Summary
이 문서 T4 결 찰 및 어 닐 링 작은 원형 DNA 분자의 변성 페이지 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 원형 타일, 조립 및 1d 및 2D DNA nanostructures agarose의 AFM 이미지의 기본 페이지 분석 젤 유한 DNA nanostructures의 전기 및 원심 분리 정화입니다.
Abstract
이 문서에서는 작은 원형 DNA 분자의 합성에 대 한 자세한 프로토콜 제공 원형 DNA 모티프와 1d 및 2D DNA nanostructures의 건설의 어 닐 링. 년간, DNA 나노기술의 급속 한 발전은 원본 자료로 선형 DNAs의 사용에 기인 합니다. 예를 들어 DAO (더블 크로스 오버, antiparallel, 이상한 반 회전) 타일은 2 차원 DNA 격자;의 건설을 위한 빌딩 블록으로 잘 알려진 DAO의 핵심 구조 오른손 할머니 매듭을 만드는 2 개의 로프 같은 두 선형 단일 가닥 (ss) oligonucleotides에서 이루어집니다. 여기, DNA 타일 cDAO (결합 된 DAO) 라는 새로운 유형의 c64nt 또는 c84nt의 작은 원형 ss DNA를 사용 하 여 작성 됩니다 (원형 64 나 84 뉴클레오티드) 비 계 물가와 여러 가지 선형 ss-DNAs 주식 가닥으로. 완벽 한 1d 및 2D nanostructures cDAO 타일에서 조립 된다: 무한 나노 와이어, nanospirals, 나노튜브, nanoribbons; 그리고 유한 나노-사각형입니다. 자세한 프로토콜 설명: 1) 준비 T4 리가와 작은 원형 oligonucleotides의 페이지 (polyacrylamide 젤 전기 이동 법)을 변성 시키기 의해 정화, 3) 조립 기본 페이지 분석, 다음 2) 안정적인 원형 타일의 어 닐 링 무한 한 1d 나노 와이어, nanorings, nanospirals, 나노튜브와 nanoribbons, 그리고 유한 2D 나노 사각형의 무한 한 2D 격자 AFM (원자 힘 현미경) 이미징 옵니다. 방법은 간단 하 고, 강력 하 고, 대부분의 실험실에 대 한 저렴 한입니다.
Introduction
DNA 분자 년간 nanostructures의 많은 종류를 만들려고 사용 되었습니다. 전형적인 주제 포함 대 (더블 크로스 오버, antiparallel, 심지어 반 돈다) 및 DAO 타일1,2,3, 스타 타일4,5,,67, 단일 (ss) 타일8,,910및 DNA 종이 접기11,,1213좌초. 이러한 DNA 모티프와 격자는 선형 ss DNAs에서 조립 된다. 최근에, 다른 사람 그리고 우리 모티프, 1 D 나노튜브 및 2D 격자14,15,,1617구축 건설 기계로 원형 ss oligonucleotides의 사용을 보고 있다. C64nt의 센터에서 할러데이 접합 (HJ)18,,1920,21 을 삽입 하 여 두 개의 결합 된 DAO 타일의 쌍 형성된17될 수 있습니다. 이 새로운 cDAO 모티프와 그 파생 상품 안정 되며 2D를 충분히 엄밀한 DNA 격자 3 × 5 µ m2. 이 문서 사용 하 여 안정적인 DNA 복잡 한 분자 하나 원형 비 계 및 다른 선형 스테이플 ss oligonucleotides의 생성으로 정의 된 "원형 타일"의 기간과 "선형 타일", 선형의 완전 한 세트에서 건설 되는의 다른 기간 ss oligonucleotides입니다.
이 프로토콜 건설 기계로 작은 원형 DNA 분자와 DNA nanostructures의 5 종류를 구성 하는 방법을 보여 줍니다: 1) 무한 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어, 2) 무한 한 2D cDAO-c64nt-O 및 cDAO-c64nt-E (-O 5 반 돈다 고-E의 홀수를 나타냅니다 4 반-회전의 짝수 나타냅니다) 격자, 3) 무한 2D cDAO-c84nt-O 및 cDAO-c84nt-E의 격자, 4) 유한 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 사각형, 5) 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals ( 를 참조 하십시오 그림 3-5 회로도 도면 및 DNA nanostructures의 위의 5 종류의 이미지에 대 한). 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어는 각각 두 개의 선형 스테이플와 관련 된 각 c64nt 및 c84nt 비 계에서 조립 된다. CDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c74nt, 또는 cDAO c84nt의 각 원형 타일은 각각 c64nt, c74nt, 또는 4 개의 선형 스테이플 c84nt는 해당 비 계에서 소 둔. 무한 한 2D 격자는 동일한 유형의 다른 시퀀스를 두 개의 원형 타일에서 조립 된다. 두 개의 유한 2D 사각형 격자는 각각 32 원형 보조 타일의 두 세트에서 조립 된다. 돈을 저축 하기 위해 단 하나의 시퀀스 c64nt, c74nt, 및 c84nt는 각각 발판으로 다른 돌출부 anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt, 그리고 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 각각 20 cDAO-c84nt 원형 하위 타일 다음 하는 데 사용 됩니다. 해당 32 원형 하위 타일을 함께 혼합 하 고 두 번째 격자 유한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 각각 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 격자, 조립 하는 단계를 어 닐 링을 적용. 그러나 확실히, 그것은 더 많은 돈과 노동력을 요할 것 이다 다르게 시퀀싱 원형 건설 기계 유한 크기 nanostructures의 다양 한 조립 채택 될 수 있습니다. 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals 4 반-회전의 짝수의 선형 연결 한 시퀀싱 비대칭 acDAO c64nt 타일에서 단련 됩니다. CDAO c64nt 및 cDAO-c84nt, 4, 5 반 회전의 홀수는 짝수의 intertile 거리 각각 구분 되는 원형 타일에서 무한 한 2D 격자를 두 가지 방법 있습니다. 전 동일; 정렬 모든 타일을 요구 한다. 후자는 헬리컬 축 따라 두 인접 타일의 얼굴의 교체가 필요합니다. 두 방법 모두 평면 nanoribbons; 생성 됩니다 타일 엄밀 하 고 평면 cDAO c64nt 같은 경우 타일 cDAO-c84nt, 4는 짝수의 intertile 연결 등 한 방향으로 곡선 경우 절반 회전 것 생성 하는 나노튜브, 반면 5는 홀수의 intertile 연결 반 회전의 제거 때문에 평면 nanoribbons를 생산할 예정 이다 곡률 바이어스 곡선된 타일의 대체 정렬에 의해 성장. 원형 타일에서 1d 및 2D DNA nanostructures의 성공적인 어셈블리 나타냅니다이 새로운 접근법의 몇 가지 장점: 안정성 및 선형 타일 위에 원형 타일, 비대칭 nanostructures의 어셈블리에 대 한 카이 랄 타일의 강성과 같은 적용 nanorings 및 nanoribbons, DNA 역학 및 분자 구조, 등등을 이해에 새로운 비전.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 원형 DNAs의 준비
- 더 정화 없이 직접 상업 회사에서 제공 하는 모든 선형 DNAs를 사용 합니다.
- DNA 샘플 튜브의 하단에 모든 DNA 알갱이 수집을 5 분 동안 5000 × g에서 원심 DNA를 분해 하 테 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
- 260에 마이크로 UV 분석기를 사용 하 여 각 ss DNA 솔루션에 대 한 "a" ng / µ L의 농도 측정 nm. "B" µ M를 "a" ng / µ L를 변환 b 다음3 × 10 = (분자량의 DNA 가닥) /. 10 µ M DNA 재고 솔루션을 만들기 위해 테 솔루션의 양을 조정 합니다.
- T4 DNA 리가 사용 하 여 연결 하는 5'-phosphorylated 선형 DNA 템플릿 ( 그림 1) c64nt, c74nt 및 상업 회사에서 직접 제공 하는 c84nt의 3'와 5' 끝.
- 5'-phosphorylated 선형 DNA 가닥 (3.5 µ M)과 그 해당 부 목 DNA 가닥 (4.5 µ M) 200 µ L PCR 테스트 튜브15에서 80 µ L TE 버퍼에 혼합. 95 ° C 물이 가득한 열린 열 병에 튜브를 품 어. 실험실 분위기에서 약 2-3 시간 동안 실내 온도 (25 ° C) 뜨거운 물 식혀.
- 10 x T4 버퍼 (660 mM Tris HCl, 66 mM MgCl2, 100mm DTT, 1mm ATP)의 10 µ L을 추가 하 고 T4 리가 (300 U / µ L) 100 µ L의 최종 볼륨을 혼합물에의 10 µ L 16 ° c.에 16 시간 동안 한 thermocycler에 혼합물을 품 어
참고: 위의 DNA 농도 반응 볼륨 ~ 100 µ L의 결 찰 높은 효율성과 올바른 올리고 단위체 cyclization의 높은 수익률에 대 한 최적화 됩니다. 실험 설계에 따라 동시에 결 찰 반응의 두 개 이상의 튜브를 실행 합니다. 결 찰 교체 단계 1.6에 대 한 대체 인큐베이션 절차는 25 ° c.에서 4 시간 - 부 화 후 5 minminutes 95 ° C 물에 T4 리가 비활성화. 얼음 물 목욕 튜브 전송 그리고 냉각 5 분 동안 품 어.
- 10 µ L의 Exonuclease 나 버퍼링 x 10과 Exonuclease의 10 µ L 추가 나 (5 U / µ L) 담금질된 혼합물에 및 선택적으로 나머지 선형 DNAs를 소화 하 고 circularized DNAs를 그대로 30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
- 페이지 젤을 변성 시키기 10%를 준비 합니다.
- 증기 두건에서 페이지 젤을 준비할 때 고무 장갑 및 고글을 착용. 6.67 mL의 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1), 10의 2 개 mL를 추가 x TAE· Mg 버퍼 (40 m m Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 8.4 g의 요소 (7 M)와 이온된 물 40 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 최종 볼륨을.
주의: 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1) 솔루션은 독성. - Tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L을 추가 하 고 40 mL를 염화 persulfate (AP, 10 %w / v)의 100 µ L 튜브 전송 되기 전에 젤 솔루션 전기 시스템을 즉시. 1.5 m m 두께 10-잘 빗을 삽입 합니다. 젤 솔루션 경화 될 때까지 20 분 이상 기다립니다.
- 85 × 80 × 1.5 m m의 젤 80 V의 정 전압 설정3 (폭 × 높이 × 두께). 1 x TAE· 추가 전기 시스템 및 prerun 10 V/cm에서 20 분 동안 젤 Mg 버퍼입니다.
- 증기 두건에서 페이지 젤을 준비할 때 고무 장갑 및 고글을 착용. 6.67 mL의 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1), 10의 2 개 mL를 추가 x TAE· Mg 버퍼 (40 m m Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 8.4 g의 요소 (7 M)와 이온된 물 40 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 최종 볼륨을.
- 95에서 단계 1.8에서 PCR 테스트 튜브를 넣어 ° C 물 Exonuclease 비활성화를 5 분에 대 한 나. 그런 다음 얼음 물 목욕 튜브를 전송 하 고 또 다른 5 분 동안 품 어.
- 140 µ L의 최종 볼륨을 튜브에 formamide의 20 µ L을 추가 하 고 솔루션을 혼합. 잘 7-9 16-20 µ L 각 젤와 동등 하 게 변성 페이지 젤 웰 스에 솔루션을 배포 합니다. 염료 (0.05 %bromophenol 블루, 0.05% 자일 렌 cyanol FF, 60% 글리세롤, 10 mM Tris HCl, 60 m EDTA, pH 7.6 m)와 해당 전조 선형 DNA의 8 µ L 로드의 믹스 2 µ L (10 µ M) 참조에 대 한 별도 잘에 혼합물을 주입 하는 고.
참고: formamide의 추가 페이지 젤 하단에 잘 침 몰을 위한 로드 솔루션의 밀도 증가 하 고 또한 일부 이중 연관을 해제 하려면 DNA 잔류물을 좌초. - 10 V/cm에서 약 2 시간을 위한 젤을 실행 하 고 자일 렌 cyanol FF에서 맨 눈으로 유리 접시의 2/3 위치에 때 실행을 중지.
- 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤을 가져가 라. 젤 형광 TLC (박막 크로마토그래피) 접시에 놓습니다. 면도날에 의해 대상 젤 밴드 차단으로 정확 하 게 UV 방사선 (그림 2)에 의해 숨겨진.
주의: UV 빛은 눈과 피부에 유해 이다.
참고: 254에서 UV 방사선에서 nm, DNA는 빛을 흡수 하 고 TLC 판에 그림자. 원형 DNA의 해당 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 달렸다. 그들은 수집 하는 경우 일부 소화 되지 않은 선형 DNAs 및 숨겨진된 대상 밴드를 둘러싸고 소량에 원치 않는 원형 DNAs 원형 DNA를 오염 됩니다. - 2.0 mL microcentrifuge 튜브로 젤 밴드를 전송 합니다. 공기 건조 또는 타격 젤 밴드 건조 하 고 붙여넣기로 젤 주걱 또는 일반된 유리 막대에 의해 매 시. 젤은 완전히 짓 눌린 원형 DNA의 높은 수율에 중요 붙여넣기로 다는 것을 확인 하십시오. 튜브에 젤 이온된 볼륨 물의 두 번 추가 하 고 하룻밤 실 온에서 튜브를 흔들어.
- 2.0 mL microcentrifuge 튜브에서 supernatants 수집 혼합물을 필터링 합니다. 작은 양의 이온된 물과 supernatants는 결합 하 여 다시 필터와 rinsing 하 여 모든 잔여 DNA를 복구 합니다.
- Eluent을 n butanol의 동일한 볼륨의 압축을 풉니다. 이 절차를 반복 하 여 수성 볼륨 약 200 µ L로 감소 된다.
- 500 µ L 절대 에탄올 (−20 ° C)의 추가 20 µ L의 DNA 강수량에 대 한 혼합물에 3 M NaOAc (pH 5.1). 30 분 동안 −20 ° C에 튜브를 저장 합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 튜브 원심, 삭제는 상쾌한. 나머지 DNA 침전 관에 약 100 µ L입니다.
- 튜브를 75% 에탄올 (−20 ° C)의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 −20 ° C에 저장. 다음 4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다. 나머지 DNA 침전은 다시 튜브에 약 100 µ L 솔루션입니다. 두 번 절차를 반복 합니다.
- 마지막 원심 분리 후 상쾌한 최대한 많이 삭제 합니다. 드라이 진공 집중으로 남아 있다.
- −20 ° c.에 튜브에 순화 된 원형 DNA를 저장
- 솔루션을 확인 하려면 10 µ M 원형 DNA 재고 단계 1.3 필요할 때에 따라 테 버퍼에서 원형 DNA를 resuspend.
2. 어셈블리 솔루션의 어 닐 링
- 한 냄비 어 닐 링에 대 한 각 타일 또는 nanostructural 어셈블리 솔루션 c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ c64nt, HJ-c84nt, 자 c84nt, cDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt, 및 acDAO-c64nt-E의 선형 및 원형 DNAs의 설계 된 세트를 준비 합니다.
- 각 어셈블리 솔루션에 대 한 10의 2 µ L 믹스 x TAE· Mg 버퍼, 선형 및 원형 가닥 같은 어 금 니 비율 및 0.5 µ M와 20 µ L. 마지막 볼륨 각 가닥의 최종 농도에 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼에 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L에서 어셈블리 솔루션 Anneal 한 95 ° C에서 25 ° c 이상 48 h 열 병.
- 2 단계 열 처리에 대 한 선형 및 원형 DNAs의 디자인 세트 cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E, 및 cDAO-c84nt-O의 2D 무한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.
- 10의 2 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 20 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L. 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.
- 각 물가 위한 0.25 µ M의 최종 농도에 함께 두 해당 하위 타일 솔루션의 10 µ L를 혼합 하 여 위의 4 개의 무한 한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다. 스텝 어 닐 링 하는 두 번째 격자에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 20 ° C, 총에서 약 24 시간 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 20 µ L 혼합물 anneal.
참고: 두 개의 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 각 2D 무한 격자에 대 한 두 번째 어 닐 링 단계에서.
- 2 단계 열 처리에 대 한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O의 두 유한 사각형 어셈블리의 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.
- 10의 1 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 10 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 0.5 µ L. 첫 번째 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.
- 32 (각 하위 타일 솔루션의 2 µ L) x ~ 15의 최종 농도 200 µ L PCR 테스트 튜브에 함께 혼합 하 여 각 유한 사각형 격자 어셈블리 솔루션을 준비 각 하위 타일과 64 µ L의 최종 볼륨에 대 한 nM. 2 어 닐 링 단계에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 총 24 시간 약 20 ° C, 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에 64 µ L 혼합물 anneal.
참고: 5 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 두 번째 어 닐 링 단계에서 각 유한 사각형 어셈블리에 대 한.
3. 기본 페이지 분석
- 10% 기본 페이지 준비 다음 단계 1.9 요소 구성 요소를 제외 하 고.
- C64bp 및 c84bp 컨트롤 샘플에 대 한 각 어셈블리 솔루션의 2 µ L와 별도로 염료 테 버퍼의 3 µ L 컨트롤로 로드의 1 µ L를 추가 합니다. 그림 3에 나열 된 다른 어셈블리의 각 각 어셈블리 솔루션의 1 µ L 및 염료 테 버퍼의 4 µ L 로드의 1 µ L를 추가 합니다.
- 젤을 위의 솔루션을 잘 주사. 참조에 대 한 별도 잘에 DNA 마커 (25-500 bp)의 5 µ L를 추가 합니다.
- 얼음 물 목욕에서 10 V/cm에서 약 4 시간 동안 젤을 실행 합니다. 크 실 렌 cyanol ff로 유리 접시 밖으로 실행 됩니다.
- 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤 하 고 30 분 동안 핵 산 젤 얼룩의 10 µ L로 이온 물 100ml에 담가.
주의: 핵 산 젤 얼룩 솔루션 독성이 있다. - 자외선 이미징 시스템에서 젤을 관찰 하 고 얼룩진된 젤 (그림 3)의 사진의 찍을.
4입니다. 유한 격자의 정화
- 기본 2 %agarose 젤 전기 이동 법 정화 유한 격자의 준비.
- Agarose 분말, 10의 5 mL의 1 g 믹스 x TBE· Mg 버퍼 (89 m m Tris, 89 m m 붕, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 핵 산의 2 µ L 얼룩 및 250 mL 삼각형 병에 이온된 수의 47.5 mL 젤. 작고 조밀한 거품 될 때까지 혼합물 삶아. 50 mL의 총 볼륨을 2 %agarose 농도 병에 온수를 추가 합니다.
- 두꺼운 장갑을 착용 한다. 1 c m3 (폭 × 길이 × 두께) x 10 x 7의 플라스틱 젤 상자에 젤 솔루션을 붓는 다. 1.5 m m 두께 12-잘 젤 빗을 삽입 합니다. 실내 온도에 냉각 젤을 기다립니다. 필요한 경우 4 ℃ 냉장고에 젤을 넣어.
주의: 끓는 솔루션은 매우 뜨거운 때문에 알고 있어야 합니다. - 0.5 x TBE· 추가 전기 시스템에 Mg 버퍼입니다. 5 V/cm 50 V의 정 전압에서 얼음 물 탕에서 20 분에 젤을 prerun.
- 각 agarose 젤에 2.3 단계에서 잘 준비 하는 유한 격자 솔루션의 20 µ L를 주사 하 고 잘는 별도의 DNA 마커 (100-3000 bp)의 5 µ L를 추가 합니다. 얼음 물 목욕에서 5 V/cm에서 2 h를 위한 젤을 실행 합니다.
- 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 컷 대상 젤 UV 빛 및 조각으로 조각 잘 고를 필터 열8로 짓 눌린된 젤 1000 bp 마커 비슷합니다 위치와 밴드입니다.
- 2000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 열을 원심 열을 통해 샘플 솔루션을 추출 합니다. AFM 화상 진 찰에 대 한 솔루션을 수집 합니다.
- 나무 못 강 수에 의해 유한 격자를 정화.
- 준비 단계에서 유한 격자 솔루션의 믹스 50 µ L를 동등한 양의 15 %PEG8000 (w/v)와 2.3 버퍼 (20 m m Mg(Ac)2, 5mm 트리 스, 1 mM EDTA와 505 mM NaCl)22. 30 분 동안 4 ° C에서 18000 × g 에서 솔루션 원심
- 제거는 상쾌한 고 못 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 원심 분리를 반복 합니다.
- 제거한 후에 상쾌한, 분해 1에서 펠 릿 x TAE· AFM 화상 진 찰에 대 한 Mg 버퍼입니다.
참고: 정화는 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 AFM 이미지와 다른 응용 프로그램에 대 한 c84nt-O 유한 격자 필요 합니다. 수익률이 너무 낮으면, 원심 분리 속도 증가. 제품 만큼 순수 하지 않으면 4.2.2 단계를 반복 합니다.
5. AFM 이미지
- C64nt 나노와이어, c84nt 나노와이어, acDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-E(O), 및 cDAO-c84nt-E(O), 무한 한 2D 격자 갓 쪼개진된 운 모 표면에 단련 된 샘플의 2 μ를 입금. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 두 번의 이온된 수 100 µ L로 표면 세척 하 고 압축 공기에 의해 건조.
- 탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 공기의 무한 한 DNA 격자 들의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5 ~ 5 µ m, 512 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 3.5 hz (그림 4).
- 5 × 6의 유한 DNA 격자 cDAO-c64nt-O와 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O 입금 1의 80 µ L x TAE· Mg 갓 쪼개진된 운 모 표면에 버퍼입니다. 다음 버퍼에 한정 된 샘플의 5 µ L를 추가 합니다. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 1의 또 다른 50 µ L를 추가 x TAE· AFM 프로브에 Mg 버퍼입니다.
- 탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 액체에서 유한 DNA 격자의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5-1 µ m, 256 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 1.5 hz (그림 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
원형 DNA 젤 섬유23,,2425원형 DNA 내부 기 공에 침투 하기 때문에 페이지 (그림 2)을 변성 시키기 및 지진의 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 이동 합니다. 올리고 단위체 cyclization에 대 한 올바른 결 찰 반응 효율 기판 시퀀스 및 농도, 반응 온도, 시간, 등등에 따라 달라 집니다. 선구자 농도 선형 DNA는 약 3.5 μ M, c64nt (또는 c84nt)의 cyclization 제품에서 충분히 높은 고이 프로토콜에 전조 참조 될 수 있습니다 직접 죽어 없이 UV 빛에서 TLC 판에 있는 악대로 그림자. 원형 DNA의 밴드 막연 한 또는 보이지 않는, 결 찰 반응 또는 훨씬 낮은 제품 수율의 실패를 나타내는 경우. 가끔 참조 하는 올바른 올리고 단위체 반지 제외 추가 올리고-이합체 반지 선형 선구자 밴드 위에 두 밴드 있다. 그냥 내버려 둬 더 높은 밴드와 낮은 사람을 수집 합니다. 순화 된 원형 DNA 제품 진공 건조 후 튜브에 백색 분말으로 볼 수 있습니다. 변성 페이지를 제외한 DNA 순도 또한 UV 분석기로 측정할 수 있습니다. DNA의 흡수 피크는 260 nm. DNA의 순수성에 대 한 두 가지 표준 기준이 있으며 1.8에서 280 nm/260 nm의 흡수 비율 2.0-2.2의 범위에 일반적으로 280 nm/230 nm의. 경우 위의 두 비율 표준 값에서 이탈, 남아 다음 단계 1.18 1.20 여 다시 추출 해야 합니다. C64nt와 c84nt 모노 머 올리고 올바른-cyclization에 대 한 수익률이이 프로토콜에 따라 30-60%의 범위에서 측정 됩니다.
모티브의 안정성, 순도, 강성, 모노 머 또는 폴리머, 어셈블리 모드에 대 한 정보를 많이 제공 하는 기본 페이지 분석 등 (그림 3). C64bp, HJ-c64nt, aHJ c64nt, cDAO-c64nt, 및 acDAO-c64nt c64nt 어셈블리 가족 대표 하는 각 어셈블리에 대 한 한 명확 하 고 깨끗 한 밴드를가지고 그들은 안정적인 단위체 모티브. 동안 HJ-c84nt, 자-c84nt, 및 cDAO c84nt 타일의 c84nt 어셈블리 가족 대상 단위체 모티브 제외한 사소한 부산물을 나타내는 그들의 주요 밴드 주위 얼룩 있다. 잘못 된 동료의 작은 부산물에 높은 수율으로 우수한 cDAO-c84nt-O (E) 격자 조립 될 수 있다. 명확 하 고 깨끗 한 전기 영동 이미지를 얻으려면, 로드 볼륨 한다 더 이상 10 µ L 고 DNA의 수량 이어야 0.01 ~ 0.02 µ g/mL.
실험의 성공은 마지막으로 1d 및 2D DNA nanostructures AFM (그림 4 및 그림 5)에 의해 촬영에 의해 평가 됩니다. 각 어셈블리는 나노 와이어, 나노튜브, nanospirals, nanoribbons, 등등과 같은 마이크로 미터 규모 자체 형태학 기능이 있습니다. 또한, 그들의 이론적 원형 타일 크기를 나노미터 스케일의 DNA 어셈블리의 상세한 텍스처 상관 되며 조직 모드 아주 잘 각각 성공 하 고 올바른 어셈블리의 키. 따라서, 파노라마와 고해상도 AFM 이미지 마이크로미터와 나노미터 스케일에 가져와야 합니다. AFM 방법 및 프로브 선택은 중요 한 높은-품질의 AFM 이미지. 스캔 포스 50 pN26만큼 작은 조정 되어야 한다. 스캔 포스 너무 큰 경우에, 그것은 DNA nanostructural 패턴을 손상 것입니다. 환경 청결 액체에서 깨끗 하 고 아름 다운 고해상도 AFM 이미지를 또 다른 키 매개 변수입니다. 모든 버퍼; 0.22 μ m 필터로 필터링 해야 합니다. 프로브 홀더 및 핀셋을 세제로 세척 하 고 이온을 제거 된 물으로 씻어 서 해야 합니다. 환경 미 립 자 파편에 의해, 오염 하는 경우 프로브 팁은 손상 되거나 따라서 AFM 이미지의 품질에 영향을 미치는 버퍼에 입자에 의해 지기 것 이다.
그림 1 . 원형 DNA의 합성. 흐름 다이어그램 파란색에서 긴 5'-phosphorylated 선형 oligonucleotide 원형 DNA 분자를 진화 하는 방법을 나타냅니다. 두 개의 짧은 빨간색 가닥 부 목 oligonucleotides를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 죽어 없이 자외선에서 DNA cyclization 제품의 변성 시키기 페이지 사진. 전조 선형 64nt DNA 밴드 (c64nt) DNA 같은 수평에서 9 악대로 다른 9 차선에서 레벨 표시 맨 왼쪽 차선에 원형 64nt의 cyclization 제품입니다. C64nt의 9 밴드 원형 DNAs 추상화에 대 한 차단 될 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. 원형 타일의 죽어가는 도식 더블 헬리컬 모델 후 기본 페이지 사진. 두 고분자 c64nt 나노와이어와 나노와이어 c84nt의 그들의 간단한 접는 단위 세포, 두 위의 점 들을 정렬 하 여 표시 됩니다 및 각 단위 셀 아래 단위 세포의 무한 한 맞춤 수직 최대 나타내고 아래로, 사이 동등한 거리 쌍 신 회로 형태 나노 와이어를. C64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ c64nt, HJ-c84nt, 및 자-c84nt에서의 단위체 원형 타일 A) 있고 그들의 반지에서 아무 튀어나온 돌출부 cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, 및 cDAO-c84nt에 B)는 둘 다 무뚝뚝한 끝난 10 bp 돌출부 각각 있습니다. 시퀀스 테이블의 DNA 시퀀스를 참조 하십시오. 이 그림은 이전에 게시 그림17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. 전형적인 1d 및 2D 무한 DNA 어셈블리의 AFM 이미지 스캔 공기에서. A) c64nt 나노와이어, B) 무한 한 acDAO-c64nt-E, C) 무한 cDAO-c64nt-E, D) 무한 cDAO-c64nt-O, E) 무한 cDAO-c84nt-E 및 F) 무한 cDAO-c84nt-O 스티커 끝 응집력에 의해 단련. 이러한 AFM 이미지에서 모든 텍스처 세부 타일 크기 및 조직 모드 아주 잘 있습니다. 시퀀스 테이블의 DNA 시퀀스를 참조 하십시오. 이 그림은 이전에 게시 그림17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 액체에서 유한 사각형 어셈블리의 AFM 이미지 스캔. A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O 32 cDAO c64nt 하위 타일, 그리고 B) 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O로 구성 되어의 유한 사각형 어셈블리는 12 cDAO-c74nt 및 20 cDAO c84nt 서브 타일의 구성. 시퀀스 테이블의 DNA 시퀀스를 참조 하십시오. 이 그림은 이전에 게시 그림17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
테이블의 DNA 시퀀스. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
작은 원형 DNA 분자의 합성 및 DNA nanostructures의 조립에이 기사 초점에 프로토콜. 무작위로 순서가 DNA 디자인의 대부분은이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 원형 DNAs의 순수성이 DNA 어셈블리의 성공을 위해 중요 합니다. 5'-phosphorylated 선형 DNA;의 농도 낮추는 방법으로 cyclization의 생산 수율을 향상 시킬 수 있습니다. 그러나,이 원형 DNAs의 동일한 금액을 생산 하기 위해 작업 부하를 증가 합니다. 부 목 DNA 물가의 길이 정확한 결 찰 반응에도 영향을, 약 20 뉴클레오티드 되도록 최적화 되어 c64nt 및 c84nt에 대 한 긴.
마그네슘 양이온의 적절 한 농도 (예., 12.5 m m) 동안 솔루션 그리고 어셈블리 형성과 DNA nanostructures의 유지 보수에 대 한 매우 중요 하다. 따라서, 12.5 m m의 마그네슘 양이온 농도의 어 닐 링 과정 동안 항상 유지, 기본 페이지, agarose 젤 전기 이동 법 및 말뚝 버퍼 원심 purifications, AFM 이미지, 등.
5 × 6 cDAO-c64nt-O 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O의 유한 사각형 어셈블리, agarose 젤 정화 영향을 주지 않습니다 텍스처 세부 동안 못 버퍼 원심 분리 정화 harms에서 DNA nanostructures의 텍스처 세부 정보는 고해상도 AFM 이미지입니다.
원형 타일의 강성, 그것은 훨씬 쉽게 잘 조직 생산 하 고 비록 선형 타일 및 기능은 종이 접기9,11, 원형 모듈 보다 크기가 큰 단일 결정 2D 격자 및 안정성에 대 한 혜택을 받을합니다 추가 작업은 합성 하 고 원형 DNA 분자를 정화 필요 합니다. 동일한 코어 구조 단 하나 원형 dna, 많은 원형 모듈 다른 돌출부;으로 생성 될 수 있습니다. 돌출부의 특정 끈끈한 끝 cohesions에 의하여 유한 nanostructures 건축 될 수 있다; 이 전략에는 작업 및 유한 nanostructures의 비용 감소 시킨다. 원형 DNA nanostructures의 중요 한 장점 중 하나는 DNA 분자의 2 차 및 3 차 구조의 해상도 단일 결정 격자의 텍스처 세부 사항을 할러데이 접합 등 그들의 핵심 요소입니다. 1d, 2D 및 3D nanostructures 원형 모듈 및 생물학, 의학, 및 나노 공학에 그들의 잠재적인 응용 프로그램에서 만들어진 DNA 나노기술의 새로운 가족 구성원 미래에 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 NSFC (보조금 번호 91753134 및 21571100), 그리고 국가 열쇠 실험실의 Bioelectronics의 동남 대학에서 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al.
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
