Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Abstract

Chromatin, die eine lange Kette von Nukleosom Untereinheiten ist, ist ein dynamisches System, das für solche kritischen Prozesse ermöglicht, als DNA-Replikation und Transkription, nehmen in eukaryotischen Zellen. Die Dynamik der Nukleosomen ermöglicht den Zugriff auf die DNA von Replikation und Transkription Maschinen und kritisch zu den molekularen Mechanismen Chromatin Funktionen trägt. Einzelmolekül-Studien wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) imaging trugen erheblich zur unser gegenwärtiges Verständnis der Rolle der Nukleosom Struktur und Dynamik. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Schritte, die es ermöglicht hochauflösende AFM bildgebende Verfahren, die strukturelle und dynamische Eigenschaften der Nukleosomen zu studieren. Das Protokoll wird illustriert durch AFM Daten für das Zentromer Nukleosomen bei denen Histon H3 mit seinen Amtskollegen Zentromer Protein A (CENP-A) ersetzt wird. Das Protokoll beginnt mit der Montage der Mono-Nukleosomen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode. Die Vorbereitung des Glimmer Substrats funktionalisiert mit Aminopropyl Silatrane (APS-Glimmer), die für das Nukleosom-Bildgebung verwendet wird ist von entscheidender Bedeutung für die AFM-Visualisierung von Nukleosomen beschrieben und das Verfahren, das Substrat vorzubereiten wird erläutert. Nukleosomen hinterlegt auf der APS-Glimmer-Oberfläche werden zuerst abgebildet mit statischen AFM, die eine Momentaufnahme der Nukleosom Bevölkerung erfasst. Aus Analysen dieser Bilder Parameter wie die Größe der DNA umwickelt die Nukleosomen gemessen werden und dieser Prozess ist auch detailliert. Die Time-Lapse AFM bildgebende Verfahren in der Flüssigkeit ist für die High-Speed-Zeitraffer-AFM, die mehrere Frames erfassen können beschrieben Nukleosom Dynamik pro Sekunde. Schließlich ist die Analyse der Nukleosom Dynamik ermöglicht die quantitative Charakterisierung der dynamischen Prozesse beschrieben und illustriert.

Introduction

In eukaryotischen Zellen ist DNA hoch verdichteten und in Chromosomen organisierte. ¹ die erste Ebene der DNA-Organisation innerhalb eines Chromosoms ist die Versammlung der Nukleosomen welche 147 bp DNA ist ein Histon Octamer Kern fest umwickelt. ^{2 , 3} Nukleosom Partikel montieren auf einem langen DNA-Molekül bilden ein Chromatin-Array, dann organisiert wird, bis eine kompakte Chromosom Einheit gebildet wird. ⁴ die Demontage des Chromatins Zugriff auf kostenlose DNS durch wichtige zelluläre Prozesse wie gen-Transkription und Genom-Replikation, was darauf hindeut....

Protocol

1. kontinuierliche Verdünnung Montage von Mono-Nukleosomen

1. Generieren und reinige ein ca. 400 bp DNA Substrat, das ein-zentrierten Widom 601 Nukleosom Positionierung Sequenz enthält. ⁵⁵
   Hinweis: Um die unerwünschten Bildung von di-Nukleosomen beschränken, jede 'Arm' flankieren die Positioniervorgang sollte nicht mehr als ~ 150 bp.
   1. Verwenden Sie Plasmid pGEM3Z-601 sowie die gestalteten Primer und verstärken Sie die Substrat-DNA mittels PCR. Für die 423 bp-Substrat mit 122 und 154 bp Armlängen hier verwendet, verwenden Sie vorwärts (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3 ") und rückwärts (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3") Primer.
   2. Fü....

Results

Mono-Nukleosomen wurden zunächst für AFM vorbereitet bildgebende Untersuchungen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode der Montage (Abbildung 1). Die vorbereiteten Nukleosomen wurden dann überprüft mit diskontinuierlichen SDS-PAGE (Abbildung 2). Eine Glimmer-Oberfläche wurde als nächstes funktionalisiert mit APS, die Nukleosomen an der Oberfläche erfasst und gleichzeitig einen reibungslosen Hintergrund für hochauflösende Bildgebung (A.......

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll ist eher einfach und hoch reproduzierbare Ergebnisse liefern, obwohl ein paar wichtige Themen hervorgehoben werden können. Funktionalisierten APS-Glimmer ist ein wichtiger Substrat für immer zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Eine hohe Stabilität der APS-Glimmer ist eines der wichtigsten Merkmale dieses Substrat, das ermöglicht eine bildgebende Substrat für den Einsatz vorbereiten, die mindestens zwei Wochen nach Zubereitung verwendet werden können. ⁵⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primer	IDT, Coralville, IA	Custom Order	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
Polymerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Katalognummer für 200 Einheiten
PCR-Aufreinigungskit	Qiagen, Hilden, Deutschland	28104	Katalognummer für 50 Stück
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Katalognummer für 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Katalognummer für 500 g
(CENP-A/H4)2, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	Katalognummer für 50 ug
H2A/H2B, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	Katalognummer für 50 ug
H3 Octamer, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	Katalognummer für 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte-Kit, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Katalognummer für 10 Geräte
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Katalognummer für 500 mg
Amicon Ultra-0.5  ml-Zentrifugalfilter	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Katalognummer für 8 Geräte
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Katalognummer für 25 mL
Tricin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Katalognummer für 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Katalognummer für 1 kg
Ammoniumpersulfat (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Katalognummer für 10 g
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Katalognummer für 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Katalognummer für 5 mL
4x Laemmli Protein-Probenpuffer für SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules,	CA 1610747	Katalognummer für 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Katalognummer für 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Katalognummer für 500 μl
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Katalognummer für 1 L
Vliesstoff-Reinraumtücher: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muskovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grade-1
Aminopropylsilatran (APS)	Synthetisiert wie beschrieben in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Katalognummer für 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 AFM-Sonde (für statische Bildgebung)	Bruker AFM-Sonden, Camarillo, CA
MSNL-10 AFM-Sonde (für Standard-Zeitraffer-Imaing)	Bruker AFM-Sonden, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Katalognummer für 2 g
Tube MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Katalognummer für 100 g
Millex-GP Filter, 0,22  &Mikro; m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Katalognummer für 10 Geräte
BL-AC10DS-A2 AFM-Sonde (für HS-AFM)	Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
Mischung FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
MultiMode-Rasterkraftmikroskop	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornien
Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan