Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.

Zusammenfassung

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung des Mittel-groß dimensionierte Arterien, die ältere Erwachsenen betrifft. GCA Manifeste mit Arthritis und okklusive Symptome von Kopfschmerzen, Schlaganfall oder vision Verlust. Makrophagen und T-Helfer-Lymphozyten die Gefäßwand zu infiltrieren und eine Pro-inflammatorische Reaktion, die zu Schiff Schaden und Ischämie führen zu produzieren. Bisher gibt es keine GCA-Biomarker, die Krankheit Aktivität und Guide therapeutische Reaktion überwachen können.

Folat-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein Glycosylphosphatidylinositole Protein, das auf Zellmembranen verankert ist und normalerweise ausgedrückt in der Myelomonocytic Linie und in der Mehrzahl der myeloischen Leukämie-Zellen sowie in Tumor und rheumatoide synovialen Makrophagen, wo seinen Ausdruck mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Die Fähigkeit der FRB, Folat Verbindungen, Folsäure-Konjugate und Strukturähnliche Medikamente binden hat es ein druggable Ziel in Krebs und entzündliche Erkrankung Forschung gemacht. Dieser Bericht beschreibt die histologischen und immunhistochemische Methoden verwendet, um Ausdruck und Verteilung der FRB in Bezug auf GCAimmunopathology zu bewerten.

Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Schläfenarterie Biopsien von GCA und normalen Kontrollen waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin prüfen Gewebe Histologie und pathognomonische Funktionen ermitteln. Immunohistochemistry diente, FRB, CD68 und CD3 Ausdruck zu erkennen. Eine mikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der positiv gefärbten Zellen auf 10 ausgewählten high-power-Bereich Sektionen und ihre jeweiligen Standorte in der Arterienwand zu quantifizieren.

Lymphohistiocytic (LH) Entzündung begleitet von Intima-Hyperplasie und gestörten elastischen Lamina galt in GCA mit keine Kontrollen gefunden. Das LH Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen. FRB Ausdruck beschränkte sich auf Makrophagen, bestehend aus 31 % der CD68 + Makrophagen Gesamtbevölkerung und in der Media und Adventitia lokalisiert. Keine FRB wurde in Steuerelementen gesehen.

Dieses Protokoll zeigt ein eindeutiges numerisches und räumliche Muster der FRB Makrophagen im Verhältnis zu der vaskulären immun Mikroumgebung in GCA.

Einleitung

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine entzündliche Erkrankung des mittleren bis großen Arterien, targeting der Aorta und seine Niederlassungen und ältere Erwachsene betroffen. Es stellt mit leichten bis schweren ischämischen Komplikationen wie Kopfschmerzen, Kieferschmerzen, Verlust der Sehkraft, Schlaganfall und Gewebe Gangrän. Die Diagnose wird durch hohe Entzündungsmarker wie Erythrozyten Sedimentation Rate (ESR) und ein eindeutiges histologischen Muster auf der Schläfenarterie Biopsie (TAB)¹bestätigt. GCA ist die häufigste Vaskulitis Erwachsenen, und die Zugänglichkeit der Schläfenarterie erhalten für die Diagnose stellt einen Vorteil gegenüber anderen Vasculopathies, so dass man seine Pathogenese leichter zu studieren. Die typische Ergebnisse auf Registerkarte "beinhalten ein Infiltrat von Makrophagen/Histiozyten und T-Lymphozyten über alle vaskulären Schichten der Tunica Intima, Media und Adventitia mit gleichzeitiger Zerstörung der elastischen Lamina, die normalerweise diese trennt gefunden Fächer². Die aktuelle Beweise zeigt, dass GCA ein unbekanntes Antigen beinhaltet, die dendritische Zellen in der vaskulären Adventitia aktiviert, gefolgt von der Einstellung des Helfers T (Th) Zellen, insbesondere Th1 und Th17-Subtypen, die absondern Interleukin-17 und Interferon-Gamma (IFG) beziehungsweise. IFG dann rekrutiert und aktiviert Makrophagen produzieren Zytokine und Proteasen. Dazu gehören Pro-inflammatorischen Zytokinen; einschließlich der IL-12, die wechselseitig Th1 Zellen, wodurch eine positive Rückkopplung aktiviert; Tumor-Nekrose-Faktor und Interleukin-6, die Arthritis und Fieber und Metalloproteasen, die verursachen Schäden der elastischen Lamina. Glukokortikoide (GC), die die Standardtherapie der chronischen darstellen, Steuern die Cytokine Bahnen teilweise mildernde Th17/IL-17, aber nicht die Th1/IFG Arm der Immunantwort^3,4. Leider führt Absetzen des GC Rückfall der Erkrankung. Als alternative Modalität Methotrexat hat für GCA Behandlung umgewidmet worden, aber die gewünschte klinische Endpunkte wurden nicht konsequent erreicht, obwohl empfindlicher Biomarker für therapeutischen Überwachung^{5,6 nicht verwendet worden sein} . Im Jahr 2017 wurde die Interleukin 6-Blocker, Tocilizumab, für die Behandlung von GCA genehmigt, wie effektiv Krankheitskontrolle und schonende Wirkung^7,8Steroid nachgewiesen.

Bisher gibt es keine guten Biomarker für GCA. Infolgedessen ist es schwierig, zur Überwachung der Krankheitsaktivität und titrieren Dosen von verfügbaren Medikamenten, um negative Auswirkungen zu vermeiden und reduzieren die Belastung der Kosten für die Gesellschaft. Daher ist es unerlässlich, ein Kandidat Biomarker, dass korreliert mit Krankheitsaktivität, bieten neue Einblicke über die Pathogenese und Hilfe bei therapeutischen Entscheidungen suchen.

Die Dysregulation der Makrophagen Aktivierung ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese der GCA. So kann ein wirksames Mittel zur Behandlung von GCA sein die gezielte Ausrichtung der aktivierten Makrophagen. Die Folsäure-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein a1-Phosphatidylinositol-Glykoprotein, das auf der Zellmembran verankert ist in normalen Myelomonocytic Zellen, myeloische Leukämie-Zellen exprimiert und aktiviert Makrophagen. Die Liganden, Folsäure, ist ein wichtiges Vitamin in seiner reduzierten Form, der zelluläre DNA-Synthese, Methylierung und Reparatur⁹ermöglicht. FRB-Ausdruck wird in Autoimmunerkrankung und während der Karzinogenese induziert. Ihr Ausdruck ist auf der Oberfläche von Monozyten oder Pro-inflammatorischen M1 Makrophagen bei rheumatoider Arthritis oder auf entzündungshemmende M2-Makrophagen beschränkt in festen Orgel und myeloischen malignen Erkrankungen^{10,11,12 , 13}. neben ihrer möglichen Rolle als Biomarker der aktivierten Makrophagen, FRB können selektive Drug Transport durch einen mehrstufigen Prozess, der mit die Rezeptorbindung, Folsäure, Antifolates oder Folat konjugiert Drogen an der Zelle beginnt Oberfläche, gefolgt von Verinnerlichung, Freigabe und eventuelle Lieferung des gewünschten Medikaments an die interne Zelle Maschinen^12,14,15,16. Im Gegensatz zu FRB in Krebszellen exprimiert und aktiviert Makrophagen, FRB in normalen blutbildenden Zellen exprimiert ist nicht in der Lage zu binden Folate damit FRB/Folat-vermittelten Drug-Delivery FRB-positiven entzündlichen oder Krebszellen beschränkt.

In unserem vorangegangenen Studie zeigten wir zum ersten Mal, das FRB in GCA Makrophagen zum Ausdruck bringt und seinen Ausdruck korreliert mit CD68 + und Endothelin Rezeptor Beta-Makrophagen, die GCA Pathogenese¹⁷beitragen. In diesem Bericht beschreiben wir die histopathologische und immunhistochemische Methoden zur Beurteilung der FRB Makrophagen und analysiert den gesamten Lymphozyten und Makrophagen zählt, um Einblick in die FRB Position in der GCA vaskulären Landschaft.

Protokoll

Alle beschriebene Methoden wurden von der Penn State Institutional Review Board genehmigt.

(1) histopathologische Vorbereitung und Verarbeitung nach Erhalt Schläfenarterie Biopsie

Hinweis: Die Schläfenarterie Biopsie (TAB) wird durch einen qualifizierten Chirurgen unter örtlicher Betäubung und sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach chirurgisch Erhalt einen 3 cm arteriellen Abschnitt auf der mehr betroffenen Seite, die Probe ist in Formalin sofort für 24 h behoben, in 3 bis 4 mm Abschnitte unterteilt und eingebettet in Paraffin, sorgfältige Aufmerksamkeit auf die korrekte Ausrichtung des Gewebes im Block, ist dann bei Raumtemperatur gelagert. Probe-Auswahl erfolgt nach Überprüfung der medizinischen Aufzeichnungen. Die Diagnose basiert auf der American College of Rheumatology 1990 Kriterien, wonach Themen 3 5 Domains erfüllen: Alter > 50 Jahre, neue Kopfschmerzen, Schläfenarterie Zärtlichkeit, einer Erythrozyten Sedimentation Rate > 50 mm/Stunde von Westergren-Methode und eine abnorme Registerkarte. Aus Sicherheitsgründen müssen Schutzhandschuhe getragen werden zu allen Zeiten bei der Handhabung der Proben, Chemikalien und Antikörper.

1. Geschnitten Sie von den eingebetteten Blöcken 4-5 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom. und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Verwenden Sie ein Steuerteil des ausgewählten Normalgewebe zur Qualitätssicherung.
2. Schwimmer schneiden Abschnitte über einem warmen Wasserbad erwärmt bis 40 ° C zu Falten entfernen und mit einem beschichteten Objektträger mikroskopische abholen.  Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.
3. Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.
4. Montieren Sie 3 Abschnitte auf Objektträger.
5. Legen Sie Folien in eine vertikale Rack und über Nacht bei 37 ° C für 24 h trocknen.
6. Platzieren Sie Folien in einem Behälter und Speicher bei 4 ° C.

2. die immunhistochemische Vorbereitung, entwachsen, Antigen-Retrieval und Färbung^15,18,19,20

1. Laden Sie Folien Folie einbauen. Führen Sie das Gestell durch Gerichte wie folgt: zweimal in 100 % Xylol für 5 Minuten mit 10 Sekunden sanft Agitation alle 30 Sekunden einmal in 100 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 90 % Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 70 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren , und zweimal in doppelt destilliertem H2O unter 10 Sekunden rühren.
   Hinweis: Umgang mit Xylol und Aceton sollte in belüfteten Hauben, Inhalation und Atemwege Toxizität zu vermeiden erfolgen.
2. Abrufen des Antigens durch die Übertragung der Rack in einem Glasbehälter mit 200 mL 10 Mmol/L, pH 6.0 Citrat-Puffer auf 95 ° c vorgewärmt Stellen Sie den Timer für 30 Minuten im Wasserbad, dann für 20 Minuten dann spülen unter fließendem Wasser für 5 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen.
3. Entfernen Sie endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation in 200 mL Wasserstoffperoxid 3 % für 10 Minuten. Waschen Sie Objektträger in 200 µL Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBSS) 3 Mal.
4. Entfernen Sie die Folien aus dem Rack und tupfen Sie jeweils vorsichtig, um überschüssigen Puffer zu wischen. Zum Beizen, fügen Sie 200 µL der folgenden primären Antikörper, Deckel rutscht auf Folien hinzufügen und 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren hinzu:
   Anti-FRB Antikörper verdünnt 1:800
   Monoklonaler Maus Anti-Human CD68, Verdünnung 1: 200
   Polyklonale Kaninchen Anti-CD3 1: 100 Verdünnung
   Hinweis: Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Teile der Plazenta waren auch verarbeitet wie in Schritte 2.1 bis 2.9 und inkubierten mit Anti-FRB18 beschrieben und als Positivkontrolle verwendet. Färbung Ergebnisse wurden von der Suche nach der optimalen Antikörperkonzentration erhalten und wurde von titrieren des Antikörpers in doppelter Verdünnungen (z.B. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) durchgeführt.
5. Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBSS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.
6. Fügen Sie 200 µL Sekundärantikörper Lösung mit biotinylierte Rabbit/Maus Sekundärantikörper mit unconjugated primären Antikörper gebunden, Gewebe-Antigen reagieren. Deckgläsern auf Folien und 45 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.
7. Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.
8. Fügen Sie 200 µL des Diaminobenzidine (DAB) + Substratpuffer (Imidazol HCl)-Chromogen System und inkubieren Sie für 10 Minuten Färbung Muster zu visualisieren. Waschen Sie mit TBSS dann in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.
9. Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 3 Minuten.
10. Montieren Sie die Folien, indem 70 µL Eindeckmedium auf der Oberfläche der Folie. Langsam kippen Sie das Deckglas auf den Eindeckmittel und vermeiden Sie Luftblasen, wie Sie es einrastet unten. Warten Sie 24 Stunden trocknen lassen.

(3) histologischen und immunhistochemische (IHC) Analyse

Untersuchen Sie die H & E und IHC Abschnitte von GCA positive und normalen Probanden mit einem Lichtmikroskop gefärbt.

1. Für die H & E gefärbt Abschnitte:
   1. Beurteilen Sie die Gefäßarchitektur und identifizieren Sie Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und Fibroblasten und Vasa Vasorum in Tunica Adventitia^21,22zu.
   2. GCA Funktionen, darunter Lymphozyten und Makrophagen/Histiocyte Infiltration, zelluläre Hyperplasie und internen elastischen Lamina Abbau zu identifizieren.
   3. Analysieren Sie das Lymphohistiocytic Infiltrat durch Identifizierung und Quantifizierung der Anzahl von Makrophagen im Verhältnis zu den Lymphozyten. Das Ausmaß der Störung der internen elastischen Lamina und hyperplastische Veränderungen in ihren Wohnsitz Zellen zu beurteilen und zu vergleichen mit Steuerelementen.
2. Für die IHC gebeizt Abschnitte:
   1. Untersuchen Sie die Färbung Muster der FRB, nehmend von seinen Ausdruck durch eine bestimmte Art oder Arten von Zellen und deren Verteilung innerhalb der vaskulären Schichten und ihre Beziehung auf das gesamte Immunsystem Infiltrat, total Makrophagen Marker, Anti-CD68 und die Pfanne Lymphozyten Marker anti-CD3.
   2. Quantifizieren des Ausdrucks der FRB, CD68 und CD3 Zellen durch zählen der positiv gefärbten Zellen auf 10 mehrere zufällig ausgewählte Hochleistungs-Felder (hpf) und notieren Sie die Mittel.
      Hinweis: Identifizierung von diesen normalen und pathologischen Zellen und Strukturen wurden von einem zertifizierten Herz-Kreislauf-Pathologen (j.m.) durchgeführt und Rheumatologen (S.A.A) und die Ergebnisse für alle Fälle aufgezeichnet wurden.
   3. Aufnehmen Sie repräsentative Bilder mit einer Digitalkamera.
      Hinweis: Nach diesen Schritten kann verbleibende Aliquote bei-80 ° c gelagert werden

Ergebnisse

Histologischen Befunde

Der H & E Flecken in normalen Proben nachgewiesen normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und eine heterogene Kollagen-Matrix die Fibroblasten und Feeder Schiffe gehören genannt Vasa vasorum in Tunica Adventitia. Es gibt keine entzündlichen Infiltrat identifiziert. GCA positive zeitliche Arterien zeigte mäßige bis sc...

Diskussion

GCA ist die häufigste Vaskulitis bei Erwachsenen, und pathologische Wahrzeichen steht beispielhaft für eine wirkungsvolle Kombination von T-Helfer-Lymphozyten und aktiviert Makrophagen, die auch in andere granulomatöse Erkrankungen oder Vasculopathies wie Sarkoidose gefunden werden können und granulomatöse Polyangiitis^2,3. In GCA, die Schläfenarterie bietet eine gute Darstellung einer Mittel-groß dimensionierte Arterie und die TA-Biopsie gibt eine große Probe, di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikrotom	Reichert-Jung
einfache und mattierte Objektträger und Deckgläser	Fisher Scientific
Vertikales Gestell	Fisher Scientific
Lichtmikroskop	Olympus BX60  Mikroskop
Xylol-Aceton
in destilliertem Wasser			Konzentrationen 100%, 90%, 70%
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)	Dako Wash BufferS3006
3% Wasserstoffperoxid in TBS
Diaminobenzidin (DAB)	Sigma Fast Tablettenset Chemisches
Permount Eindeckmedium	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III Hämatoxylin	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% alkoholische Stammlösung	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM Zitronensäure-Monohydrat (pH 6,0)
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Folat-Rezeptor beta	Manohar Ratnam		optimiert bei 1:800
Monoklonale Maus Anti-Human-CD68	Dako	M071801	optimiert bei 1:200
Polyklonales Kaninchen Anti-CD3	Agilent Dako	A0452	optimiert bei 1:100
Polymer Ziege Anti-Kaninchen/Maus Sekundärantikörper	Dako
Plazentagewebe			für FRB-Positivkontrolle