Methodenartikel

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

DOI:

10.3791/58754

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7. Januar 2019

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1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Zusammenfassung

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Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs) der kanonischen TRP Unterfamilie sind obstructions kationen-Kanäle, die eine wichtige im Kalzium-Homöostase, insbesondere Shop betrieben Kalzium-Eintrag, ist entscheidend Rolle für die einwandfreie Funktion der Aufrechterhaltung synaptischen Vesikel Release und intrazellulären Signalwege. Dementsprechend waren TRPC Kanäle in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Störungen wie Herzhypertrophie, neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit und neurologische Störungen wie Spinozerebellare Ataxie verwickelt. Deshalb sind TRPC Kanäle ein potenzielles pharmakologische Ziel bei menschlichen Erkrankungen. Die molekularen Mechanismen der Anspritzung in diesen Kanälen sind jedoch noch unklar. Die Schwierigkeit bei der Beschaffung von großen Mengen an stabile, homogene und gereinigtes Protein wurde ein limitierender Faktor in Struktur Entschlossenheit Studien, insbesondere bei Säugetieren Membranproteine wie die TRPC Ionenkanäle. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den großen Ausdruck von Säugetieren Ionen-Kanal Membranproteinen Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie eine modifizierte Baculovirus-gen-Transfer-System und die Reinigung dieser Proteine durch. Weiter präsentieren wir ein Protokoll, Single-Teilchen Cryo-Elektron Mikroskopie Bilder von gereinigtes Protein zu sammeln und diese Bilder zu verwenden, um die Proteinstruktur zu bestimmen. Strukturaufklärung ist eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der Mechanismen der gating und Funktion im Ionenkanäle.

Einleitung

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Kalzium ist in die zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung Kaskaden, Transkription Kontrolle, Neurotransmitter-Freisetzung und Hormon-Molekül Synthese1,2,3beteiligt. Die homöostatische Wartung der cytosolischen freie Kalzium ist entscheidend für die Gesundheit und Funktion der Zellen. Einer der wichtigsten Mechanismen der intrazellulären Calcium-Homöostase ist Store betrieben Kalzium Eintrag (SOCE), ein Prozess, in dem gespeichert Erschöpfung des Kalziums in das endoplasmatische Retikulum (ER) löst die Öffnung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran zu erleichtern, die Auffüllung der ER Kalzium, die dann in weiteren Signalisierung4,5,6verwendet werden kann. Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs), die Kalzium-durchlässige Kanäle, die TRP-Superfamilie angehören, wurden als einer der wichtigsten Teilnehmer SOCE7,8,9 identifiziert.

Unter den sieben Mitgliedern der Familie TRPC TRPC3, TRPC6 und TRPC7 bilden eine Untergruppe homolog, und sie sind einzigartig in der Fähigkeit von Lipid sekundäre Messenger Diacylglycerol (DAG), ein Abbauprodukt von Signalisierung Lipid aktiviert werden Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 drückt sich hoch, in glatten Muskulatur und in der zerebralen und zerebelläre Regionen des Gehirns, wo er entscheidende Rolle spielt bei der Signalisierung von Kalzium, die Neurotransmission und Neurogenese12,13auswirken. Dysfunktion des TRPC3 ist mit Störungen des zentralen Nervensystems, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bestimmten Krebsarten wie z. B. Eierstock Adenokarzinom14,15,16verbunden worden. Deshalb verspricht TRPC3 als pharmazeutische Ziel für die Behandlung dieser Krankheiten. Die Entwicklung gezielt Medikamente, die auf TRPC3 wurde durch einen Mangel an Verständnis für die molekulare Aktivierungsmechanismen, einschließlich Lipid Bindung Seiten17,18beschränkt. Wir haben die erste atomarer Auflösung Struktur des menschlichen TRPC3 Kanals (hTRPC3) und seine zwei Lipid-Bindungsstellen im geschlossenen Zustand berichtet, wichtige Einblicke in diese Mechanismen19.

Der entscheidende Faktor für die Bestimmung der Struktur eines Proteins Membran mit hoher Auflösung ist Protein von hoher Qualität zu erhalten. Die entsprechenden Screening von Ausdruck und Reinigung Bedingungen notwendig, hochwertiges Eiweiß zu erhalten kann ein Zeit- und kostenaufwendig Unterfangen sein. Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt im Detail wie ermitteln wir die optimalen Bedingungen für den Ausdruck und die Reinigung des hTRPC3, die in unseren ersten Screening schlecht benommen. Wir präsentieren einige wichtige Punkte zur Problembehandlung und optimieren die Protein-Verhalten, das eine solide Grundlage für unsere Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Studien geschaffen. Wir verwenden eine modifizierte Baculoviral Vektor (pEG), entwickelt von Gouaux und Kollegen, die optimiert ist für das screening-Assays und effiziente Erzeugung von Baculovirus in Säugerzellen20generieren. Dieser Ausdruck-Methode eignet sich für schnelle und kostengünstige Überexpression von Proteinen in der Säugetier-Zelle Membrane. Wir kombinieren die Verwendung dieses Vektors mit einem Fluoreszenz-Detektion Größe-Ausschluss Chromatographie-basierte (FSEC) prescreening Methode21. Diese Methode verwendet einen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tag verschmolzen, das Konstrukt von Interesse und verbessert die Visualisierung des Zielproteins in kleine, ganze Zelle solubilisiert Proben. Dies ermöglicht für das Screening der Proteinstabilität im Beisein von verschiedenen Wasch- und Zusatzstoffe, mit thermostabilizing Mutationen, und ermöglicht die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen aus kleinen transiente Transfektion. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Bedingungen rasch untersucht werden, bevor er zu einer groß angelegten Proteinreinigung. Nach Ausdruck, Screening und Reinigung präsentieren wir ein Protokoll für die Beschaffung und Verarbeitung von Bildern von Cryo-EM, eine de-Novo -Strukturaufklärung des Proteins zu generieren. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Vorgehensweisen als verallgemeinerbare Protokoll für strukturelle Studien der TRP-Kanal-Rezeptoren und andere Membranproteine dienen werden.

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Protokoll

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1. Umwandlung der DH10α zuständigen Zellen, Bacmid DNA zu produzieren

  1. Das gen des Interesses zu synthetisieren und subclone es in eine überarbeitete Version des pEG-Vektors mit einem Zwilling Strep-Tag, ein His8-Tag und GFP mit ein Thrombin-Spaltstelle am N-Terminus (pFastBacI)-20.
  2. Kompetente Zellen zu verwandeln, indem man 5 ng Plasmid mit einem gewünschten gen in pFastBacI zu 50 μL der DH10α Zellen in einem 1,5 mL tube und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Hitze Schock die Zellen für 45 s bei 42 ° C. Das Rohr 200 μL super optimale Brühe mit katabolen Repressor (SOC) Medium hinzufügen und 4-8 h bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 225 u/min inkubieren.
  3. Platte 5 μL der Zellen auf einer Bacmid LB-Agar-Platte (50 μg/mL Kanamycin, 7 μg/mL Gentamicin, Tetracyclin, 100 μg/mL Bluo-gal und 40 μg/mL Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside [IPTG], Agar 10 μg/mL).
  4. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° c
    Hinweis: Der Bluo-gal Indikator Flecken Kolonien, die noch LacZ (Vektor Insertion erfolglos), mit dem Ausdruck ermöglicht für die Auswahl der weißen (erfolgreich transformierte) Kolonien.
  5. Wählen Sie sorgfältig eine isolierte weiße Kolonie, weiße Kolonien, die in Kontakt mit blauen Kolonien und wachsen Zellen über Nacht in 6 mL Bacmid LB-Medium (50 μg/mL Kanamycin, 7 μg/mL Gentamicin, 10 μg/mL Tetracyclin) bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 225 u/min zu vermeiden.

2. bakterielle Vorbereitung zur Isolation von Bacmid DNA

  1. Um Bacmid DNA zu isolieren, spin-down Escherichia coli Zellen für 10 min bei 2880 X g.
  2. Verwerfen der Überstand und Aufschwemmen das Pellet in 200 µL der Zelle Wiederfreisetzung Lösung aus der Miniprep durch Pipettieren kit (siehe Tabelle der Materialien). Achten Sie darauf, dass das Pellet vollständig und homogen ausgesetzt ist. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in 1,5 mL Röhrchen.
  3. Fügen Sie 200 µL der Zelle Lysis Lösung aus Miniprep Kit und Mix durch Umkehrung der Röhre ein paar Mal. Bis zu 5 min bei Raumtemperatur (RT), die Zellen lysiert inkubieren. Fügen Sie 200 µL der Neutralisation Lösung aus Miniprep Kit und Mischung durch invertieren Rohr ein paar Mal um die Lyse Reaktion zu stoppen.
  4. Spin-down für 10 min bei 21.130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Sammeln Sie 600 μl Überstand in ein 2 mL-Tube. Fügen Sie 600 μl Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohollösung (siehe Tabelle der Materialien) und Mischung gründlich, um die DNA vom Rest der Zelle Lysis Produkte zu extrahieren.
    Achtung: Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohollösung ist giftig beim Einatmen, Berührung mit der Haut, und Verschlucken. Es kann Verätzungen verursachen und möglicherweise krebserregend. Tragen Sie Handschuhe und eine geknöpfte Kittel. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Diese Sonderabfälle ordnungsgemäß entsorgen.
  5. Drehen Sie das Rohr für 10 min bei 21130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Zwei flüssigen Phasen werden angezeigt. Übertragen Sie 300 μL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf einen neuen Schlauch. Fügen Sie 600 μL von 100 % Ethanol, die DNA zu waschen. Invertieren Sie sanft das Rohr zu mischen.
    Hinweis: Tun nicht Wirbel, wie dies Bacmid DNA zu scheren.
  6. Coole Röhren werden, indem sie in einem Gefrierschrank-20 ° C für 10 min. Spin-down für 10 min bei 21.130 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand und bewahren Sie das DNA-Pellet.
  7. Fügen Sie 1 mL 70 % igem Ethanol um die Pellets zu waschen. Invertieren Sie sanft das Rohr zu mischen. Drehen Sie für 10 min bei 21.130 X g in einer Table-Top-Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet in die Luft für ca. 5 min oder bis keine Flüssigkeit im Schlauch sichtbar ist und das DNA-Pellet durchscheinend wird.
  8. Aufschwemmen der trockenen Pellet in 50 µL steriler, DNase-free, deionisiertes Wasser. Die DNA-Konzentration zu messen.
    Hinweis: Bacmid DNA nicht einfrieren. Lagerung bei 4 ° C für bis zu mehreren Tagen.

3. die Transfektion von Sf9 Insektenzellen mit Bacmid P1 Baculovirus produzieren

  1. Samen 0,9 x 106 Sf9 Zellen/Brunnen in 2 mL des entsprechenden Mediums (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well-Platte. Inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C für 20 min, Befestigung an der Platte zu fördern.
    Achtung: Zellkulturen sind eine potenzielle Biohazard. Arbeiten in einer zugelassenen Laminar-Flow-Haube mit aseptischen Techniken und institutionellen und staatliche Richtlinien für die empfohlene Schutzkleidung und ordnungsgemäße Entsorgung der Abfälle vor der Durchführung von Experimenten zu überprüfen.
  2. Fügen Sie nach Anhang 8 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien), 100 µL der Medien für jede Vertiefung der 6 gut Platte wird in ein steriles Röhrchen transfiziert. 100 µL Medium in einer separaten steriles Röhrchen 6 μg Bacmid DNA hinzufügen. 5 min bei RT. kombinieren Sie die beiden Lösungen inkubieren und 45 min bei RT inkubieren
  3. Ersetzen Sie das Medium in den 6 Brunnen mit 2 mL frisches Medium. Fügen Sie die Mischung aus vorherigen Schritt zu jedem gut tropfenweise (200 µL pro Well). Schütteln Sie die Platte, um die Vermischung der Transfektion Lösung in das Medium zu gewährleisten.
    Hinweis: Nicht schwenken oder Schütteln der Plattenrandes, denn dadurch werden Zellen zu lösen.
  4. Inkubieren Sie Zellen für die 5D (120 h) in einem befeuchteten Inkubator von 27 ° C. Überprüfen Sie die GFP Fluoreszenz vor der Ernte, um sicherzustellen, dass das Virus in einem hohen Prozentsatz der Zellen produziert wird; Wenn der Prozentsatz gering ist, erweitern die Inkubationszeit bei Bedarf (siehe Abbildung 1).
  5. Der Überstand mit P1-Virus (ca. 2 mL aus jedem Brunnen) zu sammeln. Filtern Sie das Medium mit P1 Virus in 2-mL-Röhrchen mit einer 3 mL Spritze und kleinen 0,2 µm-Filter. Eine Endkonzentration von 1 % sterile fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.
    Hinweis: Dieser Bestand des P1-Virus sollte bei 4 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt werden.

(4) Infektion der Sf9 Insektenzellen mit Baculovirus P1, P2 Baculovirus zu produzieren

  1. Bereiten Sie 200 mL (oder gewünschte Lautstärke) Sf9 Zellen in einer Konzentration von 0,8 - 0,9 x 106 Zellen/mL in geeigneter Form (siehe Tabelle der Materialien) in einem flachen Boden Kultur Erlenmeyerkolben von ausreichender Größe.
    Hinweis: Für Suspensionskultur, sollten die verwendeten Volumen nicht 40 % der Gesamtkapazität des Kolbens überschreiten.
  2. Die Zellkultur Aussetzung Sf9 1:2500 Verhältnis (V/V) von P1 Virus bestand aus 3.5 hinzufügen. Die Zeit der optimalen Virus Ausdruck (in der Regel 48-120 h abhängig von der Protein-Konstrukt) bei 27 ° C in einem Orbitalschüttler bei 115 u/min inkubieren.
    Hinweis: Die relative Virus Ausdruck kann bestimmt werden, indem Sie Anzeigen der GFP-Fluoreszenz des Virus in einer Probe der Kultur.
  3. Die Zellsuspension für 40 min bei 11.520 X g Zentrifugieren und das überstand mit P2-Virus zu sammeln. Filtern Sie den Überstand mit Einweg-0,2 µm-Filter. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 0,5 % FBS.
    Hinweis: Dieser Bestand des P2-Virus sollte bei 4 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt werden.
  4. Erhalten Sie einen Titer für die P2-Virus mit Sf9easy Zellen oder ein Virus-Zähler.

5. Infektion von HEK293 Säugerzellen mit P2 Baculovirus für groß angelegte Proteinexpression

  1. Bereiten Sie ein wünschenswert Volumen an HEK293 Säugerzelle Suspensionskultur (4-6 L empfiehlt sich für die Zubereitung von gefrorenen Grids) in einer Konzentration von 3,5-3,8 X 106 Zellen/mL im Ausdruck Medium (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt mit 1 % (V / (V) sterile FBS in verblüfft unten Erlenmeyerkolben Kultur von ausreichender Größe.
    Hinweis: Für Suspensionskultur, sollten die verwendeten Volumen nicht 40 % des Gesamtvolumens des Kolbens überschreiten.
  2. Die HEK293 Zellen Suspensionskultur 8 % (V/V) von P2 Virus Stammlösung aus Schritt 4.3 hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C in einem Orbitalschüttler bei 135 Umdrehungen pro Minute.
  3. Fügen Sie 10 mM Natrium Butyrat am 12-18 h nach der Infektion. Die Zeit des optimalen Protein-Expression (in der Regel 36-72 h) bei 30 ° c inkubieren
  4. Für 20 min bei 2.880 X gZentrifugieren, um Zellen zu ernten. Waschen Sie Zellen von resuspending in ca. 100 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) pro Liter Zellen geerntet. Wieder für 20 min bei 2.880 X g Zentrifugieren Sie und sammeln Sie die Zelle Pellet.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Zelle Pellets können Snap in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Reinigung gelagert.
    Achtung: Flüssigstickstoff kryogene Verbrennungen oder Verletzungen verursachen. Es kann Erfrierungen verursachen. Es kann Sauerstoff verdrängen und zur raschen Erstickung führen. Tragen Sie kalten isolierende Handschuhe und Gesichtsschutz.
  5. Sammeln Sie kleine 1 mL Ernten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und anderweitig für 2 h bei 4 ° C mit Schaukeln oder rühren in Anwesenheit von verschiedenen Wasch-und/oder Zusatzstoffen. Diese kleine ganze-solubilized Zellproben durch Ultrazentrifugation 235.000 × g für 10 min bei 4 ° C und laufen als 30 μl Probe auf eine Chromatographiesäule Größe-Ausschluss (SEC) geklärt werden können (siehe Tabelle der Materialien), um festzustellen, die beste Zeit für Ausdruck und die besten Solubilisierung Bedingungen.
    Hinweis: Im Falle von hTRPC3, dieses Screening enthalten verschiedene Puffer mit pH Werten von 4.0-9.5 und Salzkonzentrationen von 50-500 mM; verschiedene ionische Kompositionen (z. B. MgCl2 oder NaCl); verschiedene Reinigungsmittel mit kritischen Micelle (CMC) Konzentrationswerte von 0,1 - 20 mM; Verringerung der Zusätze wie Dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) Phosphin und β-Mercaptoethanol; und die Kalzium-chelatisierenden additive Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).

6. Reinigung des hTRPC3 Proteins aus gefrorenen Zelle Pellet

  1. Tauen Sie das Pellet in Puffer mit 20 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) 0,8 μM Aprotinin, 2 μg/mL Leupeptin, 2 mM Pepstatin A, und 1 % Digitonin, mit 100 mL Puffer pro Liter Zellen geerntet. Einmal aufgetaut, Homogenität der Lösung durch pipettieren und unter ständigem Rühren zu gewährleisten. Für 2 h bei 4 ° C in ein Becherglas eingetaucht in Eis mit einer Stir Bar rotierenden lösen lassen.
  2. Entfernen Sie die Zelle Ablagerungen durch Ultrazentrifugation 235.000 × g für 1 h bei 4 ° C. Protein-Menge durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte zu überprüfen (siehe Tabelle der Materialien) durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und visualisieren das Zielprotein von der GFP-Signalausgang.
  3. Inkubieren Sie das solubilized Protein (überstand) mit Kobalt Affinität Harz für 1-2 h bei 4 ° c Proteinbindung an das Harz durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte zu überprüfen.
    Hinweis: Wenn Proteinbindung aufgetreten ist, wird das GFP-tagged Protein-Ziel auf die Spalte, in der durchströmten nicht gefunden einbehalten. Kein Signal der GFP wird daher an der Position, die Zielgröße Protein entspricht, wenn der Durchfluss auf HPLC ausgeführt wird, vorhanden sein.
  4. Waschen Sie das Harz mit 10 Spalte Bände des Puffers (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol und 0,1 % Digitonin). Suchen Sie nach Proteinverlust durch Ausführen einer 30 μl Probe auf einem SEC-Spalte.
    Hinweis: Wenn Proteinverlust aus der Spalte aufgetreten ist, wird die GFP tagged Protein Ziel in der Waschpuffer gefunden werden, die über die Spalte übergeben hat. GFP-Signal wird daher an der Position, die Zielgröße Protein entspricht, wenn der Waschpuffer auf HPLC ausgeführt wird, vorhanden sein. Wenn Proteinverlust aufgetreten ist, müssen die Imidazol-Konzentration von den Waschpuffer abgesenkt werden, um zu verhindern, dass seine Tag-Bindung an die Spalte die Affinität zu stören.
  5. Die Harz-gebundene hTRPC3 mit Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol und 0,1 % Digitonin) eluieren. Hinzufügen von Thrombin an einem 01:20 Molverhältnis (um das GFP-Tag cleave) und der eluierten Probe 10 mM EDTA (ein hTRPC3 Stabilisierungsmittel) hinzufügen und 3 h bei 4 ° c inkubieren Überprüfen Sie, dass Protein 90 μL eine Probe verdünnt 1: 100 auf einer SEC-Spalte ausgeführt und überprüft das Vorhandensein von ein GLP-Signal an der Position entsprechend auf die Zielgröße Protein eluiert wurde hat.
    Hinweis: an dieser Stelle kann das Tryptophan-Signal vom Gesamt-Protein in der Elution auch angezeigt werden. Nur das Zielprotein Affinität gereinigt in der Elutions- und der GFP bleibt und Tryptophan-Signale werden in der Nähe im Profil identisch. Wenn das Zielprotein ist in großer Menge in der Elution nicht gesehen, aber war im Durchflussverfahren oder waschen nicht verloren, das Protein blieb wahrscheinlich an die Säule gebunden und kann mit einer höheren Konzentration von Imidazol im Puffer eluiert werden.
  6. Das Eluat zu 500 μL zu konzentrieren oder weniger in einem 15 mL 100K zentrifugale Filter von Spinnen bei 2.880 X g bei 4 ° C in Schritten von 5 min tube (siehe Tabelle der Materialien). Aufschwemmen des Proteins durch pipettieren die Lösung oben und unten zwischen den Spins um overconcentrating zu vermeiden.
    Hinweis: Zentrifuge Zeit kann verkürzt werden, da das Volumen der gewünschten Endvolumen nähert.
  7. Laden Sie das Konzentrat auf einer SEC-Spalte im Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % Digitonin). Ausgeführt werden.
  8. Kombinieren Sie Gipfel Brüche mit den intakten TRPC3 Tetramer als visualisierte durch UV-Absorption-Signal, und konzentrieren uns wieder auf eine Endkonzentration von mindestens 5 mg/mL.

(7) Screening des Proteins von negativ-Fleck-Elektronen-Mikroskopie

  1. Die Glimmentladung Maschine einschalten. Stellen Sie das Programm für die Entladung von Kohlenstoff-beschichtete Raster mit Argon und Sauerstoff für 30 S. ausführen das Programm die Carbon-Beschichtung auf Kupfer 400-Mesh-Gitter vor der Zugabe der Proteinlösung hydrophilen vornehmen.
  2. Einrichten von fünf 40 μL Tropfen steriles Wasser und zwei 40 μL Tropfen 1 % Uranyl Formiat Lösung (auf Lab Film, Wachspapier oder eine ähnliche Oberfläche, siehe Tabelle der Materialien). Nehmen Sie das Raster aus Schritt 7.1 und fügen Sie 2,5 μL des Proteins Probe 5 mg/mL (50-200 μM), auf die dunkle Seite und lassen Sie es für 1 min.
  3. Trocknen Sie nach 1 min das Gitter mit Filterpapier. Berühren Sie das Filterpapier direkt an der Oberfläche nicht; Stattdessen bringen Sie das Papier an den Rand des flüssigen Tröpfchen und ermöglichen Sie haarartige Tätigkeit, die Flüssigkeit aus dem Netz ziehen in das Filterpapier zu.
  4. Tauchen Sie das Raster in ersten Tropfen Wasser. Mit Filterpapier trocknen und mit den restlichen Wassertropfen und der erste Tropfen Uranyl Formiat wiederholen. Lassen Sie der zweite Tropfen Uranyl Formiat für 1 min sitzen und anschließend mit Filterpapier. Erlauben Sie das Gitter, um voll Luft trocknen lassen (ca. 1 min) vor der Lagerung.
    Hinweis: Diese Färbung Protokoll ideal für alle Protein-Reinigungsmittel-Kombinationen möglicherweise nicht. Verschiedene Konzentrationen von Uranyl Formiat beflecken und unterschiedlich lange für die Fleck-Exposition sollte geprüft werden, wenn die oben genannten Schritte keinen Fleck mit gutem Kontrast bieten.
  5. Bild Rastern auf Elektronen-Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien), die Protein-Partikel-Qualität zu überprüfen. Sicherzustellen, dass die Mikrographen zeigen zahlreiche Teilchen, die im allgemeinen Aussehen und Verteilung homogen sind, zeigen guten Kontrast und die prognostizierten Größe des Zielproteins.
  6. Vorläufige zu generieren, mit niedriger Auflösung, zweidimensionale (2D) Klassifikationen mit 50-100 Aufnahmen (siehe Datenverarbeitung – Schritt 10) zu überprüfen, ob die Partikel vertreten unterschiedliche Ansichten einer einzigen einheitlichen Struktur.
    Hinweis: Mikrographen und vorläufigen 2D Klassen von ausreichender Qualität, wie oben beschrieben, sind ein starkes Indiz dafür, dass das Protokoll ausreichend für Proteinreinigung optimiert wurde. Vorbereitung und Vorführung von Cryo-EM Gitter ist zu diesem Zeitpunkt gewährleistet.

8. EM Probenvorbereitung

  1. Glimmentladung ein gold löchrigen Kohlenstoff-Gitter (siehe Tabelle der Materialien), wie unter Punkt 7.1 beschrieben.
  2. Gelten Sie 2,5 μL der konzentrierten hTRPC3 Protein Probe (5 mg/mL) auf das Gitter. Tupfen Sie das Raster für 1.5 s mit ein Schandfleck zu zwingen, von 1 und einer Wartezeit von 5 s bei 100 % Luftfeuchtigkeit und 4 ° C, dann das Gitter stürzen flüssigem Ethan durch flüssigen Stickstoff mit einer Verglasung Maschine abgekühlt.
    Hinweis: Feuchtigkeit, Temperatur, Blot-Kraft, Blot Zeit und Wartezeit, die hier aufgeführt wurden für die Autoren hTRPC3 Studie19verwendet. Sie müssen möglicherweise geändert werden, um optimale Glaskörper Eis für andere Proteine und Waschmittel produzieren.
  3. Bildschirm eingefroren Grids für optimale Eisverhältnisse unter Verwendung eines Mikroskops Cryo-EM (siehe Tabelle der Materialien) und manuell Ansicht Regionen von dickem Eis (Planquadrate, die kleiner und dunkler erscheinen), dünne Eis (Planquadrate, die größer und heller erscheinen) und Medium Eis .
    Hinweis: Dickeres Eis hält oft mehr Partikel, während dünner Eis oft besseren Kontrast und Auflösung ergibt. Verwendung manueller Screening von Bildern zu bestimmen, die Eis Bedingungen führt eine große Anzahl von Prozess-Partikel mit gutem Kontrast und Auflösung. Sobald gute Bedingungen überprüft werden, verschieben Sie in Bildsammlung auf einem 300 kV Cryo-EM Mikroskop.

9. EM-Datenerfassung

  1. Mit einem automatisierten Übernahme Programm aufzeichnen Bild Stapel in Höchstauflösung Zählmodus gebinnten Pixel Größe 1,074 Å auf einem Elektronenmikroskop betrieben bei 300 kV mit einer nominalen Vergrößerung von 130.000 X direkte Elektron Detektors.
  2. Dosis-fraktionieren jedes Bild auf 40 Frames mit einer Gesamtbelichtungszeit von 8 s mit 0,2 s pro Frame und eine Dosisleistung von 6,76 e− Å s−2 −1 (geringe Unschärfe Werte von 1,0 bis 2,5 μm in der Autoren Experiment variiert).

10. EM Datenverarbeitung

  1. Korrektur der summiert Film Stapel22 Bewegung umsetzen und Unschärfe Werte23 mit der Datenverarbeitung Software zu schätzen (siehe Tabelle der Materialien)24.
  2. Wählen Sie Partikel aus den Mikrographen. Verwenden Sie diese Partikel aufgenommen, um eine erste Referenz-freie 2D Klassifikation mit der Software24zu konstruieren. Wählen Sie ideale 2D Klasse Durchschnittswerte für automatisierte Partikel Kommissionierung für den gesamten Datensatz als Vorlage verwenden.
  3. Manuell überprüfen Sie die Qualität der Partikel Auto abgeholt und entfernen Sie schlechte Partikel zu. Verwenden Sie mehrfache Umläufe der 2D Klassifikation, um ausgewählte Partikel bereinigen.
  4. Ein erstes Modell25zu generieren. Thema 2D aufgenommen Partikel, dreidimensionale (3D) Klassifizierung (ca. 5 Klassen) mit C1 Symmetrie und eine erste Rekonstruktion Tiefpass-Filter von 60 Å als ein Referenzmodell. Bestimmen Sie, welche Klassen hochauflösende Funktionen und Partikeln in eine solche Klasse zu kombinieren.
  5. Verfeinern Sie Partikel mit der lokalen Verfeinerung mit C4 Symmetrie (bei hTRPC3) angewendet und ein hochauflösende Grenzwert für Partikel Ausrichtung auf 4.5 Å26.

11. Modellbau

  1. Ein Modell zu bauen (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software). Für hTRPC3, verwenden Sie die transmembrane Domäne (TMD) von transienten Rezeptor potenzielle Melastatin 4 (TRPM4) Struktur-Protein Data Bank (PDB) 5wp6 als ein Führer-27. Verwenden Sie sperrige Rückstände und Sekundärstruktur Vorhersage, de Novo Gebäude führt.
  2. Unterziehen Sie das ursprüngliche Modell Realraum Verfeinerung mit Sekundärstruktur Fesseln28. Manuell überprüfen Sie das verfeinerte Modell und remodify nach Bedarf (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software).
  3. Gelten Sie Fourier-Shell Korrelation (FSC) Kurven um die Berechnung der Differenz zwischen dem endgültigen Modell und die EM-Karte für die Validierung der raffinierte Struktur. Bewerten die Geometrien der Atommodelle (siehe Tabelle der Materialien für die verwendete Software)29,30.

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Ergebnisse

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Abbildung 1Azeigt einen schematischen Überblick über das Protokoll für die Expression und Reinigung des hTRPC3. Abbildung 1 bzeigt ein Bild der hTRPC3 Bacmid Platte mit idealer weiße Kolonien, ähnlich dem für Bacmid DNA-Reinigung, ausgewählt. Wir fanden, dass 48 h ideal für klare Bluo-gal-Färbung unter Beibehaltung der Präsenz der isolierten Kolonien. Höchstproduktion P2 Virus für hTRPC3, als visualisierte durch GFP Fluoreszenz, ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strukturaufklärung von Proteinen durch Cryo-EM revolutioniert den Bereich der Strukturbiologie in den letzten Jahren, dank der Entwicklung von neuen Kameras und Algorithmen, die erheblich beschleunigt die Strukturaufklärung von Proteinen, die nicht kristallisieren Sie leicht, besonders Membranproteine. Trotz aller Fortschritte in der Cryo-EM-Technik bleibt die Vorbereitung der gereinigten Proteine in Qualität und Quantität ausreichend qualitativ hochwertige Bildgebung oft Erleichterung zeitaufwendig, teuer und schwierig....

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G. Zhao und X. Meng danken wir für die Unterstützung bei der Erfassung der Daten auf die David Van Andel Advanced Cryo-Elektron Mikroskopie-Suite. Wir freuen uns über die VARI High-Performance-Computing-Team für computational Unterstützung. Wir geben unseren Dank an N. Clemente, D. Gebühren, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth und Z. Ruan für Kommentare, die diese Handschrift stark verbessert. Wir danken D. Nadziejka für redaktionelle Unterstützung für diese Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch interne VARI Finanzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pEG BacMam-Vektor (pFastBacI)addgene31488
DH10&alpha-ZellenLife Technologies10361-012
S.O.C.-MedienCorning46003CRfür die Transformation von DH10&alpha-Zellen für Bacmid-Baccam-Kulturplatten
TeknovaL5919für die Kultivierung von transformierten DH10&alpha-Zellen
Inkubationsschüttler für BakterienzellenInfors HTMultitron standard
Inkubierter Orbitalschüttler für InsektenzellenThermo-FisherSHKE8000
Reach-in CO2 Inkubator für SäugetierzellenThermo-Fisher3951
TischOrbitalschüttlerThermo-FisherSHKE416HPfür den Einsatz im Reach-in CO2-Inkubator für Säugetierzellen
InkubatorVWR1535für Bakterienplatten
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106für die Plasmidextraktion und -reinigung
Phenol:Chloroform:IsoamylalkoholInvitrogen15593031für die DNA-Extraktion
Sf9-ZellenLife Technologies12659017Insektenzellen für die Herstellung von Viren
Sf-900 MedienGibco12658-027Insektenzellmedien
FBSAtlanta BiologicalsS11550
Cellfectin IIGibco10362100zur Transfektion von Insektenzellen
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027zur Transfektion von Säugetierzellen
0,2 mm SpritzenfilterVWR28145-501zur Filterung von P1-Viren
0,2 mm Filterkolben 500ml resevoirCorning430758zur Filtration von P2-Virus-Erlenmeyer-Kulturflaschen
(flacher Boden 2L)Gene MateF-5909-2000für die Kultivierung von Insektenzellen
Erlenmeyer-Kulturflasche (mit 2 L)Gene MateF-5909-2000Bfür die Kultivierung von Säugetierzellen
Nanodrop 2000-SpektralphotometerThermo-FisherND-2000zur Bestimmung von DNA- und Proteinkonzentrationen
HEK293ATCCCRL-3022Säugetierzellen zur Herstellung von Protein
Freestyle 293 Expression MediumGibco1238-018Säugetierzellmedien für die Proteinexpression
Buttersäure NatriumsalzAcros263195000zur Amplifikation der Proteinexpression
PMSFAcros215740500Proteaseinhibitor
Aprotinin aus der RinderlungeSigma-AldrichA1153-100MGProteaseinhibitor
LeupeptinhydrochloridSigma-Aldrich24125-16-4Proteaseinhibitor
Pepstatin AFisher ScientificBP2671-250Proteaseinhibitor
DigitoninEMD Millipore300410Detergens - zur Solubilisierung von Protein aus
MembranimidazolSigma792527zur Eluierung von Protein aus der Harzsäule
TALON-HarzClonetech635504für die Affinitätsreinigung durch His-Tag
Superose6-InkeasesäulenGE29091596; 29091597für HPLC und FPLC
Prominence Modulares HPLC-SystemShimadzusiehe unten
Controller-Modul"CBM20A
Solvent Delivery System"LC30AD
Fluoreszenzdetektor"RF20AXS
Autosampler mit Kühlung"SIL20ACHT
Reines FPLC-System mit FraktionatorAkta
Thrombin (alpha)Haematologic Technologies IncorporatedHCT-0020 Humanes Alphazum Spalten von GFP-Tag
Amicon Ultra 15 mL 100K ZentrifugalfilterrohrMilliporeUFC910008zur Konzentration von Protein
EDTAFisherE478500zur Stabilisierung von Protein
400 Mesh kohlenstoffbeschichtete KupfergitterTed Pella Inc.01754-FGitter für Negativflecken
Quantifoil löchriges Kohlenstoffgitter (gold, 1,2/1,3&dünnsp; μ m Größe/Lochabstand, 300 mesh)Elektronenmikroskopie SciencesQ3100AR1.3Gitter für Kryo-EM
Vitrobot Mark IIIFEIzur Vorbereitung von Probengittern durch Flüssigethan Einfrieren
von flüssigem StickstoffDura-CylUN1977
EthanAirgasUN1035
Solarus PlasmaanlageGatanModell 950zur Reinigung von Gittern vor Einfrieren von Proben
Tecnai Spirit ElektronenmikroskopFEIfür die Negativfärbung EM-Bildgebung
Talos Arctica ElektronenmikroskopieFEIfür das Screening und die niedrigaufgelöste Bildgebung von Kryo-EM-Gittern
Titan Krios ElektronenmikroskopFEIfür hochauflösende Kryo-EM-Bildgebung
Software
Gautomatch-Softwarehttp://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/zur Auswahl von Partikeln aus Mikroaufnahmen
Relion 2.1 Softwarehttps://github.com/3dem/relionzur Erstellung von 2D- und 3D-Klassifikationen
CryoSPARC Softwarehttps://cryosparc.com/zur Generierung eines ersten Strukturmodells
Frealign Softwarehttp://grigoriefflab.janelia.org/frealignzur Verfeinerung particles
Coot Softwarehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/zum Erstellen eines Modells
MolProbity-Softwarehttp://molprobity.biochem.duke.edu/zur Bewertung der Geometrien des atomaren Modells
SerialEM-Softwarehttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/für die automatisierte Erfassung serieller Bildstapel
MortionCor2-Softwarefür die Bewegungskorrektur von summierten Filmstapeln
GCTF-Softwarehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/zur Messung von Unschärfewerten in Filmstapeln
Phenix.real_space_refine Softwarehttps://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.htmlzur Verfeinerung des ursprünglichen 3D-Modells im realen Raum
Gas http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353(2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001(2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852(2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792(2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

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