Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Zusammenfassung

SEM-Analyse ist eine effektive Methode um Speziesidentifizierung oder phänotypischen Diskriminierung zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Untersuchung der morphologischer Besonderheiten der drei repräsentative Arten von Organismen und zur Untersuchung der Eigenschaften von vielen organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

Zusammenfassung

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist eine verbreitete Technik, die angewendet wurden, um biologische Proben von einzelne Proteine, Zellen, Gewebe, Organellen und sogar ganze Organismen bis hin zu untersuchen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemischen Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazane (HMDS) und t-Butyl-Alkohol (TBA) und deren Anwendung auf Bildgebung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit SEM In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Dieses Protokoll soll beschreiben, eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um erhalten detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit der Exemplare, die im großen und ganzen auf eine große Auswahl an Organismen für angewendet werden können morphologische Bewertung. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls können andere SEM verwenden Proben durch Anwendung dieser Techniken, um ihr System zu visualisieren.

Einleitung

Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) nutzt einen fokussierten Strahl von hochenergetischen Elektronen erzeugen ein Bild von Sekundärelektronen, die Morphologie und die Topographie von Beispiel¹zeigt. SEM kann verwendet werden, um direkt die physische Größe einer Probe, die Oberflächenstruktur und die dreidimensionale Form, und bietet höhere Auflösung und größere Schärfentiefe im Vergleich zu Lichtmikroskopie bestimmen. Eine andere Form der Elektronenmikroskopie (EM), nutzt Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) fokussierte Elektronen, die durch die Probe, erzeugen Bilder mit feinen Details der internen Struktur übergeben. TEM hat höhere Auflö....

Protokoll

1. Vorbereitung und Fixierung

1. Cyanobakterien vorzubereiten.
   1. Unialgal Kulturen in f/2 Medien^24,25 bei einer Temperatur von 28 ° C auf einem 14:10 h wachsen Licht-dunklen Zyklus. Übertragen Sie ausreichend Kultur zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, so dass nach Abzug der 15 min zu begleichen, die bakterielle Pellet ca. 0,05 mL Größe. Entfernen Sie den Datenträger ersetzen mit 1,5 mL Fixativ (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0), sanft mehrmals umkehren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   2. Die festen Zellen mit einer Glaspipette in ein 10 mL-Filtration-Rig (

Ergebnisse

Cyanobakterien sind eine prokaryotische Gruppe von Organismen, die für die globale Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff Zyklen^28,29von entscheidender Bedeutung sind. Von den geschätzten 6000 Arten von Cyanobakterien³⁰die meisten haben eine schleimigen Hülle, die Decken und die Zellen miteinander verbinden und zu anderen Strukturen gelöst³¹, die zusammen mit der Form kann mikroskopi.......

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll mit SEM detaillierte Informationen über externe morphologischen Charakteristika der drei Arten von Organismen, die anderen anwenden können, um Eigenschaften von vielen Arten von Organismen oder Gewebe zu untersuchen. In jedem Schritt des Protokolls gibt es mögliche Punkte der Fehler, der auftreten und werden nachfolgend ausführlich erläutert.

Während die Volumina für Fixiermittel und Waschungen, die hier gegeben sind, sollte im allgemeinen Fixiermittel und Waschung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
gold– Palladium	Ted Pella, Inc.	91212
Silber leitfähiger Klebstoff 503	Elektronenmikroskopie	12686-15
Whatman Nukleporenbahn-geätzte Membranen; Ø 25 mm, Porengröße 8 μ m, Polycarbonat	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; Ø 25 mm, Porengröße 0,8 μ m, Polycarbonat, schwarz	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; Ø 25 mm, Porengröße 0,2 μ m, Polycarbonat	Sigma	WHA110606
Aluminium-Wiegeschale	Fisher Scientific	08-732-100
Aluminium-Montage-Stutzen (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
Aluminium-Montage-Stutzen (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Klebe-Stutzen	Electron Microscopy Sciences	76760
leitfähige Kohlenstoff-Klebelaschen	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 Medien	Kultursammlung von Algen an der University of Texas in Austin	https://utex.org/products/f_2-medium	Keine Katalognummer angegeben - siehe Link
AF6 media	Bigelow - Nationales Zentrum für Marin, Algen und Mikrobiota	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	Keine Katalognummer angegeben - siehe Link
Boden Wasser Medium	Carolina Biological Supply Company	153785
Polyethylenglykol tert-octylphenylether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	Keine Katalognummer angegeben - siehe Link
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	Das Unternehmen scheint dieses Modell nicht mehr zu verkaufen