Diese Arbeit beschreibt das Klonen einer Ustilago Maydis Trojanisches Pferd Belastung für die in-situ Lieferung von sekretierten Proteinen, Mais in drei verschiedene Arten von Mais Gewebe.
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Methodenartikel
Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Von Homers Trojanische Pferd Mythos inspiriert, haben wir den Mais Erreger Ustilago Maydis sekretierten Proteine in den Mais Apoplast schönem in-vivo phänotypische Analyse liefern entwickelt. Diese Methode setzt nicht auf Mais Transformation aber beutet mikrobielle Genetik und sekretorischen Funktionen von Krankheitserregern. Hierin, ermöglicht es, dass Inspektion von in-vivo sekretierten Proteine mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung bei verschiedenen Arten von Infektion Websites und Gewebe geliefert. Die Trojanische Pferd-Strategie kann genutzt werden, um vorübergehend Maize Verlustfunktion-Phänotypen, um funktionell charakterisieren Protein Domänen, aus Zielprotein Auswirkungen zu analysieren oder zu onside Protein Überdosierung, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für studieren ergänzen Protein-Studien in der Mais-Ernte-System. Dieses Werk enthält eine genaue Protokoll über wie einen Trojanisches Pferd Stamm, gefolgt von standardisierten Infektion Protokolle dieser Methode zu drei verschiedenen Mais Gewebetypen zu generieren.
Einleitung
Der biotrophe Erreger Ustilago Maydis ist der Erreger der Mais Smut Krankheit1. Er infiziert alle oberirdischen Teile von Mais, was zu großen Tumoren, die Melanized, schwarze Sporen enthalten. Auf globaler Ebene dürfte U. Maydis verursachen einen jährlichen Verlust von rund 2 % des Mais Ertrag, während Tumoren als in Mexiko eine gastronomische Delikatesse geschätzt werden. Pflanze-Infektion wird durch eine Appressorium eingeleitet, die Zellwand Lysiereinrichtung Enzyme, die erste Schicht von Mais epidermalen Zellen durchdringen sondert. Von einer Primärinfektion Site U. Maydis wächst intrazellulär und intercellularly,....
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Protokoll
(1) Bau einer U. Maydis Trojanisches Pferd
Hinweis: Siehe Abbildung 1.
- Ein Gen des Interesses von Mais cDNA mittels Gen-spezifische Primer und ein Lektorat DNA-Polymerase zu verstärken. Klonen Sie das Hauptprodukt der PCR zu und verwandeln Sie das Konstrukt in E. Coli Anweisungen des Verkäufers Plasmid. Stellen Sie sicher das richtige gen Interesse Sequenz von Sanger-Sequenzierung vor für die nächsten Schritte zum Klonen zu verwenden.
Hinweis: PCR-Spezifikationen durch Primer Sequenz Besonderheiten und optimale DNA-Polymerase Reaktionsbed....
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Ergebnisse
Konstrukte für U. Maydis Trojanisches Pferd Experimente werden in das Plasmid p123-pUmpit2-SpUmpit2-gen von Interesse-mCherry-Hageklont. Der Maize gen von Interesse ist, ein mCherry -Fluoreszenz-Reporter und ein Epitop HAverschmolzen-Tag. Der Ausdruck des Fusionsproteins ist unter Kontrolle des U. Maydis Umpit2 Promotors, speziell bei Infektion
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Diskussion
Moderne Pflanzenforschung erfordert Protokolle für molekulare Analyse auf genetische und Proteingehalt. Genetischen Zugänglichkeit über Transformation ist nicht verfügbar oder ineffizient und zeitaufwendig für die meisten Kulturarten wie Mais. Darüber hinaus sind zuverlässige genetische Tools wie Veranstalter Reporter Systeme rar, das macht es schwierig, in-situ Proteinfunktion raumzeitlichen hochauflösend an unterschiedliche Gewebe Standorten zu studieren. Apoplasten Proteine können durch Infiltration von heter.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchte Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella und Armin Hildebrand danken für die Bereitstellung von Raum und Pflanze Labormaterial. Das ursprüngliche Werk über die Trojaner-Methode wurde von einer Leopoldina postdoc Fellowship und NSF Projekt IOS13-39229 unterstützt. Die in diesem Artikel vorgestellte Arbeit wurde von SFB924 (Projekte A14 und B14) der DFG unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2 mL Spritze | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 Injektionsnadel | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Pepton | BD | 211677 | |
| cDNA aus Mais | aus Maisgewebe, das das Gen der Zwischenreste exprimiert | ||
| Holzkohle | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | mit lokal verfügbarer Ausrüstung | ||
| Küvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Inkubator-Schüttler auf 28 &°; C, 200 U/min | mit lokal verfügbarer Ausrüstung | ||
| Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung | mit lokal verfügbarer Ausrüstung | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | bitte kontaktieren Sie den entsprechenden Autor | ||
| Pasteurpipette (Glas, lange Spitze) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | kann gegen andere grundlegende Klonierungsvektoren wie pENTR oder pJET |
| Kartoffel-Dextrose-Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie-Stift | mit lokal verfügbarer Ausrüstung | ||
| Spektralphotometer | mit lokal verfügbarer Ausrüstung | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA-Ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| em>Xba I | NEB | R0145 | |
| Hefe-Extrakt | BD | 212750 |
Referenzen
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Jour....
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Nachdrucke und Genehmigungen
