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Methodenartikel

Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine

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DOI:

10.3791/58746

⸱

8. Februar 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Regensburg University, 2Department of Biology, Ludwig-Maximilians University of Munich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt das Klonen einer Ustilago Maydis Trojanisches Pferd Belastung für die in-situ Lieferung von sekretierten Proteinen, Mais in drei verschiedene Arten von Mais Gewebe.

Zusammenfassung

Von Homers Trojanische Pferd Mythos inspiriert, haben wir den Mais Erreger Ustilago Maydis sekretierten Proteine in den Mais Apoplast schönem in-vivo phänotypische Analyse liefern entwickelt. Diese Methode setzt nicht auf Mais Transformation aber beutet mikrobielle Genetik und sekretorischen Funktionen von Krankheitserregern. Hierin, ermöglicht es, dass Inspektion von in-vivo sekretierten Proteine mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung bei verschiedenen Arten von Infektion Websites und Gewebe geliefert. Die Trojanische Pferd-Strategie kann genutzt werden, um vorübergehend Maize Verlustfunktion-Phänotypen, um funktionell charakterisieren Protein Domänen, aus Zielprotein Auswirkungen zu analysieren oder zu onside Protein Überdosierung, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für studieren ergänzen Protein-Studien in der Mais-Ernte-System. Dieses Werk enthält eine genaue Protokoll über wie einen Trojanisches Pferd Stamm, gefolgt von standardisierten Infektion Protokolle dieser Methode zu drei verschiedenen Mais Gewebetypen zu generieren.

Einleitung

Der biotrophe Erreger Ustilago Maydis ist der Erreger der Mais Smut Krankheit1. Er infiziert alle oberirdischen Teile von Mais, was zu großen Tumoren, die Melanized, schwarze Sporen enthalten. Auf globaler Ebene dürfte U. Maydis verursachen einen jährlichen Verlust von rund 2 % des Mais Ertrag, während Tumoren als in Mexiko eine gastronomische Delikatesse geschätzt werden. Pflanze-Infektion wird durch eine Appressorium eingeleitet, die Zellwand Lysiereinrichtung Enzyme, die erste Schicht von Mais epidermalen Zellen durchdringen sondert. Von einer Primärinfektion Site U. Maydis wächst intrazellulär und intercellularly, ein bis zwei Zellen eindringen "layers" jeden Tag1,2. Erfolgreiche Infektion Ergebnisse im Werk Hypertrophie, die verwandelt sich in sichtbaren Tumoren auf fünf Tage post Infektion1,3,4. In allen Phasen der Infektion Biomembran pilzliche Hyphen die Pflanze Zytoplasma-Membran ohne direkten Kontakt zum Host Zytoplasma1,2. Der enge Apoplasmic Raum zwischen den infizierenden Hyphen und der Plasmamembran Pflanze gilt als der Host/Erreger interaktive Website mit dem Namen der biotrophe Wechselwirkungszone. Um das angeborene Immunsystem der Pflanze zu überwinden, sondert U. Maydis ein Array von Effektor-Proteine in der biotrophe Interaktion Zone1. Einige Effektoren sind von Pflanzenzellen aufgenommen, während andere in der biotrophe Interaktion Zone5,6,7,8bleiben. Ein Apoplasten Effektor ist UmPit2, die Interaktion mit Apoplasten Mais Proteasen die Freisetzung der Signalisierung Peptid ZmZIP1 aus ZmPROZIP durch Apoplasten Protease-Aktivität9,10zu verhindern.

In den letzten Jahrzehnten U. Maydis wurde nicht nur ein Modell für pilzartige Genetik in Pflanze-Pathogen Interaktion, sondern auch ein wertvolles Instrument in der Biotechnologie aufgrund einer wohlverstandenen Lebenszyklus, genetische Erreichbarkeit und heterologen Expression von abgesondert Proteine11,12,13. Signale für sowohl konventionelle und unkonventionelle Protein Sekretion wurden ermöglicht die Kontrolle der posttranslationale Modifikationen14ermittelt. Vor kurzem, war wie ein Trojanisches Pferd-Werkzeug, um kleine, studieren abgesondert Mais Proteine in Situ15 U. Maydis eingesetzt. Trojanisches Pferd Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um die Funktion des kleinen, sekretierten Proteins ZmMAC1 zu analysieren, die in der Anthere Entwicklung beteiligt ist. ZmMAC1 induziert die periclinal Division von pluripotenten Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation der neugebildeten Zellen15. Nach der gleichen Methode wurde die biologische Funktion des Mais Schäden verbundenen Peptids ZmZIP1 offenbart. U. Maydis sezernierenden Mais führte zu ZmZIP1 beeinträchtigt Tumor Bildung10. So, das Trojanische Pferd Ansatz stellt eine wertvolle alternative Route zur Protein in Situ Untersuchungen mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung, der auch nicht erfordern Generation von stabilen Mais Transformation Linien noch Gewebe Infiltration mit heterologously ausgedrückt und gereinigten Proteinen. Die Trojanische Pferd-Strategie ermöglicht insbesondere die Sekretion von jedem heterologen Protein in den Mais Apoplasten und direkter Vergleich von infizierten im Vergleich zu nicht-infizierten Pflanzenzellen innerhalb der gleichen Gewebe.

Dieses Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung einer U. Maydis Trojanisches Pferd Belastung um ein Protein des Interesses zu studieren. Es enthält weitere präzise Informationen über Infektion Verfahren von drei verschiedenen Mais Gewebetypen (Erwachsene Blätter, Quasten und Ohren) mit U. Maydis, eine Voraussetzung für das Studium der raumzeitlichen Infektion Fortschreiten und Protein-Funktion in diesen Zielgewebe. Keine weiteren Spezifikationen sind auf Mais gen-Amplifikation und mikroskopische bildgebende Verfahren, da diese Schritte gezielt und Instrument-abhängig sind. Somit ist dieses Protokoll an erfahrene Anwender von standard molekularbiologische Techniken gerichtet.

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Protokoll

(1) Bau einer U. Maydis Trojanisches Pferd

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

  1. Ein Gen des Interesses von Mais cDNA mittels Gen-spezifische Primer und ein Lektorat DNA-Polymerase zu verstärken. Klonen Sie das Hauptprodukt der PCR zu und verwandeln Sie das Konstrukt in E. Coli Anweisungen des Verkäufers Plasmid. Stellen Sie sicher das richtige gen Interesse Sequenz von Sanger-Sequenzierung vor für die nächsten Schritte zum Klonen zu verwenden.
    Hinweis: PCR-Spezifikationen durch Primer Sequenz Besonderheiten und optimale DNA-Polymerase Reaktionsbedingungen optimiert werden müssen.
  2. Design-Primer, die Maize gen von Interesse ohne die Sequenz Codierung ein Signalpeptid (SP) zu verstärken.
  3. 5´ Ende der rückwärts-Primer mit RSIATA-Motiv und einem Ncozu verlängern ich schneiden vor Ort (Tabelle 1).
  4. Verstärken Sie interessierende Maize gen mit einem Lektorat DNA-Polymerase mit Hilfe der PCR-Konstrukt in 1.1 als PCR Vorlage generiert.
  5. Doppel-Digest das PCR-Produkt und die U. Maydis Transformation Plasmid, p123-pUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, mit Xbaich und Nco I. reinigen die verdaute PCR-Produkt und Plasmid.
  6. Verbinden Sie das verdaute PCR-Produkt in der p123-pUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha -Vorlage mit T4 DNA-Ligase den Anweisungen des Herstellers. E. Coli der Ligatur Produkt verwandeln und stellen Sie sicher das richtige gen Interesse Sequenz von Sanger Sequenzierung.
  7. Linearisieren der p123-pUmpit2-SpUmpit2Zm -gen von Interesse-mCherry-Ha mit Restriktionsenzym Sspich und Transformation von DNA in der Solopathogenic U. Maydis Stamm SG20016. Isolieren Sie U. Maydis Transformanten Carboxin Auswahl und bestätigen Sie, dass isolierte Transformanten von Southern blot Analyse16.
    Hinweis: Für jedes Protein des Interesses, mindestens drei unabhängige U. Maydis Transformanten sollte isoliert und analysiert werden, um Nebenwirkungen Phänotyp von zufälligen Hintergrund Mutationen zu schätzen.

(2) Nährmedien

  1. Bereiten Sie YEPSlight flüssige Mittel16: 1,0 % (w/V) Hefeextrakt, 0,4 % (w/V) Bacto-Pepton und 0,4 % (w/V) Saccharose. Lösen Sie alle Komponenten in DdH2O und Autoklaven bei 121 ° C für 15 min; Autoklavieren bei einer höheren Temperatur über einen längeren Zeitraum hinweg oder wiederholt würde verringern die Qualität des Mediums.
  2. Kartoffel-Dextrose-Agar (PD-Agar)20vorbereiten: 3,9 % (w/V) Kartoffel-Dextrose-Agar und 1,0 % (w/V) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Alle Komponenten direkt in der Flasche für Autoklavieren und DdH2O sowie eine magnetische Stir Bar. Autoklaven bei 121 ° C für 15 min; Autoklavieren bei einer höheren Temperatur über einen längeren Zeitraum hinweg oder wiederholt würde verringern die Qualität des Mediums.
  3. PD-Holzkohle Agar20vorbereiten: 3,9 % (w/V)-Kartoffel-Dextrose-Agar, 1 % (w/V) Kohle und 1,0 % (V/V) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Alle Komponenten direkt in der Flasche für Autoklavieren und DdH2O sowie eine magnetische Stir Bar. Autoklaven bei 121 ° C für 15 min; Autoklavieren bei einer höheren Temperatur über einen längeren Zeitraum hinweg oder wiederholt würde verringern die Qualität des Mediums.

3. Anlage Infektion

  1. Analysieren der Mais Zellteilung als Reaktion auf Trojaner geliefert Protein (z. B. Mikroskopie-basierte Zellzählung) im Voraus. U. Maydis -induzierte Mais Zellproliferation und anschließende Tumorbildung beginnt etwa 4-5 Tage Post Infektion. Quantitative Krankheit Bewertungen sind abhängig von der Gewebe und von 6 bis 14 Tage Post-Infektion durchgeführt werden.
    Hinweis: Unterschiedliche Sorten Maize zeigen verschiedene Ebenen der Infektanfälligkeit U. Maydis . Mais cvs. W23, A188, Gaspe Feuerstein, frühen Golden Bantam oder Va35 zeigen Anfälligkeit gegenüber dem Erreger und sind somit geeignet für Trojanisches Pferd Studien.
  2. Vorbereitung des Inokulums U. maydis
    1. Enthalten Sie, den Stammvater Stamm SG200 als Negativkontrolle in allen Trojaner versuchen um Nebenwirkungen auf die Infektion mit den transgenen Sorte zu schätzen. Hier verwenden Sie eine U. Maydis Stamm mit dem Ausdruck einer nicht abgesondert Version des Proteins des Interesses als Negativkontrolle. Jedoch möglicherweise die Vorläuferzellen Belastung aus Gründen der Praktikabilität (z. B. größere Vorführungen), die Wahl einfacher Steuerung.
    2. Abzuschätzen Sie vor Beginn des Experiments, welche Mengen an Infektion Kultur erforderlich sind. Beachte bitte, dass die Infektion von jeder Pflanze 1 bis 1,5 mL Suspension U. Maydis erfordert Mais Gewebetyp abhängig.
      Hinweis: Etwa 1 mL einer Übernacht-Kultur ist ausreichend für die Verdünnung auf einem OD-600 von 0,2 in 20 mL YEPSLicht Medium, und 25 mL einer U. Maydis Kultur mit einem OD-600 von 0,8-1,0 reichen für eine Infektion von 13-16 Pflanzen.
    3. Kratzer U. Maydis aus einem PD-Agar Platte mit einer sterilen Pasteurpipette, impfen in 5 mL Medium YEPSLicht und lassen die Kultur wachsen mit konstanter Schütteln bei 200 u/min für 16 h bei 28 ° C.
    4. Untersuchen Sie vor der Infektion U. Maydis Inokulation Kultur von standard Lichtmikroskopie für korrektes Wachstum und bakterielle Kontamination bei 400 X Vergrößerung.
      Hinweis: In eine geeignete Kultur ist nur die zigarrenförmige Pilz sichtbar (Abbildung 2).
    5. Mischen Sie 900 µL frische YEPSLicht mit 100 µL der Nacht Kultur und Messen Sie die OD600 mit YEPSLicht Medium als eine leere in der Spektralphotometer-Analyse.
    6. Verdünnen die Nacht Kultur mit frischen YEPSLicht Medium zu einem OD-600 von 0,2 und lassen die Kultur wachsen bei 28 ° C mit konstanter Schütteln bei 200 u/min bis erreichen der Mitte Log Wachstumsphase durch ein OD signalisiert600 nm von 0,8-1,0.
      Hinweis: U. Maydis Zellen duplizieren alle 2 h unter diesen Bedingungen, damit die gewünschte OD600 nach 4-5h Anbau erreicht ist.
    7. Ernte der Zellen bei OD600 von 0,8-1,0 von Spinnen bei 3.000 X g für 10 min und den Überstand verwerfen.
    8. Waschen Sie die Zelle Pellet einmal mit DdH2O. Fügen Sie zu diesem Zweck einem Kulturvolumen von DdH2O, Spin mit 3000 X g für 10 min und entsorgen des Überstands.
    9. Aufschwemmen der Zelle Pellet sorgfältig in DdH2O mit einer 20-mL Glaspipette einstellen damit die endgültige OD600 3.0 (für einen Trojaner-Assay) bis 1,0 (für Krankheit Rating).
  3. Überprüfung des Trojanischen Pferdes: Planta Sekretion des Mais Fusionsproteins
    1. Maiskeimlinge mit einem Trojanischen Pferd Belastung17zu infizieren.
    2. Durchführen Sie mikroskopische Darstellung der infizierten Sämlinge auf 2-3 Tage Post Infektion mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Zu diesem Zweck Verbrauchsteuern Sie ein rechteckiges Stück des Blattes 1 cm unterhalb der Injektion, legen Sie die Probe auf einen Objektträger und Tropfen Sie einen DdH2O. Um mCherry Schmelzverfahren Protein zu visualisieren, begeistern Probe bei λ = 561 nm und Rekord Emission bei λ = 580-630 nm.
  4. Infektion der Erwachsenen Maisblätter
    1. Maispflanzen auf die Bühne der Erwachsenen Blätter zu kultivieren (wenn mindestens Blatt 7 wächst innerhalb der Stiel).
      Hinweis: Diese Stufe wird nach vier Wochen nach Aussaat unter Gewächshausbedingungen von 28 ° C Tag/10 h, 14 h, 22 ° C-Nacht-Rhythmus mit CV W23 erreicht. Dauer eines solchen Praktikums mit den Mais Sorte und Gewächshaus.
    2. Übertragen U. Maydis Kultur (siehe 3.2.9) in eine 3-mL-Spritze mit einer Injektionsnadel 20 x 1.
    3. Drücken Sie den Stiel vorsichtig, das Meristem-Gewebe in den Stiel zu lokalisieren. Die Basis der Meristem kann durch den Übergang von schwerer Stiel weicher Gewebe unterschieden werden.
    4. Markieren Sie das Meristem auf dem Halm mit einem Stift.
    5. 1,5 mL U. Maydis Kultur 1 cm oberhalb des Shooting Meristem oder Blütenstand Meristem zu injizieren.
    6. Bewerten Sie Krankheitssymptome bei 6 und 12 Tage Post Infektion.
  5. Infektion der Quasten
    1. Wachsen Sie Maize Pflanzen bis zum Erreichen der Quaste-Bühne.
      Hinweis: Eine detaillierte Zeitleiste auf die Anthere und Quaste Entwicklung in Mais CV W23 war zuvor beschriebenen1819. Quasten mit Pre meiotische Antheren sind sehr anfällig für Infektionen U. Maydis ; in den Mais CV W23 sind Quasten die Größe von 4 bis 7 cm.
    2. Drücken Sie den Stiel vorsichtig um die Quaste in den Stamm zu lokalisieren.
    3. Markieren Sie die Spitze und der Basis der Quaste am Stiel mit einem Stift.
    4. Übertragen U. Maydis Kultur (siehe 3.2.9) in eine 3-mL-Spritze mit einer Injektionsnadel 20 x 1.
    5. 1,5 mL des Inokulums um die Quaste zu injizieren. Um gleichmäßige Verteilung des Inokulums sicherzustellen, platzieren Sie langsam 0,5 mL an der Spitze, Mittelteil und die Basis von der Rispe mit dem Stift markiert.
    6. Bewerten Sie Krankheitssymptome mit 10 Tagen Post Infektion.
  6. Infektion der Ohren
    Hinweis:     Ohr Gewebeentwicklung unterscheidet sich in unterschiedliche Sorten Mais und Gewächshausbedingungen und muss sorgfältig beobachtet werden, vor der Inokulation. Ohren ab, Seiden entwachsen sind sehr anfällig für Infektionen U. Maydis .
    1. Übertragen U. Maydis Kultur (siehe 3.2.9) in eine 3 mL Spritze mit einer Injektionsnadel 20 x 1.
    2. Injizieren Sie die Anstechnadel so tief wie möglich in den Raum zwischen die Schale Blätter ohne Verletzung des Ohres.
    3. Version 1, 5 mL des Inokulums um das Ohr herum.
    4. Entfernen Sie die Spritze und Nadel und sorgfältig massage der Cob um U. Maydis Lösung gleichmäßig zu verteilen.
    5. Bewerten Sie Krankheitssymptome mit 14 Tage Post-Infektion.
  7. Lebensfähigkeit des Inokulums U. Maydis bestätigen
    1. 10 µL des Inokulums auf eine PD Holzkohle Nährbodenplatte fallen und 2 Tage bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Wenn die jeweiligen U. Maydis Kultur ist in der Lage, Form Filamente, flauschigen, weißen Myzel wird sichtbar (Abbildung 5)

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Ergebnisse

Konstrukte für U. Maydis Trojanisches Pferd Experimente werden in das Plasmid p123-pUmpit2-SpUmpit2-gen von Interesse-mCherry-Hageklont. Der Maize gen von Interesse ist, ein mCherry -Fluoreszenz-Reporter und ein Epitop HAverschmolzen-Tag. Der Ausdruck des Fusionsproteins ist unter Kontrolle des U. Maydis Umpit2 Promotors, speziell bei Infektion

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Diskussion

Moderne Pflanzenforschung erfordert Protokolle für molekulare Analyse auf genetische und Proteingehalt. Genetischen Zugänglichkeit über Transformation ist nicht verfügbar oder ineffizient und zeitaufwendig für die meisten Kulturarten wie Mais. Darüber hinaus sind zuverlässige genetische Tools wie Veranstalter Reporter Systeme rar, das macht es schwierig, in-situ Proteinfunktion raumzeitlichen hochauflösend an unterschiedliche Gewebe Standorten zu studieren. Apoplasten Proteine können durch Infiltration von heter...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchte Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella und Armin Hildebrand danken für die Bereitstellung von Raum und Pflanze Labormaterial. Das ursprüngliche Werk über die Trojaner-Methode wurde von einer Leopoldina postdoc Fellowship und NSF Projekt IOS13-39229 unterstützt. Die in diesem Artikel vorgestellte Arbeit wurde von SFB924 (Projekte A14 und B14) der DFG unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL Spritze B. Braun4606027V
23 G x 1 1/4 InjektionsnadelB. Braun4657640
Bacto Pepton BD211677
cDNA aus Maisaus Maisgewebe, das das Gen der Zwischenreste exprimiert
HolzkohleSigma-Aldrich05105
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskopmit lokal verfügbarer Ausrüstung
Küvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)Sarstedt67742
Inkubator-Schüttler auf 28 &°; C, 200 U/minmit lokal verfügbarer Ausrüstung
Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerungmit lokal verfügbarer Ausrüstung
Nco INEBR0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Habitte kontaktieren Sie den entsprechenden Autor 
Pasteurpipette (Glas, lange Spitze)VWR14673-043
pCR-Blunt-II-TOPOThermo Fisher ScientificK280002kann gegen andere grundlegende Klonierungsvektoren wie pENTR oder pJET
Kartoffel-Dextrose-AgarVWR90000-745
Sharpie-Stiftmit lokal verfügbarer Ausrüstung
Spektralphotometermit lokal verfügbarer Ausrüstung
Ssp INEBR0132
SaccharoseSigma-AldrichS0389
T4 DNA-LigaseNEBM0202
TRISSigma-AldrichTRIS-RO
em>Xba INEBR0145
Hefe-Extrakt BD212750
ausgetauscht werden;<

Referenzen

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