Methodenartikel

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

DOI:

10.3791/58735

⸱

7. Januar 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantifizierung der Proteine des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben ist wichtig in der klinischen und Forschung Anwendungen. Eine optimale Methode zur Quantifizierung stimmt, hat einen breiten linearen Dynamikbereich und unterhält die strukturelle Integrität der Probe zur Identifizierung der einzelnen Zelltypen zu ermöglichen. Aktuelle Methoden wie Immunhistochemie (IHC), Massenspektrometrie und Immunoblotting jeweils nicht erfüllen diese Bestimmungen aufgrund ihrer kategorischen oder brauchen, um die Probe zu homogenisieren. Als eine alternative Methode schlagen wir die Verwendung von Immunfluoreszenz (IF) und Bildanalyse, die relative Häufigkeit eines Proteins des Interesses an FFPE Gewebe zu bestimmen. Hier zeigen wir, dass diese Methode ist leicht optimiert, einen breiten dynamischen Bereich liefert und im Vergleich zu der Goldstandard der quantitativen Immunoblotting linear quantifizierbar ist. Darüber hinaus ist diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Probe und ermöglicht die Unterscheidung der verschiedenen Zelltypen, die im diagnostischen Anwendungen entscheidend sein können. Insgesamt, dies ist eine robuste Methode für die relative Quantifizierung von Proteinen in FFPE-Proben und kann leicht an klinischen passen oder Forschung muss angepasst werden.

Einleitung

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Die Notwendigkeit zur Quantifizierung von Proteinen in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsie Gewebeproben existiert in vielen klinischen Bereichen. Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben wird beispielsweise zur aufzuklären Prognose und Behandlung für Krebs Patienten1zu informieren. Jedoch aktuelle Methoden sind in der Regel subjektiv und Validierung fehlt.

Immunhistochemie (IHC) dient routinemäßig in der Pathologie-Laboratorien und hängt im Allgemeinen von einer primären Antikörper gegen das Zielprotein und ein mit einem enzymatischen Label wie Meerrettich Peroxidase2konjugierten Sekundärantikörper. Konventionelle IHC ist empfindlich, kann Gebrauch von Minute Proben und bewahrt die morphologische Integrität von Gewebeproben, die dadurch bei schönem Bewertung der Proteinexpression in seinem entsprechenden histologischen Kontext. Jedoch weil das chromogene vom IHC erzeugte Signal subtraktiven ist, leidet unter einem relativ engen Dynamikbereich und bietet begrenzten Potential für multiplexing2,3,4. Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI-MSI) bleibt morphologischen Integrität. Allerdings diese entwickelnden Technologie ist verbunden mit einer bescheidenen morphologische Auflösung und erfordert erhebliche Kalibrierung und Normalisierung, beeinträchtigen seine Machbarkeit für klinische Routineanwendung5,6,7. Alternative Verfahren zur Quantifizierung von Protein in Gewebeproben gehören Immunoblotting8, Massenspektrometrie9,10,11und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)12, jedes Das beginnt mit einer homogenisierten Probe Gewebe lysate. Primäre Gewebeproben sind heterogen, weil sie eine Vielzahl von Zelltypen enthalten. Daher erlauben Techniken, die zur Folge haben, Homogenisieren der Proben keine Quantifizierung eines Proteins in einer bestimmten Zelle Bevölkerung von Interesse, wie Krebszellen.

Wie IHC, wenn gilt für kleine FFPE Proben und ermöglicht die Beibehaltung der histologischen Integrität13. Aber dank dem Additiven Charakter der Fluoreszenz Signale, wenn für die Anwendung von mehreren primären Antikörper und Fluoreszenzmarkierungen zugänglich ist. So kann ein Protein des Interesses relativ innerhalb bestimmter Zellen oder zellulären Kompartimenten (z. B. Zellkern und Zytoplasma) mit anderen Antikörpern definiert quantifiziert werden. Fluoreszenz-Signale haben auch den Vorteil eines größeren Dynamikbereich13,14. Die Überlegenheit, Reproduzierbarkeit und multiplexing Potential wurde wenn auf FFPE-Proben angewendet demonstriert13,14,15.

Hier beschreiben wir die Verwendung von quantitativen Immunoblotting mit etablierten Zelllinien als Goldstandard quantitative Artder festzustellen, ob in Verbindung mit computergestützten Bildanalyse bei der Bestimmung der relativen Fülle eines Proteins des Interesses an histologischen Abschnitte aus FFPE Gewebeproben. Wir haben diese Methode erfolgreich in einem Multiplex-Ansatz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in klinischen Biopsie Proben16,17,18angewandt.

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Protokoll

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Zulassung mit primären menschlichen Gewebeproben aus der Gesundheitswissenschaften und angegliedert Lehrkrankenhäuser Research Ethics Board (HSREB) an der Queens University ermittelt.

1. Aufbau einer Zelllinie Tissue Microarray (TMA)

  1. Ernten Sie und waschen Sie Zellen.
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde auf verschiedenen etablierten verewigt Zell-Linien (z. B. HeLa, Jurkat, RCH-ACV) getestet.
    1. Ernten Sie für adhärente Zellen ca. 1,3 x 107 Zellen sobald sie ca. 80 % Konfluenz erreicht. Lösen Sie Zellen mit einer Reagenz für die Zell-Linie geeignet.
      Hinweis: Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) ist zur Verringerung des Risikos von Oberflächenproteinen entwürdigend Trypsin im Allgemeinen vorzuziehen. Wenn Trypsin, neutralisieren Sie die Trypsin mit fetalen bovine Serum (FBS) sofort nach der Ernte der Zellen.
    2. Ernten Sie für Aufhängung Zellen ca. 8 x 107 Zellen in Log-Phase des Wachstums.
    3. Sammeln Sie die Zellen geerntet/abgelöst durch Zentrifugieren für 5 min bei 225 X g in einem 50 mL konische Röhrchen.
    4. Abgießen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 10 mL 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Für 5 min bei 225 X g Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.
      Hinweis: 1 X PBS besteht aus 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO41,8 mM KH2PO4 in destilliertem Wasser; pH auf 7,4 einstellen.
  2. Beheben Sie die Zellen in Formalin und pellet-sie.
    1. Die Zelle Pellet in das konische Rohr in 10 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) aussetzen.
      Hinweis: NBF kann durch Verdünnen von 1 mL der Stammlösung 37 % Formaldehyd in 9 mL 1 X PBS hergestellt werden.
      Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Formalin und Formaldehyd. Verwenden Sie eine Abzugshaube für Schritten, Formalin und Formaldehyd.
    2. Inkubieren Sie die Zellen auf einer Wippe mit 24 u/min bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 17 h).
    3. Bereiten Sie eine 1 % ige Lösung des niedrigen Schmelzpunktes Agarose in PBS (0,01 g Agarose pro 1 mL PBS).
      1. Genug für 500 µL Agarose-Lösung pro Linie Zellprobe vorzubereiten.
      2. Die Agarose in einem 80 ° C Wasser Bad oder Hitze-Block, mit gelegentlichen mischen für 2-5 min zu lösen. Wenn aufgelöst, halten Sie die Lösung in einem 37 ° C Wasser Baden oder Hitze Block um Härten zu vermeiden.
    4. Pellets die festen Zellen von 1.2.2 Schritt durch Zentrifugieren für 5 min bei 225 X g. entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL 1 X PBS.
    5. Übertragen Sie die Zellen in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Pellet durch Zentrifugieren für 5 min bei 290 X g. Aspirat alle des Überstands.
  3. Gegossen Sie Zellen in Agarose.
    1. Fügen Sie hinzu ~ 500 µL 1 % Agarose-Lösung (aus Schritt 1.2.3) für jedes Röhrchen enthält die Zellen. Sanft, aber schnell, pipette Mischung nach oben und unten mit einem P-1000 Mikropipette mischen.
      Hinweis: Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze vergrößern die Blende und vermeiden Luftblasen. Halten Sie die Arbeitslösung Agarose im 37 ° C Wasserbad um Härten zu vermeiden.
    2. Lassen Sie die Agarose-Zelle-Lösung (5-10 min) bei Raumtemperatur aushärten. Fügen Sie 1 mL 10 % NBF zu jeder Microcentrifuge Schlauch mit einer Probe und bei Zimmertemperatur aufbewahren, bis Paraffin einbetten (bis zu 24 h).
  4. Bereiten Sie die Agarose-Stecker für das Paraffin einbetten.
    1. Aus der NBF aus der Probe Aspirieren.
    2. Abziehen Sie die Zelle-Stecker mit einer Rasierklinge geschnitten Microcentrifuge Schlauch, stecken Sie den Netzstecker in Kunststoff Gewebe Kassette. Bewahren Sie Kassetten an 10 % NBF bei Raumtemperatur.
  5. Die Proben zu verarbeiten Übernachtung entweder manuell oder mit einem automatisierten Gewebe-Prozessor und Einbettung in Paraffin-Wachs mit standard Histologie Methoden.
    Hinweis: Siehe Fischer Et Al. 19 für ein Beispiel-Protokoll.
  6. Mit einem spezialisierten "Tissue Arrayer" Instrument, Ernte doppelte 0,6 mm Kerne aus Paraffin verhindert jede Zelllinie und einfügen, in Reihen, eine leere Empfänger Paraffinblock um eine Zelllinie TMA zu schaffen.
    Hinweis: Standard-Methoden sollte wie beschrieben in Fedor und De Marzo20verwendet werden.
  7. Integrieren Sie Kerne von Primärproben 2-3 zusätzliche Gewebetypen (z. B. Tonsillen, Doppelpunkt, Hoden, etc.) als positive oder negative Kontrollen in der TMA darstellt. Wählen Sie Gewebe, die für das Protein des Interesses geeignet sind.
  8. Verwenden Sie ein Mikrotom, zwei histologische Abschnitte, ca. 4 bis 6 µm dick, der Zelllinie TMA vorzubereiten. Montieren Sie den Abschnitt auf einer Folie Histologie, trocknen, und deparaffinize (wie Fedor und De Marzo20beschrieben).

2. Beispiel Färbung durch Immunfluoreszenz

  1. Die Verdünnung der Primärantikörper zu optimieren.
    Hinweis: Standard-Protokolle gibt es für die Optimierung des IHC oder, wenn für FFPE Gewebe Abschnitte wie in Kajimura Et al. 21. eine kurze Übersicht über die Vorgehensweise wird hier beschrieben.
    1. Bereiten Sie 4-5 Verdünnungen der primären Antikörper gegen das Protein des Interesses, geleitet von den Anweisungen des Herstellers.
    2. Identifizieren Sie einen Steuerelementtyp Gewebe von einer tierischen oder menschlichen Quelle, die das Protein des Interesses an morphologisch erkennbare Zellpopulationen ausdrückt. Bereiten Sie Abschnitte des Gewebes aus und klebe sie auf einer Folie nach standard Immunohistochemistry Verfahren wie z. B. in Fedor und De Marzo20.
      Hinweis: Die Anzahl der erforderlichen Abschnitte ist die Anzahl der primären Antikörper-Verdünnungen plus einen zusätzlichen.
    3. Mit einem automatisierten oder manuellen System für Immunhistologie, testen Sie die Primärantikörper Verdünnungen von 2.1.1 jeden Schritt auf einer Folie aus Schritt 2.1.2. Lassen Sie die Anwendung des primären Antikörper aus der zusätzlichen Folie Weg und verwenden Sie es als Negativkontrolle.
    4. Färben Sie bei der Färbung alle Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) als eine nukleare Gegenfärbung und Gewebekulturen tagged Sekundärantikörper. Wenn größere Sensibilität erforderlich ist, verwenden Sie eine HRP (Meerrettich-Peroxidase)-konjugierten Sekundärantikörper und Tyramide-basierte Signal Verstärkersystem (siehe Stack Et Al. ( 13).
      Hinweis: Beim primären Antikörper multiplexing, wird ein anderes fluoreszierendes Label für jedes Protein verwendet.
    5. Scannen Sie die Immunostained Folien mit einem geeigneten Instrument erzeugen eine digitale Bilddatei mit Erkennung und Erregung Wellenlängen angebracht, die Fluorophore, die verwendet wurden.
    6. Verwenden Sie entsprechenden Software, die digitalen Bilder anzeigen und empirisch wählen die Primärantikörper Verdünnung, die Signalintensität im Vergleich zu Hintergrundfluoreszenz optimiert.
      Hinweis: Falls gewünscht, kann diese Optimierung auftreten mit einer HRP-konjugierten Sekundärantikörper, 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) und Hellfeld Mikroskopieren.
  2. Führen Sie aus, wenn auf der Zell-Linie TMA Färbung.
    1. Verwenden Sie eine automatische oder manuelle System für Immunhistologie, eine Folie der Zelllinie TMA mit der optimierten Primärantikörper Verdünnung (wie in Schritt 2.1 bestimmt) zu beflecken. Lassen Sie die Anwendung des primären Antikörper aus der zweiten Folie Weg und verwenden Sie es als Negativkontrolle.
    2. Färben Sie bei der Färbung alle Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) als eine nukleare Gegenfärbung und eine sekundäre Antikörper und Tyramide wie in Schritt 2.1.4.
    3. Scannen Sie die Immunostained Folien mit einem geeigneten Instrument erzeugen eine digitale Bilddatei mit Erkennung und Erregung Wellenlängen angebracht, die Fluorophore, die verwendet wurden.
    4. Verwenden Sie eine Bild-Analyse-Software-Paket, um das zelluläre Fach von Interesse (z.B. Zytoplasma versus Zellkern) identifizieren und quantifizieren der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Zelllinie.
      Hinweis: Verschiedene Software-Pakete für diesen Zweck verwendet werden und viele werden diskutiert in Stapel Et al. 13.

3. quantitative Immunoblotting Zell-Linien

  1. Bereiten Sie Lysaten von Zellen.
    1. 2 Millionen Zellen für jede Zelllinie zu ernten, wie 1.1.1 bis 1.1.3 beschrieben.
    2. Spin-down Zellen für 5 min bei 650 X g in einem 50 mL konische Röhrchen. Den Überstand abgießen.
    3. Waschen Sie Zellen mit 10 mL eiskaltem PBS. In 1 mL eiskaltem PBS und Transfer zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln. Gemäß Schritt 3.1.2 Zentrifugieren, Dekantieren und Zellen auf dem Eis zu verlassen.
    4. Fügen Sie ca. 200 µL des kalten Tests (RIPA) Lysis Puffer mit Protease-Inhibitoren (10 µL 100 X Inhibitoren pro mL RIPA Lyse Puffer) an den Zellen, Wirbel und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
      Hinweis: Die Höhe der Lyse Puffer erforderlich für wirksame Lyse variiert je nach Zelllinie und empirisch ermittelt werden. RIPA Puffer besteht aus 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0 % NP-40, 0,5 % Natrium Deoxycholate, 0,1 % SDS in destilliertem Wasser.
    5. Dafür relativ gleichmäßige Belastung auf die Immunoblots quantifizieren Sie die gesamte-Protein in einer 20 µL Probe von jeder lysate mit einer geeigneten Methode wie der Bradford-Test. Der Rest (ca. 180 µL) jeder Zelle lysate ca. 40 µL 6 X Laemmli Lyse Puffer hinzu und bei 100 ° C in einem Hitze-Block oder Wasserbad für 5 min kochen.
      Hinweis: 6 X Laemmli, die Puffer besteht aus 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4 % (w/V) SDS, 60 % Glycerin, 0,6 % (w/V) Bromophenol blue, 50 mM Dithiothreitol (DTT) in destilliertem Wasser.
    6. Speichern Sie die Proben bei-20 ° C bis zu zwei Wochen.
  2. Führen Sie ein Immunoblot aller Zellen Linien um festzustellen welche Zelllinie hat die am häufigsten vorkommende Protein des Interesses.
    Hinweis: Folgen Sie den beschriebenen Mahmood, T. und Yang, PC. 22, mit den folgenden Änderungen.
    1. Aliquoten Zelle lysate (vorbereitet in Schritt 3.1) mit 10-50 µg Protein (abhängig von der Fülle des Proteins des Interesses) in Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 2,5 µL 6 X Laemmli-Puffer und ausreichend RIPA Lysis Buffer, das Volumen bis zu 15 µL zu machen.
    2. Laden Sie eine 5 % ige stapeln und eine geeignete Konzentration (z.B.10 % für Proteine zwischen 15-100 kDa) Lösung SDS-PAGE Gel mit einer Protein-Leiter und die Proben aus dem Schritt 3.2.1. Laden Sie 1 X Laemmli-Puffer in leeren Brunnen. Führen Sie die Stromversorgung bei entsprechenden Einstellungen in der Regel 125 V, 80 min lang oder bis der Bromophenol blauen Farbstoff der Unterseite der Platte erreicht.
    3. Führen Sie eine halbtrockene Protein Übertragung wie in Wiedemann Et Al. beschrieben 23.
      Hinweis: für die repräsentativen Ergebnisse, eine Nitrocellulose-Membran (die müssen nicht eingeweicht werden, Methanol), und kalte Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) Transfer Puffer dienten. BSN-Puffer besteht aus 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20 % Methanol in destilliertem Wasser.
    4. Verwenden Sie nach der Übertragung eine Rasierklinge, schneiden Sie die Membran horizontal um den Teil mit dem Protein des Interesses aus eine entsprechende interne Kontrolle Protein, wie z. B. GAPDH zu trennen.
    5. Gehen Sie zu blockieren und Antikörper Inkubationen mit den blockierenden Puffer der vom Hersteller empfohlenen der primären Antikörper.
      Hinweis: Optimale Primärantikörper Verdünnungen können dramatisch Protein Fülle und Empfindlichkeit abhängig. Für die repräsentativen Ergebnisse unten benötigt der Antikörper gegen das Protein des Interesses eine 1:1,000 Verdünnung, während das GAPDH-Steuerelement eine 1:40,000 Verdünnung erforderlich. Die Verdünnung der Sekundärantikörper verwendet wurde 1:3, 000.
    6. Legen Sie nach Antikörper Inkubationen und Waschen der Membran die Membran-Streifen in einer durchsichtigen Hülle wie ein Sandwich-Beutel.
    7. Bereiten Sie Enchanced Chemilumineszenz (ECL) Mischung nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine Pipette P-1000 decken die Membran mit der ECL-Mischung, in der Nähe der Scheide und die Membran-Streifen mit der Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1-2 min inkubieren.
    8. Legen Sie die Membran-Hülle in eine digitale imaging Plattform. Verwenden Sie Chemilumineszenz und farbmetrische Marker-Erkennung, um verschiedenen Belichtungen der Membran zu erfassen.
      Hinweis: Belichtungszeiten variieren basierend auf der Menge des Proteins geladen, Fülle von Zielprotein, Antikörper Affinität etc. beginnen mit einer Belichtungsautomatik (in der Regel wenige Sekunden) und Test Belichtungszeiten oberhalb und unterhalb von ein paar Sekunden-Schritten.
    9. Empirisch oder mit Bildanalyse-Software bestimmen welche Zelllinie das Zielprotein drückt.
  3. Finden Sie den linearen Dynamikbereich jeder primären Antikörper mit einem serielle Verdünnung.
    1. Führen Sie Schritte 3.2.1-3.2.8 mit einer Reihe von Verdünnungsreihen von der Zell-Linie, die die höchste Konzentration an das Zielprotein (identifiziert in Schritt 3.2.9) zum Ausdruck bringt.
    2. Verwenden Sie Bildanalyse-Software wie ImageJ Densitometrie auf die Exposition Bilder durchführen.
      1. Verwendung von ImageJ, z. B. das Rechteckige Auswahl -Werkzeug, wählen Sie die erste Spur des Gels zu quantifizieren. Gehen Sie zu analysieren | Gele | Wählen Sie die erste Spur. Verwenden Sie die Maus, um die resultierende Rechteck in die nächste Spur zu verschieben. Gehen Sie zu analysieren | Gele | Wählen Sie Next Lane. Immer wieder bewegen Sie das Rechteck in die nächste Spur und wählen Sie die Spur für den Rest der Fahrspuren.
      2. Gehen Sie zu analysieren | Gele | Plot-Bahnen. Verwenden Sie die Geraden Linien -Werkzeug zum Zeichnen von Linien über die Grundlagen der jede Spitze, Hintergrundgeräusche zu entfernen. Verwenden Sie das Zauberstab -Werkzeug, um jede Spitze auszuwählen, und sammeln Sie die Dichte der jede Spitze, im folgenden bezeichnet als Band Intensität, aus dem Ergebnisfenster .
    3. Verwenden Sie die Ausgabe in ein Streudiagramm von der Band Intensität gegen die Höhe der Gesamt-Protein für jedes Primärantikörper geladen erstellen Densitometrie. Mit einer Linie der beste Passform und Sichtprüfung, bestimmen Sie den Speicherort (Intensitätsbereich) der linearen Dynamikbereich von jeder Antikörper.
    4. Wählen Sie eine Proteinkonzentration, die einen Wert am oberen Ende des linearen Bereichs, der die Konzentration voran mit allen Zelllinien werden generiert.
      Hinweis: Da diese Konzentration unterhalb der Sättigung in der Zell-Linie mit der größten Menge dieses Proteins ist, sollte keine Gefahr über Belichtung die Bands für die Zell-Linien sein.
  4. Führen Sie ein Immunoblot mit Konzentration des Proteins in Schritt 3.3.4 für alle Zelllinien ausgewählt und wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.8.
    1. Durchführen Sie Densitometrie auf die digitale Scans wie in 3.3.2 Schritt. Wählen Sie die Aufnahmen Bilder, die Signale innerhalb der linearen Bereiche für jeden Antikörper identifiziert in Schritt 3.3.3 ergeben.
    2. Mit der Band Intensität Signale aus den idealen Engagements von 3.4.1, berechnen Sie das Verhältnis von Ziel Protein Band Intensität zu dem Laden von Kontrolle Band Intensität für jede Zelllinie. Diese Verhältniswerte zeigen die relative Häufigkeit des Zielproteins von Interesse.
    3. Pearson Korrelation Test durchführen (möglich ist mit einer statistischen Software), die Werte aus Bildanalyse von der IF Färbung (Schritt 2.2) zu den Ergebnissen von Immunoblotting (Schritt 3.4.2) zu korrelieren.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Fähigkeit der IF, die relative Menge des Anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in Zelllinien hergestellt in FFPE Gewebe Blöcke bestimmen zu bestätigen. Bcl-2 in Krebszellen selektiv quantifizieren kann onkogene Mechanismen aufzuklären und kann nützlich sein, in der pathologischen Diagnostik und klinisches Management Entscheidungen24zu informieren. Genauer gesagt, Bcl-2 spielt eine Rolle in richtige zahlreiche Entwicklung und sei...

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Diskussion

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Wir haben eine Methode beschrieben, dass der quantitativen Immunoblotting (IB) nutzt, um das Dienstprogramm Immunfluoreszenz (IF) zeigen für die Ermittlung der relativen Fülle an ein Zielprotein in FFPE Gewebeproben. Aktuelle Protein Quantifizierungsmethoden beschränken sich naturgemäß kategorische, z. B. chromogenen IHC2,3, oder durch die Notwendigkeit, Proben, Untersuchung der Beispielbeständen Struktur und Zelle zu verhindern, wie z. B. Homogenisieren mit IB u...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Fredrick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium (Uhr) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
697DSMZACC 42Zelllinie
JeKo-1ATCCCRL-3006Zelllinie
JurkatATCCTIB-152Zelllinie
RCH-ACVDSMZACC 548Zelllinie
Granta-519DSMZACC 342Zelllinie
REHDSMZACC 22Zelllinie
RajiATCCCCL-86Zelllinie
HeLaATCCCCL-2Zelllinie
Trypsin/EDTA-LösungInvitrogenR001100Zum Ablösen von Klebezellen
Fötales Rinderserum (FBS)Wisent Inc.81150Zur Neutralisierung von Trypsin
Neutral Gepuffertes FormalinProtokoll245-684Zum Fixieren von Zellpellets
UltraPure Agarose mit niedrigem SchmelzpunktInvitrogen15517-022Zum Gießen von Zellpellets
Monoklonaler Anti-Human-Bcl-2-Antikörper der Maus, Klon 124Dako (Agilent)Katze#: M088729-2, RRID: 2064429Zum Nachweis von Bcl-2 durch Immunfluorenz und Immunoblot (Los#:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-Fürdie Automatisierung der Immunfluoreszenzfärbung
EnVision+ System- HRP-markiertes Polymer (Anti-Maus)Dako (Agilent)K4000Für die Immunfluoreszenz-Signalverstärkung
EnVision+ System- HRP-markiertes Polymer (Anti-Kaninchen)Dako (Agilent)K4002Für die Immunfluoreszenz-Signalverstärkung
Cyanin 5 Tyramid-ReagenzPerkin ElmerNEL745001KTFür die Immunfluoreszenz-Signalamplifikation
Aperio ImageScopeLeica Biosystems -Zum Betrachten gescannter Objektträger
HALO-BildanalysesoftwareIndica Labs-Zur Quantifizierung von Immunfluoreszenz-Protease-Inhibitoren
(Halt-Protease-Inhibitor-Cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209Zur Ergänzung RIPA-Puffer
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)BioShopEDT001Für RIPA-Puffer
NP-40BDH Limited56009Für RIPA-Puffer
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD6750Für RIPA-Puffer
GlycerinFisherBiotechBP229Für Laemlli-Puffer
BromophenolblauBioShopBRO777Für Laemlli-Puffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611Für Laemlli-Puffer
Rinderserumalbumin (BSA)BioShopALB001Für Immunoblot-Waschungen
Proteinleiter (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374Zum Laufen von Proteingel
Filterpapier (Extra dickes Fleckenpapier)Bio-Rad1703969Zum Blotten
Transfer NitrozellulosemembranBio-Rad162-0115Für den Blotting-Transfer
Trans-blot SD halbtrockene TransferzelleBio-Rad1703940Für den halbtrockenen Transfer
Magermilchpulver (fettfreie Trockenmilch)Cell Signaling Technology9999SFür Blockierungspuffer
Tween 20BioShopTWN510Für Waschpuffer
GAPDH Kaninchen monoklonaler AntikörperEpitomics2251-1Primärer Antikörper des Kontrollproteins (Charge#: YE101901C)
Ziegen-Anti-Maus-IgG (HRP-konjugiert) Antikörperabcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Sekundärer Antikörper für Immunoblot
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (HRP-konjugiert) Antikörperabcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Sekundärer Antikörper für Immunoblot (Charge#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL-SubstrateBio-Rad1705060Für die Immunoblot-Signaldetektion
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461Für die Immunoblot-Signaldetektion
ImageJ SoftwareFreeware, NIH-Fürdie Densitometrie-Analyse

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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