Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

Summary

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Abstract

HIV bleibt aufgrund der Existenz eines Reservoirs von Zellen, die stabil und latente Form des Virus, birgt für das Immunsystem unsichtbar bleibt und nicht durch die aktuelle antiretrovirale Therapie (cART) unheilbar. Transkription und Spleißen wurden gezeigt, HIV-1 Latenzzeiten in ruhenden CD4 + T-Zellen zu verstärken. Umkehrung der Latenz durch den Einsatz von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) in der "Shock and Kill" Ansatz wurde ausgiebig untersucht, in dem Versuch, dieses Reservoir zu bereinigen, aber keinen Erfolg in klinischen Studien wegen mangelnder Entwicklung von angemessenen kleinen bisher nicht nachgewiesen Moleküle, die effizient dieses Reservoir durcheinanderbringen können. Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zur zuverlässig und effizient Bewertung Latenz Umkehr Agents (Gebietskörperschaften) auf HIV Transkription und Spleißen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung von ein LTR-gesteuerte dual Color-Reporter, der gleichzeitig die Wirkung von einem LRA auf Transkription und Spleißen messen kann durch Durchflusszytometrie. Das hier beschriebene Protokoll ist ausreichend für adhärente Zellen als auch die Zellen in der Suspension. Es eignet sich für eine große Anzahl von Drogen in einem hohen Durchsatz-System testen. Die Methode ist technisch einfach zu implementieren und kostengünstig. Darüber hinaus ist die Verwendung der Durchflusszytometrie ermöglicht die Beurteilung der Zellviabilität und somit Drogen Toxizität zur gleichen Zeit.

Introduction

Trotz wirksame langfristige antiretrovirale Therapie besteht HIV in einem latenten Zustand als eine integrierte Provirus im Speicher CD4 + T-Zellen-¹. Das Chromatinstruktur des HIV-1-5 "lange terminal Repeat (LTR) Promoter und epigenetische Modifikationen wie Histon-Methylierung und Deacetylation durch DNA-Methyltransferasen (DNMT) und Histon Deacetylases (HDAC) sind wichtige Mechanismen, die transcriptional Repression und damit nach Integration Latenz^2,3. Eine Vielzahl von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) wurde untersucht, auf ihre Wirksamkeit induzieren Virus Produktion i....

Protocol

Hinweis: Verfahren zum Klonen, Transformation und Sequenzierung sind an anderer Stelle erläutert^18,19. Die Protokolle hier beginnt die Transfektion von Säugetieren Expressionsvektoren (Abbildung 3).

1. die Transfektion von HEK293T Zellen mit Dual Color Reporter zu konstruieren

1. Pflegen Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) in einem 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C. Nach dem Auftauen Durchgang ....

Results

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5 gezeigt, die Expression von HIV-1 unspliced (EGFP) und gespleißt (DsRed) Produkte, die nach der Behandlung mit Bromodomain-Hemmer JQ1. JQ1(+) und Tat deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck EGFP (2,18 und 4.13 FC über DMSO bzw.; n = 3) bezeichnend für unspliced Transkripte. Darüber hinaus JQ1(+) deutlich stieg der Anteil der Zellen mit dem Ausdruck DsRed (46,6 FC über DMSO) sowie der Anteil der gespl.......

Discussion

Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Virus-Reaktivierung ex Vivo, infiziert eine Vielzahl von in-vitro-Modelle im Laufe der Zeit entwickelt wurden, um HIV-Latenz einschließlich latent studieren T-Zell-Linien (J-Lats, ACH2, U1), primäre Modelle der latenten Infektion ruhen ( O' Doherty, Lewin, Greene und Spina-Modelle) oder pre-activated CD4 + T-Zellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn Modelle) mit einzelnen Runde oder Replikation zuständigen Reporter Viren²². Um die physiolog.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zellkultur
HEK293T Zellen (humane embryonale Nierenzellen)	ATCC	CRL-3216	repliziert Vektoren, die die SV40-Replikationsregion tragen.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Natriumpyruvat
Fötales Rinderserum	Gibco	10099-141	Herkunft Australien
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190-136
Trypanblau Färbung, 0,4%	Gibco	15250
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	Gibco	25300054
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Lipidtransfektionsreagenz
Opti-MEM I (1x) reduziertes Serummedium	Gibco	31985-070	Serum freies Medium
NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
pEGFP-N1-Plasmid	Clontech (TaKaRa)	6085-1	Expression von EGFP in Säugetierzellen, CMVIEPromotor.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Expression von DsRed-Express in Säugetierzellen, CMVIEPromotor.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 1 μ M
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 1 μ M
Phorbol Myristatacetat (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Bestand à 100 μ g/ml in DMSO; Arbeitskonzentration 10 nM
Phytohämagglutinin (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Lagerbestand bei 1 μ g/μ L in PBS; Arbeitskonzentration 10 μ g/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Lagerbestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 0,5 μ M
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Bestand bei 10 mM in DMSO; Arbeitskonzentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
Durchflusszytometrie-Reagenzien
LSR Fortessa	BD Biosciences		Durchflusszytometer (4 Laser - blau, rot, violett und gelb)
LSR II	BD Biosciences		Durchflusszytometer (3 Laser - blau, rot und violett)
LIVE/DEAD Fixierbar Nah-IR tot Cell Stain Kit	Life Technologies	L34976	Viabilitätsfarbstoff: für 633 oder 635 nm Anregung, 400 Assays. Komponente A und B sind beide im Kit enthalten.
Rinderserum Albumin	Sigma	A2153
EDTA 0,5M pH8	Gibco	15575-038
Formaldehyd Lösung 37/10 (37%)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS& T Research Beads	BD Biosciences	655050	Kalibrierkugeln
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 Peaks)	BD Biosciences	559123	3,0 - 3,4 mm
Mantellösung	Chem-Supply	SA046	90 g NaCl in 10 L Wasser
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Chlortabletten zur Desinfektion
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Konzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung Decon 90 5%.
Natriumhypochlorit (12-13% ige Lösung)	Labco	SODHYPO-5L	Konzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung Bleiche 1%.
7x	MPBio	IM76670	Konzentrierte Reinigungsmittel für Durchflusszytometer. Arbeitslösung 7x 1%.
Name	<>Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
Materials
Gewebekulturflaschen (75 cm2, schräger Hals, Kappe belüftet)	Corning	430641U
Gewebekulturplatten (96 Well flacher Boden mit Deckel)	Costar	3599
Gewebekulturplatten (96 Well V-Boden ohne Deckel)	Costar	3896
Zentrifugenröhrchen (10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Serologisch Pipette (25 mL), sterile	Corning	CLS4489-200EA
Serologische Pipette (10 mL), sterile	Corning	CLS4488-200EA
Serologische Pipette (5 mL), sterile	Corning	CLS4487-200EA
Reagenzreservoire (50 mL),	sterile Corning	CLS4470-200EA
5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsiebkappe	Corning	352235	12 x 75 mm Stil, 70 mm
Nylon Mesh	SEFAR	03-100/32	100 mm
Titerröhrchen Mikro-Reagenzgläser, Bulk	BIO-RAD	2239391	Microfacs Röhrchen
5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, ohne Kappe	Corning	352008	12x75 mm Stil
Schnappverschlüsse für 12x75 mm Reagenzgläser	Corning	352032
Zählkammer, Neubauer verbesserte Doppelnetzlineatur, Bright-Line (Hämozytometer, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 große Quadrate von 1 mm2; Tiefe 0.100 mm; Volumen 0,1 ml; Fläche mindestens 0,0025 mm2
Deckgläser (Menzel-Glä ser)	Grale Scientific	HCS2026	20 x 26 mm
Mikroskop	Nikon TMS	310528
Zentrifuge 5810R gekühlt	Eppendorf	5811000487	mit Rotor A-4-81 inkl. Adapter für 15/50 mL konische Röhrchen
FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader	BMG Labtech	N/A	Platten-Reader für Zellproliferationsassays. Filter 490 nm.
Name	Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Durchflusszytometer-Datenerfassungs- und Analyseprogramm, Version 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Datenanalyseprogramm für Durchflusszytometer, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar Multi-User-Reader-Steuerung, Version 5.11
Omega - Datenanalyse	BMG Labtech	MARS	FLUOstar Datenanalyse, Version 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel:mac 2011	Version 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	Version 7.0c