Visualisierung zellulären Gibberellin-Ebenen mit NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Zusammenfassung

Gibberellin Wahrnehmung Sensor 1 (GPS1) ist der erste Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Biosensor zur Messung der zellulären Ebenen der Gibberellin Phytohormone mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung. Dieses Protokoll berichtet über die Methode zu visualisieren und zelluläre Gibberellin Ebenen mit Hilfe der genetisch codierten nlsGPS1 Biosensor in Arabidopsis Hypocotyle und Wurzelspitzen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Das Phytohormon Gibberellin (GA) ist ein kleiner, mobiler Signalmolekül, das eine Schlüsselrolle bei der Keimung der Samen, zelluläre Dehnung und Entwicklungsstörungen Übergänge in Pflanzen spielt. Gibberellin Wahrnehmung Sensor 1 (GPS1) ist der erste Förster Resonanz Energietransfer (FRET)-basierten Biosensor, die ermöglicht die Überwachung von zellulären GA Ebenen in-vivo. Durch die Messung der Fluoreszenz Emission Verhältnis von nuklearen lokalisiert-GPS1 (nlsGPS1), ist räumlich-zeitliche Zuordnung endogen und exogen zugeführten GA-Gradienten in verschiedenen Gewebetypen möglich auf zellulärer Ebene. Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie Bild-nlsGPS1-Emission-Verhältnisse in drei Beispiel-Experimente: Steady State, vorher-nachher-exogene Gibberellin A₄ (GA₄) Behandlungen, und im Laufe der Zeit ein Behandlungszyklus. Wir bieten auch Methoden zur Analyse nlsGPS1 Emission Verhältnisse mit Fidschi und eine kommerzielle dreidimensionale (3D) Schliffbild Visualisierung und Analyse-Software und erklären Sie die Einschränkungen und wahrscheinlich Gefahren der Verwendung von nlsGPS1, um Gibberellin Ebenen zu quantifizieren.

Einleitung

Pflanzenhormone spielen eine grundlegende Rolle bei Wachstum und Entwicklung. Diese kleinen, mobilen Signalmoleküle sind in der Regel auf mehreren Ebenen, z. B. Biosynthese Katabolismus und kurze und lange Distanzen Transport^1,2,3,4geregelt. Das Verständnis von Hormon Signalwege und nachgelagerten transkriptionelle Antworten hat im Laufe der Jahre geschärft. Um die vielfältigen zellulären Reaktionen der Hormon-Signalwege mit den regulatorischen Eingängen Regie Hormon-Distributionen zu verknüpfen, benötigen wir jedoch eine räumlich-zeitliche Quantifizierung der Hormonspiegel auf zellulärer Ebene. FRET-basierte Biosensoren, die Phytohormone erkennt können Wissenschaftler Fähigkeit zur Quantifizierung der Hormonspiegel auf zellulärer Ebene voraus. Bund-basierte Biosensoren bestehen aus einem Bund paar (Donor und Akzeptor fluoreszierende Proteine) verbunden mit einer sensorischen Domäne, die eine spezifische Liganden bindet oder auf einen biologischen Reiz reagiert. Für kleines Molekül Biosensoren löst Ligand-Bindung eine Konformationsänderung des sensorischen Bereich, der eine Änderung der Entfernung und/oder Ausrichtung zwischen den zwei fluoreszierenden Proteinen des Paares Bund führt. Eine ratiometrischen Analyse der eine Bund-Biosensor erfolgt durch spannende des Spenders und Messung der Fluoreszenz Emission Verhältnis der Akzeptor über Spender^5,6. Ligand-Bindung ist wie eine Veränderung in dieser Emission Ratio⁷nachweisbar.

Wir vor kurzem entwickelt eine Bund-basierten Biosensor, für das Pflanzenhormon GA. GAs sind eine Klasse von Hormonen, die Keimung der Samen, zelluläre Dehnung und der Entwicklungsbiologie Übergang von vegetativen zur Blüte Phasen fördern können. Der nlsGPS1-Biosensor ist nuklearen lokalisiert und raumzeitlichen Einblicke in GA Dynamik in verschiedenen Pflanzengeweben. In Arabidopsis Zellen GA bindet an lösliche Rezeptoren, Gibberellin unempfindlich Zwerg (GID), und der Komplex bewirkt den Abbau von DELLA-Proteinen, die als negative Regulatoren der GA Signalisierung²dienen. GA sensorischen Bereich der nlsGPS1 besteht aus der Arabidopsis GA-Rezeptor (AtGID1C) verbunden mit einer 74-amino Acid Abschneiden eines DELLA Proteins (AtGAI) und ein Bund paar bestehend aus verbessert Dimerisierung Varianten der Cerulean als Spender fluoreszierenden Proteins und Aphrodite (ein Codon diversifiziert Venus) als Akzeptor-fluoreszierende Protein-⁸. Der nlsGPS1-Biosensor ist ein Sensor, hohe Affinität für die bioaktiven GA₄ (K_d = 24 nM für GA-₄) und es kann in verschiedenen Gewebetypen zu ordnen und zu quantifizieren GA Gradienten genutzt werden. Zur Vermeidung von Fehlinterpretationen der Arabidopsis GA Ebenen in-vivo haben wir eine ausweichenden Variante des nlsGPS1 (nlsGPS1-NR), als Negativkontrolle zu verwenden. Das nlsGPS1-NR Protein trägt Mutationen in der GA-Bindungstasche, die stören die Bindung von GA und Mutationen im Protein DELLA, die die Interaktion mit GID-Rezeptor-Proteine-^7,-⁹zu stören. Emission Verhältnis Muster oder beobachteten Veränderungen in nlsGPS1 und nlsGPS1-NR Linien können Artefakte, die nicht direkt im Zusammenhang mit GA-Bindung Ereignisse betrachtet werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass nlsGPS1 Bindung an GA₄ nicht schnell reversibel ist und daher zellulären nlsGPS1 Emission Verhältnisse interpretiert werden, als die höchste aktuelle Konzentration von GA in einem bestimmten Kern anstatt die Echtzeit-Darstellung Steady-State Ebenen. Infolgedessen ist eine Analyse der sinkende GA nicht möglich mit nlsGPS1.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Nutzung eines Biosensors nlsGPS1 in den Zellen der Modellpflanze Arabidopsis, eine hochauflösende konfokale Imaging-basierte Ansätze mit. Das Protokoll enthält Informationen über bildgebende Pflanzenwurzeln und Hypocotyle im Steady-State und über Zeit-Kurse. Der nlsGPS1 Sensor könnte potenziell genutzt werden, in verschiedenen Gewebetypen, sowie über Pflanzenarten, zuordnen und GA-Distributionen zu quantifizieren.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie ½ Murashige und Skoog Agar pH 5,7 mit keine Saccharose (1 L).
   1. 2,2 g Murashige und Skoog (MS) basale Medium in 950 mL hochreines Wasser auflösen. PH-Wert bis 5,7 mit 5 M KOH anpassen.
   2. Die Lösung zu einem Endvolumen von 1 L mit Reinstwasser bilden. Teilen sie in zwei 500 mL Flaschen, jede mit 1 % pflanzlichen Agar. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten.
2. Bereiten Sie ¼ MS Flüssigkeit bei pH 5,7 mit keine Saccharose (1 L).
   1. 1,1 g von MS in 950 mL hochreines Wasser auflösen. PH-Wert bis 5,7 mit 5 M KOH anpassen. Die Lösung zu einem Endvolumen von 1 L mit Reinstwasser bilden. Teilen sie in zwei 500 mL Flaschen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 Minuten.
3. GA₄vorbereiten.
   1. Lösen Sie die GA₄ in Ethanol 70 %, eine Endkonzentration von 100 mM GA₄ Lager zu machen.
   2. Um funktionierende Lösung vorzubereiten, verdünnen Sie die GA₄ Lager auf 0,1 – 1 µM in ¼ MS flüssigen pH 5,7.

(2) Pflanzenwachstum

1. Sterilisieren Sie die Arabidopsis -Samen.
   1. Arbeiten Sie mit einem chemischen Haube. Aliquoten Saatgut (ca. 200) in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen Stift mit Chlor-resistenten Tinte und legen Sie die Rohre mit offenen Deckel im Innern des Behälters Sterilisation (eine große Kiste, die versiegelt werden kann).
   2. Legen Sie eine 250 mL-Becherglas mit 50 mL Reinstwasser und 50 mL Natriumhypochlorit-Lösung im Innern des Behälters Sterilisation.
   3. Das Becherglas 3 mL konzentrierte Salzsäure (HCl) hinzufügen. Sofort das Gefäß verschließen und Sterilisation von Chlorgas für 6 – 16 h ermöglichen.
   4. Schließen Sie nach Entsiegelung des Schiffes die Abdeckungen der alle Mikrozentrifugenröhrchen im Samen Rack. Sterilisierte Samen können bis zum Zeitpunkt der Beschichtung trocken gelagert werden.
2. Säen Sie ca. 20 sterilisierte Arabidopsis auf ½ MS Agar quadratischen Platten. Versiegeln Sie die Platten mit porösen chirurgische Klebeband und wickeln Sie sie mit Alufolie. Lang 1 – 3 Tage für Schichtung bei 4 ° C inkubieren.
3. Für die Wurzel Bildgebung, übertragen die Platten der Wachstum Kammer in einer vertikalen Position für 3 Tage mit den folgenden Wachstumsbedingungen: langen Tage Bedingungen (LD, 16 h Licht/8 h der Dunkelheit); 120 µmol⋅m^-2s^-1 Lichtintensität; Temperatur von 22 ° C (während der Licht-Zyklus) oder 18 ° C (während des dunklen Zyklus), 65 % Relative Luftfeuchtigkeit (RH).
4. Für Dunkelheit gewachsen Keimachse: übertragen Sie die Platten auf Wachstum Kammer für einen Lichtimpuls von 1 – 4 h um die Keimung zu synchronisieren. Wickeln Sie die Platten mit Alu-Folie und legen Sie sie in die Kammer Wachstum in einer vertikalen Position für 3 Tage.

3. die Probenvorbereitung

1. Stationäre Messungen (Abbildung 1A()
   1. Fügen Sie auf einen sauberen Objektträger 50 µL ¼ MS Flüssigkeit (von nun an als mock Lösung bezeichnet). Übertragen Sie sanft zu Sämlinge mit dem Ausdruck nlsGPS1 von der Platte auf die Folie.
   2. Nehmen Sie ein sauberes Deckglas und vor Ort einen Tropfen Vakuum Fett an jeder Ecke das Deckglas. Sanft lege das Deckglas über die Sämlinge und sorgfältig fügen Sie zusätzliche Pseudo-Lösung um Luftblasen zu entfernen.
2. GA₄ Behandlung: chemische Exchange Experiment (Abbildung 1 b).
   1. Vor der GA₄ Behandlung, verwenden Sie eine 20 mL Spritze gefüllt mit Vakuum Fett (verbunden mit einem Pipettieren Tipp) um ein Rechteck zu zeichnen (Länge: 3,5 cm, Höhe: 2,5 cm) mit einer gleichmäßigen Schicht Vakuum Fett auf einem sauberen Objektträger (Abbildung 1 b). Um eine feine Linie von Vakuum Fett zu ermöglichen, sollte die Pipettieren Spitze geschnitten werden, um eine Öffnung von 1 mm Durchmesser haben.
   2. Die Objektträger 50 µL mock-Lösung hinzufügen. Wählen Sie mit sauberen Pinzette die nlsGPS1 Sämlinge und legen Sie sie sanft auf die mock Lösung. Um Schäden zu vermeiden, übertragen Sie die Keimlinge von den Unterseiten der Keimblätter zu unterstützen, ohne den Keimling mit der Pinzette greifen.
   3. Nehmen Sie ein sauberes Deckglas und vor Ort einen Tropfen Vakuum Fett an jeder Ecke das Deckglas. Mit der Pinzette, legen Sie das Deckglas in der Mitte des Rechtecks Vakuum Fett. Jetzt ist das Deckglas auf beiden Seiten entsprechend den langen Kanten des Rechtecks Vakuum Fett versiegelt.
   4. Fügen Sie sorgfältig extra mock Lösung füllen Sie das Reservoir und eventuelle Luftblasen innerhalb des Reservoirs zu entfernen, ohne störende Seedling(s) im Inneren.
   5. Erwerben Sie die Bilder vor der GA₄ Behandlung mit einem konfokalen Mikroskop. Folgen Sie den Anweisungen, wie in Abschnitt 4 dieses Protokolls beschrieben.
   6. Entfernen Sie für die GA₄ Behandlung den Mikroskop-Objektträger von der konfokalen Bühne. Stellen Sie einen Timer für 20 Minuten.
   7. Nach dem Start des Timers, tauschen Sie die Pufferlösung mit ¼ MS Flüssigkeit mit 1 µM GA_{4 aus}. Fügen Sie GA-₄ -Lösung (ca. 50 µL hinzu) von der linken Seite das Deckglas und entfernen Sie die vorherigen (mock) Lösung von der rechten Seite. Austausch zu halten auf die Lösung, die mock Lösung vollständig zu ersetzen, die dauert ca. 10 Minuten (Abbildung 1 b).
   8. Setzen Sie den Objektträger wieder auf den Mikroskoptisch. Warten Sie weitere 10 min vor dem Erwerb der nach GA-Bild.
3. Einrichten von einem zeitlichen Verlauf für das Gewebe von Interesse
   Hinweis: Das Gewebe von Interesse könnte zum Beispiel Hypocotyle oder Wurzeln sein. Routinemäßig führen wir Zeit Kurse für nlsGPS1 Biosensor mit einem kommerziellen Perfusion imaging (Abbildung 1, siehe Tabelle der Materialien) oder ein RootChip^7,10,11.
   1. Der Mitte des Kanals Perfusion der klebrig-Folie 200 µL mock-Lösung hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien). Sanft wählen Sie nlsGPS1 Sämlinge und legen Sie sie auf die mock-Lösung in die klebrige Folie.
   2. Mit Pinzette, sanft die Glas-Deckglas bringen und mit der Rückseite der Zange, drücken Sie vorsichtig an den äußeren Rändern der Deckglas so dass es eine starke Bindung mit dem klebrigen Material an der Peripherie der klebrig-Folie bildet.
   3. Mit beiden Ellenbogen Luer verbinden Steckverbinder (mit einem Innendurchmesser [ID] von 0,8 mm) und der Silikonschlauch (mit einer Kennung von 0,8 mm), die klebrige Folie um eine 20 mL Spritze und einem Auslass Behälter sammeln die Abfluss-Lösung. Verwenden Sie den Luer Lock Anschluss (mit einer Kennung von 0,8 mm) Verbindung die Spritze zu den Silikonschlauch.
   4. Drücken Sie vorsichtig die Spritze mit der mock Lösung manuell um lassen genug Lösung durch die Kammer weiterleiten, damit keine Luftblasen in der Kammer Links vorhanden sind. Legen Sie und halten Sie die Spritze auf die programmierbare Spritzenpumpe.
   5. Stellen Sie die Pumpe Parameter bestimmte an der Spritze verwendet (dh., Durchmesser und Volumen) zusammen mit der Durchfluss entsprechend der Bedienungsanleitung mit der Pumpe zur Verfügung gestellt.
      Hinweis: In diesem Protokoll ein Durchfluss von 1 – 3 mL/h diente, und dies kann nach den experimentellen Anforderungen geändert werden. Starten Sie den zeitlichen Verlauf durch Starten der Pumpe.
   6. Stoppen Sie für GA₄ Behandlung während einer zeitlichen Verlauf (Abbildung 1) die Durchblutung durch Anhalten der Pumpe zu und ändern Sie die Spritze mit einer neuen ein mit ¼ MS Flüssigkeit mit GA₄ergänzt. Gehen Sie mit konfokale Bildgebung, wie im nächsten Abschnitt gezeigt.

(4) Mikroskopie

Hinweis: Wir führen konfokale Lasermikroskopie.

1. Abrufen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop ausgestattet mit Lasern Bund Bildgebung durchführen.
   Hinweis: Für nlsGPS1 sind Varianten von Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) abgebildet. In diesem Protokoll werden kommerzielle Mikroskope (siehe Tabelle der Materialien, als Mikroskop 1 und 2) mit 10 X oder 20 X trocken 0,70 harmonische Verbindung PLAN APO Ziele verwendet.
2. Für Mikroskop 1, Verwendung 448 nm und 514 nm Wellenlänge Laser CFP und YFP, bzw. zu begeistern. Sequenzielle Scans zu erwerben. Setzen Sie Detektoren (z. B. HyD SMD), um 460-500 nm für GFP (Spender Emission) und 525-560 nm für YFP (Bund Emission) nach der Anregung der GFP zu erkennen. Legen Sie mithilfe einer zweiten Sequenz eines Detektors, 525-560 nm für YFP (YFP Emission) zu erkennen nach der Anregung von YFP.
   Hinweis: Diese YFP Fluoreszenz wird als Ausdruck Kontrolle sowie Segmentierung Kerne, Oberflächen mit einem kommerziellen Schliffbild 3-d-Visualisierung und Analyse-Software generiert.
3. Für Mikroskop 2, Verwendung 440 nm und 514 nm Wellenlänge Laserlinien CFP und YFP, bzw. zu begeistern. Zwei Tracks zu erwerben. Für Spur 1 Detektoren (z. B.., ChS) zur Erkennung von 464 – 500 nm für GFP (Spender Emission) und 526 – 562 nm für YFP (Bund Emission) nach der Anregung von GFP festgelegt. Für track 2, einen Detektor zu erkennen 526 – 562 nm für YFP (YFP Emission) nach der Anregung von YFP gesetzt.
   Hinweis: Diese YFP Fluoreszenz wird als Ausdruck Kontrolle sowie Segmentierung Kerne, verwendet, um Oberflächen in der 3-d-Visualisierung und Analyse-Software zu erzeugen.
4. Abrufen von Bildern mit einem Format von 512 x 512 Pixel und einer Auflösung von 12 Bit.
5. Der Gewinn muss auf einen empirisch ermittelten Wert eingestellt werden, die für ein gutes Signal ermöglicht, während die Pixel nicht zu sättigen. Der Gewinn sollte zwischen GFP und Bund über das Experiment nicht geändert werden. Legen Sie das Loch auf 1 luftig Einheit (AU). Legen Sie die IBIDI klebrig-Folie auf der Stufe der confocal Mikroskop, und fahren Sie mit Bildgebung wie zuvor gezeigt.
6. Im Mikroskop 1 Software in der eine aktive live-Bild nutzen Sie Glühen über/unter befindet sich auf der oberen linken Seite des Bildschirms Bild, um die Unterbelichtung und Sättigung des relevanten Bereichs bestimmen. Nutzen Sie in das Mikroskop 2 Software Range Indikator befindet sich auf der Unterseite des Bildschirms Bild zur Ermittlung der Unterbelichtung und Sättigung der Region von Interesse. Für eine quantitative Bildanalyse sollte keine Pixel-Sättigung.
7. Legen Sie die Z-Stapel mit einer Schrittweite von 1 μm. Die Schrittgröße kann für eine höhere Z-Auflösung reduziert oder erhöht für eine erhöhte Geschwindigkeit der Erwerb oder die Anzahl der Positionen/Samples zu erhöhen, die abgebildet werden können. Stellen Sie für den automatisierten zeitlichen Verlauf die Zeit zusammen mit der Z-Stapel (Xyzt-Modus von der Registerkarte "Übernahme-Modus"), um die Bilder in bestimmten Zeitabständen zu erwerben.

(5) Bildanalyse mit Fidschi

Hinweis: Mit ImageJ (Fidschi) ist es möglich, Bilddaten verarbeiten und zweidimensionale (2D)-Bilder der nlsGPS1 Emission Ratio in Arabidopsis Sämlinge zu erzeugen. Beispiele für Bilder siehe Abbildung 2A, 2 C, 2E, 2 Gund 3A. In ImageJ ist es möglich, jedem Befehl dieses Protokolls über die Suchfunktion zu finden. Drücken Sie die Leertaste und L auf der Computertastatur. Es öffnet sich ein neues Fenster; Geben Sie den gewünschten Befehl in das Suchfeld ein.

1. Ziehen Sie die Datei (entweder .lif oder .lsm-Dateien) in Fidschi (Bild J) und öffnen Sie die Bilder als hyper-Stack.
2. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Stack > Z-Projekt und wählen Sie Summe Scheiben alle Pixel anstatt nur die hellsten Pixel wie Max Projektionzu erfassen.
3. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Subtract Hintergrund und Satz der rollenden Kugel Radius 50 Pixel. Alle anderen Optionen deaktivieren und alle drei Bilder zu verarbeiten. Diese Schritt entfernt Hintergrund mit dem "rollenden Ball"-Algorithmus.
   Hinweis: 50 Pixel wurde empirisch bestimmt, Kerne als Vordergrund aufzunehmen.
4. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle teilen. Drei neue Fenster öffnet sich: C1-Summe (GFP Kanal); C2-Summe (Bund Kanal) und C3-Summe (YFP Kanal).
5. Wählen Sie das C3-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1 um das Bildrauschen zu reduzieren.
6. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrast und wählen Sie Auto.
7. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Kontrast verbessernund Set gesättigten = 0.35.
8. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Art > 8-Bit und die Stapel in einem 8-Bit-Bild umwandeln.
9. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Auto-Local-Schwelle. Wählen Sie in der Auto-Local-Schwelle, die folgenden Parameter: Phansalkar Methode, Radius = 15, Parameter 1 = 0, Parameter 2 = 0und weiße Stapel. In diesem Schritt werden YFP Stapel verwendet, um eine binäre Maske machen.
10. Wählen Sie das C2-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1.
11. Wählen Sie das C1-SUM -Fenster und wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner und wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichner 1.
12. Erstelle ich die Emission Verhältnis Stapel aus den zwei Kanälen aus dem Hauptmenü wählen Sie Prozess > Bildrechner. In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, wählen Sie C2-Summe als Bild 1, wählen Sie Teilen als Betreiber und C1 Summe als Bild 2.
13. Achten Sie darauf, wählen erstellen ein neues Fenster "und" die 32-Bit-Format. Ein neues Fenster erscheint benannte Ergebnis der C2-Summe.
14. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > Lookup-Tabelle > LUT 16_colors.
15. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Bildrechner. In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, wählen Sie Ergebnis der C2-Summe als Bild 1, wählen Sie multiplizieren Sie als Betreiber und C3-Summe als Bild 2. In diesem Schritt wird die YFP binäre Maske mit dem YFP/GFP-Stack nur Pixel in der Steuerkanal YFP präsent zeigen multipliziert.
16. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Mathematik > Teilen und weisen ihr den Wert 255. Wählen Sie in dem neuen Fenster, das geöffnet wird Ja , alle Bilder im Stapel zu analysieren. Ein neues Bild erscheint benannte Ergebnis des Ergebnis der C2-Summe.
17. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrast und wählen Sie Auto.
18. Wählen Sie aus dem Hauptmenü Prozess > Kontrast zu erhöhen, und wählen Sie Typ gesättigt = 0.35.
19. Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild > anpassen > Helligkeit/Kontrastund eingestellten minimalen und maximalen Werte die GA-Verteilung zu erfassen. Optionaler Schritt: Wählen Sie im Hauptmenü von Analyze > Tools > Kalibrierung Bar und Bar Show LUT-Kalibrierung, und das Ergebnis des Ergebnis der C2-Summe als eine TIFF-Datei speichern.
20. Werte der Emission Verhältnisse, aus dem Hauptmenü wählen Sie Analyze > Messung festlegen und wählen Sie graue Mittelwert und Standardabweichung.
21. Wählen Sie das Rechteck-Shape aus der Symbolleiste und ziehen einer Region of Interest (ROI). Wählen Sie im Hauptmenü von Analyze > messen. Ein neues Fenster wird den Mittelwert aus den ausgewählten ROI berichten.
22. Kopieren und fügen Sie die erhaltenen Werte in Tabellenkalkulations-Software (z. B. Excel oder OriginPro) und machen ein Histogramm für ein vorher-nachher-GA₄ Behandlung zu experimentieren oder ein Liniendiagramm für einen zeitlichen Verlauf zu experimentieren.

(6) Bildanalyse mit 3-d-Visualisierung und Analyse-Software

Hinweis: Der Vorteil der Verwendung der ausgewählten Software (siehe Tabelle der Materialien) ist zu segmentieren Objekte (z. B. Kerne) und 3-d-Bilder aus einem konfokalen Z-Stapel zu erstellen. Beispiele für Bilder siehe Abb. 2 b, 2D, 2F, 2 Hund 3 b.

1. Öffnen Sie die Software und importieren Sie die Datei (entweder .lif oder .lsm-Dateien).
2. Segment Kerne anhand der YFP Emission Steuerkanal mit dem Oberflächen-Assistenten. Die segmentierte Objekte sind "Oberflächen" bezeichnet. Diese Segmentierung Schritt erlaubt die Analyse von allen Voxel im Kern als ein Objekt ohne Hintergrund aus Voxeln außerhalb der Kern.
3. Hintergrundabzug (lokaler Kontrast) soll in der Oberflächen-Assistenten3 µm und die Schwellwerte auf Standard. Maskieren Sie die GFP Emission (Spender Erregung Spender Emission [DxDm]) und Bund Emission (Spender Erregung Akzeptor Emission [DxAm]) Kanäle anhand der Oberflächen mit den YFP Emission (Akzeptor Erregung Akzeptor Emission [AxAm]) Kanal erstellt.
4. Verwenden Sie die Erweiterung XT bedeuten Intensitätsverhältnis , um ein Verhältnis von Spender Erregung Akzeptor Emission geteilt durch Spender Erregung Spender Emission (DxAm/DxDm) zwischen den Intensitätswerten der mittlere der einzelnen Flächen in den beiden Kanälen zu berechnen.
   Hinweis: Diese Erweiterung ist online zum Download verfügbar.
5. Um die einzelnen Oberflächen mit dem nlsGPS1-Emission-Verhältnis Farbe, wählen Sie Farbcodierung mit Statistiken, die als Farbe Rad-Symbol dargestellt wird. Wählen Sie als Statistik Intensitätsverhältnis bedeuten .
6. Exportieren Sie die Verhältnisse der einzelnen Werte aus der Tabelle, die unter dem Statistik -Symbol zu finden ist.
7. Kopieren und fügen Sie die Werte in eine Tabelle und ein Histogramm für vorher-nachher-GA₄ Behandlung Experimente oder ein lineares Diagramm Mal Kurs Experimente zu machen.

7. statistische Analyse

Hinweis: Siehe Abbildung 3D für einen Beeswarm und Box Plot nlsGPS1 Emission Verhältnisse.

1. Öffnen Sie die Software und fügen Sie das Verhältnis der Emission der Kerne Oberflächen als Y-Spalten ein.
2. Wählen Sie die Spalten von Interesse und Statistik > Statistik Beschreibung > Normalität zu testen , zu wissen, ob die Stichproben normalverteilt sind. Führen Sie den Test von Normalität und ein neues Fenster öffnet und die Ergebnisse zu melden.
3. Wenn die Stichproben normalverteilt sind, verwenden Sie den t-test als statistische Test. Wählen Sie Statistik > Hypothesentests > zwei Stichproben t-Test auf Zeilen und Lauf der t-test.
4. Wenn die Proben nicht normalverteilt sind, wählen Sie Statistik > Statistik Hypothesentests > zwei-Stichproben für die Varianz zu testen , zu wissen, ob die Varianz zwischen den Beispielen nicht wesentlich unterscheidet.
5. Wenn die Abweichung nicht wesentlich unterscheidet, verwenden Sie die Mann-Whitney U test als statistischen Test. Wählen Sie Statistik > Nichtparametrische Test > Mann-Whitney test und führen Sie den Test.
6. Wenn die Varianz deutlich abweicht, verwenden Sie Kruskal-Wallis ANOVA testen als statistische Test. Wählen Sie Statistik > Nichtparametrische Test > Kruskal-Wallis ANOVA testen und führen Sie den Test.

Ergebnisse

Mit nlsGPS1, ist es möglich, zelluläre GA₄ Ebenen in Geweben zu Fluoreszenz-Bildgebung, einschließlich Wurzelspitzen und dunkel geworden Hypocotyle (Abbildung 2) zu messen. In der Arabidopsis -Wurzel beträgt die nlsGPS1 Emission Verhältnis Steigung bezeichnend für niedrige GA in der Abteilung und meristematic Zonen und hohe GA in der späten Dehnung Zone (Abb. 2A und 2 b). Im Gegensatz dazu wurde eine Emission Verhältnis Farbverlauf nicht beobachtet, in nlsGPS1-NR Wurzeln, darauf hindeutet, dass die endogene GA Gefälle kein Artefakt (Abbildung 2 und 2D) ist. Ein nlsGPS1 Emission Verhältnis Gefälle wurde auch im Dunkeln angebautes Hypocotyle mit niedrigen Niveau in die Keimblätter und die apikalen Haken und hoher schnell spannungsreicher basale und Umgebung die Keimachse (Abb. 2E und 2F) gebildet. Im Gegensatz dazu wurde eine Emission Verhältnis Farbverlauf nicht in der nlsGPS1-NR Hypocotyle (Abbildung 2 und 2 H) beobachtet. In Arabidopsis Wurzeln und Dunkelheit gewachsen Keimachse Zellen endogene GA Ansammlung korreliert mit zellulären Dehnung.

Darüber hinaus sammelt exogen zugeführten GA₄ bevorzugt in der Dehnung-Zone im Vergleich zu der Abteilung Zone der Arabidopsis -Wurzel (Abbildung 3), darauf hinweist, dass diese nlsGPS1 verwendet werden, um die endogene und exogene GA zu studieren Musterung.

Während der Zeit Kurs Experimente, nlsGPS1 Sämlinge wurden in klebrige Folie Kammern gelegt und mit ¼ MS Flüssigkeit durchströmt, gefolgt von einer Behandlung mit 0,1 µM GA₄ für 30 min. Das Video zeigt eine schnellere Anhäufung von exogenen GA₄ in der Wurzelzone Dehnung im Vergleich zu der Abteilung Zone (Video 1).

Abbildung 1: Probenvorbereitung für die konfokale Bildgebung. Diese Tafeln zeigen eine schematische Darstellung der Probenvorbereitung für (A) ein Steady-State Experiment, (B) vorher-nachher-exogene GA₄ Behandlungen und für die Verwendung von (C) eine Behandlung Zeit Kurs experiment klebrig-Folien (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Der GA Farbverlauf in Arabidopsis Wurzeln und dunkel geworden Hypocotyle. Zweidimensionale Bilder (A) nlsGPS1 und (C) nlsGPS1-NR Wurzeln wurden mit ImageJ Software analysiert und dreidimensionale Bilder von (B) nlsGPS1 und (D) nlsGPS1-NR wurden mit einem kommerziellen dreidimensionale analysiert Bildanalyse-Software. Beide Analysen ergaben eine endogene GA₄ Farbverlauf in Arabidopsis Wurzeln. Zweidimensionale Bilder (E) nlsGPS1 und (G) nlsGPS1-NR Dunkelheit gewachsen Keimachse wurden mit ImageJ Software analysiert und dreidimensionale Bilder von (F) nlsGPS1 und (H) nlsGPS1-NR wurden analysiert mit Hilfe der kommerzielle dreidimensionale Bildanalyse-Software. Beide Analysen ergaben eine endogene GA₄ Farbverlauf im Dunkeln angebautes Hypocotyle. Die LUT-Leiste zeigt die falsche Färbung des nlsGPS1 Emission Verhältnisse. YFP Bilder werden als Ausdruck Kontrollen gemeldet. Keimachse Bilder wurden mit zwei Bühne Positionen übernommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: die exogene GA-Gradienten in Wurzeln. Die ersten zwei Platten Show (A) zweidimensionale und dreidimensionale Bilder (B) ein nlsGPS1 Stamm vor und 20 min nach der Behandlung von exogenen GA₄ (1 µM). YFP Bilder werden als Ausdruck Kontrollen gemeldet. Die letzten beiden Platten Show (C) der Mittelwert und Standardabweichung und (D) Beeswarm und Box-Plot nlsGPS1 Emission Verhältnisse für Kerne der Dehnung Zone (die Region, die mit einem weißen Rahmen definiert ist). Im Bereich Dehnung der nlsGPS1 Emission lag deutlich höher nach GA₄ Behandlung (Mann-Whitney U-Test *** P-Wert < 0,0001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1: Perfusion Experiment von nlsGPS1 Root mit klebrige Folie. Dieses Video zeigt dreidimensionale Bilder von nlsGPS1 mit ¼ MS Flüssigkeit durchströmt und mit 0,1 µM GA₄ für 30 min. behandelt. In den zeitlichen Verlauf Bildgebung erwarb alle 10 min für 3 h mit die folgenden Intervalle: 30 min von mock-Lösung (Rahmen t = 1, t = 2, t = 3), 30 min. von GA₄ Behandlung (Rahmen t = 4, t = 5, t = 6), 2 h von Mock so Lution (Rahmen t = 7 t = 18) Lösung. Vor der Übernahme wurde die Probe mit mock-Lösung für 2 h Klicken Sie bitte hier um dieses Video anzusehen durchblutet. (Rechtsklick zum download)

Diskussion

Die Bund-basierte GA-Biosensor-nlsGPS1 bietet eine quantitative Methode zum Bericht und zur Messung GA Hormon Gradienten in mehrzelligen Pflanzen. Bund-basierte Biosensoren können Dynamik mit einer verbesserten räumlich-zeitliche Auflösung über direkte Nachweis durch Massenspektrometrie und indirekte Messung von transkriptionelle Reporter oder Signalisierung-Protein-Abbau-basierte Methoden^{12quantifizieren, 13}. Hochauflösende zelluläre Bildgebung in verschiedenen Gewebetypen kann aussagekräftige Einblicke in GA Biologie und Funken neue Hypothesen über die Regulierung und die Funktion der GA Ansammlungen in einem mehrzelligen Kontext ergeben. Beispielsweise könnte Überwachung von Änderungen in der nlsGPS1-Biosensor in spezifischen GA biosynthetischen, katabole und Transport durch Mutation entstehende Variationen, sowie während raumzeitlich bedingten Störungen werden sehr informativ zu testen, speziell wie GA Gradienten gegründet werden die Wurzel und die Adresse Wurzel Zelle Antworten auf GA-Gradienten. Der Sensor könnte bei anderen Spezies Model und Ernte verwendet werden, um die Erhaltung der Mechanismen testen, die die GA-vermittelten der Keimung der Samen, zelluläre Dehnung und Blüte Steuerung.

Die entscheidenden Schritte in der Bund-basierte Bildgebung von der nlsGPS1-Biosensor sind, dass (1) die Pixel sollte nicht während der quantitativen Analysis Bund gesättigt werden, (2) Bildgebung Parameter wie "Detektor Gewinn" für die Spender Emission (DxDm) konstant gehalten werden sollte und Akzeptor Emission (DxAm) übernahmen, 3) nlsGPS1-NR Steuerleitungen sollten verwendet werden, um Artefakte und 4 ausschließen) Proben sollte bereit sein, Drift und fokale Veränderungsthemen zu minimieren. Darüber hinaus sind die Umgebungsbedingungen, in denen Proben angebaut sind, wichtig, da GA Ebenen empfindlich auf Umwelteinflüsse wie Leuchtdauer und Lichtintensität^{14,15,16 sind zu kontrollieren ,17}. Eine wichtige Einschränkung dieser Art von Analyse ist, dass ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis für die Bildgebung aufgrund der Zunahme des Lärms innewohnt ratiometrischen Bildgebung erforderlich ist. NlsGPS1 Bildgebung werden somit nicht nützlich für Gewebe und Organe, die nicht zugänglich ratiometrischen Fluoreszenz-Mikroskopie mit Cyan und gelb fluoreszierende Proteine sind – zum Beispiel tiefer gelegene Gewebe wo fluoreszierende Proteine schlecht erkannt werden. Auf der anderen Seite werden ratiometrischen anzeigen häufig bevorzugt über Intensiometric auslesen, weil eine interne Kontrolle ist hilfreich, um auszuschließen, Artefakte, die aufgrund von Änderungen der Biosensor Ausdruck, Stabilität, Helligkeit oder Nachweisbarkeit in einer bestimmten Zelle, Gewebe , oder Zustand. Zum Beispiel ärgern Biosensor Bildgebung und Bild-Analysen auch verwendet wurden, um eine Vielzahl von Liganden in einer Vielzahl von Geweben^{5,6,18,19,20,}zu studieren. Die bildgebenden Experimenten und Bild-Analysen berichtet hier können angepasst werden neue bildgebende Verfahren, wie Lichtblattmikroskopie, die neue Einblicke in zum Beispiel tiefere Wurzel-Gewebearten ergeben könnte.

Der ersten Generation nlsGPS1-Biosensor ist ein High-Affinity-Sensor, der eine hochauflösende Karte von GA Gradienten liefert, die auch auf den intrazellulären Zuwachs bei GA nach exogener GA Behandlungen berichten können. Die aktuellen Grenzen der nlsGPS1 gehört, dass der Sensor nicht schnell reversibel ist und somit nicht auf stationäre GA Ebenen aber wahrscheinlich auf die maximale den letzten GA-Konzentration in der Lösung von Interesse meldet. Die präzise Fluktuationsrate für den Sensor ist auch nicht bekannt, und dies, in Kombination mit niedrigen Reversibilität schließt Erkennung von endogenen GA Aufzehrung, das passiert sein könnte innerhalb von ein paar Minuten um ein paar Stunden in einigen Gewebearten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass nlsGPS1 hat eine hohe Affinität für GA₄ (K_d = 24 nM) im Vergleich zu anderen Formen der GA (GA₃ K_d= 240 nM, GA₁K_d = 110 nM) beim anderen bioaktiven GAs ^{abbilden 7}. zukünftige Generationen von GA Biosensoren können konstruiert werden, Reversibilität erhöhen und gleichzeitig hohen Affinität oder andere Besonderheiten für verschiedene Vorläufer, bioaktive, oder Catabolite GAs aufweisen. 

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis-Samen	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis-Samen	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	lösen sich in EtH 70% auf und halten bei -20 &de; C
Natriumhypochloritlösung (Bleichmittel)	Fisher S/5040	HSRA 064
Wasserstoffclorid HCl	Sigma	31434
Mikroporenband	3M	1530-1
ibidi Sticky-Slide	Ibidi	81128	Luer 0,1 für die Wurzelbildgebung
ibidi Sticky-Slide	Ibidi	80168	Luer 0,2 für Hypokotyl-Bildgebung
Glasdeckglas für klebrige Objektträger	Ibidi	10812
Ellbogen-Luer-Anschlüsse	Ibidi	10802
Silikonschlauch	Ibidi	108401
Luer-Lock-Anschluss	Ibidi	10826
programmierbare Spritzenpumpe	World Precision Instruments	AL-1000
Vakuumfett	Sigma	18405
Murashige und Skoog Basalsalze	Duchefa	M0221
Agar-Pflanze, 1 kg	Melford	P1001
Objektträger geschliffene Kanten, 76 mm x 26 mm, 1,0 mm bis 1,2 mm dick	Fisher Scientific	12383118
Deckglas Nr. 1 1/2 Glas 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-Slip-Spritze 20 mL	Fisher Scientific
3M Micropor Chirurgisches Papierband	Fisher Scientific	12787597
Kaliumhydroxid, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolutes Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Pinzette Uhrmacher 5 StSteel	Scientific Laborbedarf	INS4340
Schere, 125 mm, Edelstahl	Fisher Scientific	12338099
Fitting Reducer 0,5 bis 1,6	Ibidi	10829
Leica SP8			Konfokales Lasermikroskop 1
Zeiss LSM 780			Konfokales Lasermikroskop 2
Imaris	Bitplane		3D-Visualisierungs- und Analysesoftware
Fidschi			Bildanalysesoftware
OriginPro	Software für statistische Analysen	im Labor