elegante und bewährte System zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehung bieten, eine schnelle und skalierbare Methode zur Bewertung von Kandidatengenen, die spielen eine Rolle bei der AML Zellproliferation oder Überleben in AML Modelle hilft die parallele Abfrage des mehrere Kandidaten-Gene zu beschleunigen. Jüngste Fortschritte in der Genom-Bearbeitung Technologien haben unsere Leistungsfähigkeit genetische Störungen in nie gekanntem Ausmaß dramatisch verbessert. Ein solches System der Genom-Bearbeitung ist die CRISPR-Cas9-basierte Methode, die rasche und wirksame Änderungen im Genom Ziel-Zelle verwendet werden kann. Die Einfachheit und Skalierbarkeit der CRISPR/Cas9-vermittelte gen-Löschung macht es eine der attraktivsten Techniken für die Befragung einer Vielzahl von Genen in phänotypische Tests. Hier stellen wir einen einfache Assay mit CRISPR/Cas9 vermittelte gen-Störung kombiniert mit Hochdurchsatz-Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assays, um die Rolle der Gene, die eine wichtige Rolle bei der Verbreitung spielen kann oder das Überleben der Menschen zu untersuchen und murine AML-Zell-Linien.
Einleitung
Die letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forschungsanstrengungen konzentriert sich auf die Ermittlung des Beitrags der wichtigsten molekularen Signalwege in der Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) gesehen. Traditionell wurde gen-Störung in AML Zellen mit bedingter Knockout-Mäusen oder kurze Haarnadel RNA (ShRNA) durchgeführt. Knockout-Mäusen bieten ein ausgeklügeltes System für die räumlich-zeitliche Steuerung von gen-Löschung, ist Generierung von gen-Knockout-Mäusen arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer. Darüber hinaus gen-Knockouts mit Rekombination Strategien ist nicht leicht skalierbar; Diese Strategien eignen nicht sich gut für die Befragung mehr....
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Protokoll
1. Erzeugung von AML Linie Zellklonen mit hohe Expression von stabilen und aktive Cas9
- Produktion von Cas9 lentivirus
- Tag 0: Platte 4 x 106 293T Zellen in 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin und L-Glutamin in einer 10 cm Gewebe Kulturschale in einem Biosafety Level 2 (BSL2) zertifiziert Zelle Kultur Haube. Legen Sie die Schale in einem Inkubator 37 ° C.
- Tag 1: Die vergoldeten 293T Zellen sollte 70 – 80 % Zusammenfluss am 1. Tag. Führen Sie die Transfektion mit das folgende Protokoll am Nachmittag.
- Erwärmen Sie die Transfektion Medium, Kultur, Medien und Transfection Reagens....
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Ergebnisse
In unserer Studie ausgestrahlt wir zuerst die MOLM13 menschlichen AML-Zelllinie, die die MLL-AF9 Translokation mit hoher Titer Virus Codierung der Cas9-Blasticidin Lentivirale Plasmids trägt. In unseren Händen beschriebenen Schüttgut unsortierte MOLM13-Cas9-Zellen wurden hohe Niveau Cas9 Ausdruck durch westliche Beflecken nicht angezeigt und auch nicht ausführen wenn für effiziente gen bearbeiten-mit der Methode untersucht zuvor7. Daher gingen wir zu einzelnen Zell.......
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Diskussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines CRISPR-Cas9-basierte Konkurrenzfähigkeit Assays untersucht die Rolle von Kandidatengenen in AML Zelllinien mit Flow-Zytometrie in Human/Murine AML Zellen (Abbildung 5). Das Ziel des Tests ist die Wirkung des Gens Löschung auf Wartung der AML Zellproliferation über zwei bis drei Wochen im Maßstab des Medium-Durchsatz zu identifizieren. Einige wichtige Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, um zu er.......
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Offenlegungen
A.J.D ist ein Berater, A2A Pharma (New Jersey) und Salgomed Therapeutics (San Diego). Andere Autoren haben keine Konflikte zu erklären.
Danksagungen
Das pCW-Cas9-Plasmid war ein Geschenk von Eric Lander & David Sabatini (Addgene Plasmid # 50661) und die pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Plasmid aus dem Labor Yusa (Addgene Plasmid #67974. Wir möchten die Durchflusszytometrie Kern bei SBP Medical Discovery Institute für rechtzeitige Hilfe mit Flow-Analyse und Sortierung zu danken. Wir würden gerne die Unterstützung der Lady Tata Memorial Foundation n. anerkennen Wir möchten auch die Unterstützung der folgenden Finanzierungsquellen anerkennen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsert Grant, der V-Stiftung und der San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| FLAG-M2 Antikörper | sigma-aldrich | F3165, los # SLBS3530V | |
| Anti-Maus Antikörper | Invitrogen | 31446, los # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT Zentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Rot | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| fötales Rinderserum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| Einzel-gRNA-Vektor | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear Extraktionskit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronektin | Takara | T100B | |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA-Ligationspuffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA-Ligase-Enzym | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher wissenschaftlich | BP1760-25 | |
| LB Agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Bouillon | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen Mini-Vorbereitungskit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spektralphotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Rekombinante Maus IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Rekombinante Maus IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Rekombinante Maus M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stabile kompetente Zellen | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Gewebekulturschalen | Fisher Scientific | 353003 | |
| Zelllyselösung | Qiagen | 158906 | |
| Proteinfällungslösung | Qiagen | 158910 | |
| DNA-Hydratationslösung | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| 50 mL konische Röhrchen | aus PolypropylenFisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL konische Röhrchen aus Polypropylen | Fisher scientific | 1495970C |
Referenzen
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
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Nachdrucke und Genehmigungen
