Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

RNA-Viren bilden eine genetisch vielfältige Bevölkerung, bekannt als Quasispezies¹, wegen deren Mutationsrate,² , der höher ist als die DNA-basierten Organismen. Bevölkerungsstruktur in Quasispezies ist die Bevölkerung genetische Faktoren, wie Mutation, Selektionsdruck und Gendrift betroffen. Spannungen in einem einzigen genetischen Abstammung können unterschiedliche Phänotypen wegen der genetischen Vielfalt zeigen. Rachmadi Et Al. zeigte beispielsweise, dass freies Chlor Empfindlichkeit anders unter murinen Norovirus Stämmen war, die aus einem Plaque-gereinigte Stamm S7-PP3³entstanden.

Rotaviren (Gattung Rotavirus in Familie Reoviridae) sind unbehüllte ds RNA-Viren bilden Quasispezies². Neben der oben beschriebenen Bevölkerung Erbfaktoren betrifft Genom Reassortment die genetische Vielfalt der Rotavirus, da dieses Virus 11 segmentierten Genome⁴hat. Rotaviren verursachen Durchfall vor allem bei Säuglingen und Säuglingssterblichkeit im Jahr 2013 wurden über 250.000⁵geschätzt. Zwei Impfstoffe sind in mehreren Ländern im Einsatz und haben sich als wirksam bei der Verringerung der Belastung von Rotavirus-Infektion, aber einige Forscher diskutieren jetzt die Anwesenheit von Impfstoff-Flucht durch Mutation entstehende Variationen^{6,7,8, 9}. die Charakterisierung dieser Mutanten ist wichtig, die Impfstoff-Escape-Mechanismen zu verstehen.

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für zwei Tests zur Bewertung der spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus um die phänotypische Unterschiede zwischen den Sorten/Mutanten zu verstehen. Die Wachstumskurve der Rotaviren wurde in vorherigen Berichten¹⁰vorgestellt, aber Wachstumsparameter wie spezifischen Wachstumsrate sind in der Regel nicht gemessen. Eine Zelle-Bindung-Assay durchgeführt umfasst bisher immunofluorescent staining Technik¹¹. Wir zeigen hier einfachere Methoden der Nutzung des Plaque-Assay und RT-qPCR, die uns erlauben, den Unterschied in der viralen Phänotypen quantitativ zu diskutieren. Diese Methoden eignen sich für die Charakterisierung der Rotavirus Phänotypen und können schließlich dazu beitragen, den Bau neuer Impfstoffe für mehrere Genotypen.

1. mittlere Vorbereitung

1. Um ein Zellkulturmedium (Serum-haltigen Mittel) zu machen, fügen Sie 4,7 g des Adlers MEM Pulver zu 500 mL destilliertem Wasser hinzu. Autoklaven bei 120 ° C für 20 Minuten und lassen Sie die mittlere auf Zimmertemperatur abkühlen. Hinzufügen von fetalen Rinderserum (Endkonzentration: 10 %), L-Glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1 %) und Natriumbicarbonat (1,125 g/L). Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat.
2. Bereiten Sie das serumfreien Medium für die Ausbreitung des Virus wie in Schritt 1.1, aber ohne die fötalen Rinderserum beschrieben. Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat.
3. Sterilisieren Sie für die Plaque-Assay 100 mL des Adlers MEM Medium (Phenol-rot-haltigen) durch Autoklavieren. Lassen Sie das Medium auf Raumtemperatur abkühlen, und fügen Sie dann 2 % FBS, 2 % Penicillin-Streptomycin, 4 mM L-Glutamin und 2,25 g/L Nahco3₃. Shop bei 4 ° C.
4. Sterilisieren Sie für die Plaque-Assay 100 mL 2,5 % Agarose-Gel von Autoklaven. Bereiten Sie das Gel am selben Tag, den die Plaque-Assay durchgeführt wird. Speichern Sie das Gel bei 47 ° C im Wasserbad.

2. die Zellkultur

1. Ein Cryotube mit MA104-Zell-Linien aus dem Flüssigstickstoff-Behälter zu entfernen. Legen Sie die Cryotube in einem Wasserbad bei 37 ° C Auftauen der Zellen. 20 mL Serum-haltigen Medium in einem T75 Kolben 1 mL Zellsuspension hinzufügen. 2 oder 3 Tage inkubieren Sie die Küvette in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ .
   Hinweis: Die endgültige Zellkonzentration in der Suspension ist etwa 10⁶ Zellen/mL.
2. Sobald die Zelle Monolage 80 % Konfluenz erreicht, den Überstand zu entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 5 mL 1 x Dulbeccos PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung).
3. 4 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben und Inkubation bei 37 ° C für 5 min um die Zellen aus der Flasche zu lösen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 190 X g für 5 min.
4. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der gebeizte Zellen (10⁶ ) in 1 mL Serum-haltigen Mittel bereit in 1.1. Die resuspendierte Zellen bei 100fach verdünnt mit dem Medium.
5. Geben Sie 3 mL verdünnter Zellsuspension in jedem 6-Brunnen (für die Plaque-Assay) oder 24-Well-Platten (für die Zelle-Bindung-Assay), beziehungsweise. 2 oder 3 Tage inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf.
   Hinweis: T75 Kolben eignet sich der Zeitverlauf Proben zu sammeln, weil das Probenvolumen des Überstands (1 mL) im Vergleich zum Gesamtvolumen überstand (30 mL) ignoriert werden kann. Unterdessen ist die infektiöse Titer des Virus in jedem Überstand der Plaque-Assay gemessen die in der Regel durchgeführt wird, mit einer 6-Well-Platte. Eine 24-Well-Platte ist für die Zelle-Bindung-Assay genutzt werden.

3. spezifische Wachstumsrate von Rotavirus

Hinweis: Rhesus-Rotavirus (RRV, Genotyp: G3P[3]) ist in diesem Protokoll verwendet, weil RRV schnell und einfach Plaques mit MA104 Zellen bilden kann.

1. Ort ein Röhrchen mit 1 mL der Suspension Virus (10⁷ Pfu/mL) in einem serumfreien Medium gespeichert bei-80 ° C in einem Wasserbad bei 37 ° C Auftauen. 1 mL der Virus Aussetzung (endgültige Trypsin Konzentration ist 4 µg/mL) und dann Wirbel fügen Sie 1 µg/µL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse hinzu. Inkubieren Sie die Virus-Aussetzung bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf für 30 min.
   Hinweis: Trypsin aus anderen Quellen verwendet werden, aber die Wirkung auf Rotaviren Infektiosität muss vorab getestet werden.
2. Verdünnen Sie die aktivierte Virus-Suspension mit einem serumfreien Medium die Multiplizität der Infektion (MOI) auf 0,1 Pfu/Zelle anpassen.
3. Hinzufügen 1 mL verdünnten Virus Suspension MA104 Zelllinien (80 % Zusammenfluss) in einem T75 Kolben 3 Tage nach der Beschichtung (2.1) Zelle, Inkubation bei 37 ° C für 1 h und schütteln der Flasche alle 15 min.
4. Fügen Sie dann 30 mL 0,13 µg/mL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse in den Kolben-haltigem serumfreien Medium. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf.
5. Sammeln Sie 1 mL der Überstand in den Kolben bei 0, 6, 12, 18, 24 und 36 (bzw. 48) h nach der Infektion (Hpi) und ersetzen Sie den Überstand in den 1,5 mL Röhrchen mit einer Pipette zu.
6. Das Einfrieren (-80 ° C) führen und bei 37 ° C Zyklus dreimal in einem Wasserbad schmelzen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.600 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand zu sammeln.
7. Filtern des Überstands mit einem destillierten 0,2 µm-Filter, die Zelle Bruchteil zu entfernen. Lagern Sie der Überstand-80 ° C im Kühlschrank, bis die Plaque-Assay für die Messung der Virustiter zuweisen.
8. Legen Sie die Röhrchen mit den gesammelten überstand (Schritt 3.5) in einem Wasserbad bei 37 ° C. Eine 1 mL 10-divisibel verdünnten Probe 4 µg/mL Trypsin hinzu und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
9. Während der 30 min Inkubation in 3,8 zunächst die Plaque-Assay für die Messung der Virustiter von Zeit Kurs Proben (Schritt 3,5) erreicht, waschen Sie die MA104 Zellen zweimal in einem 6-Well-Platte mit 2 mL 1 X PBS nach dem Entfernen der Serum-haltigen Medium.
10. Seriell Verdünnen der inkubierten Proben mit einem serumfreien Medium und 1 mL der verdünnten Probe in jede Vertiefung zu impfen. Brüten Sie die Platte für 90 min bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigten Dampf, und schütteln Sie die Platte alle 15 min.
11. Entfernen Sie nach der Inkubation das Inokulum aus 6-Well-Platte. Das Medium vorbereitet (Schritt 1.3) fügen Sie 4 µg/mL Trypsin hinzu. Geben Sie sanft aber sofort 3 mL des Mediums gemischt mit Agarosegel (das Verhältnis ist 1:1) in jedem.
12. Lassen bei Raumtemperatur für mehr als 10 min (bis das Agarosegel fest wird) und inkubieren Sie 2 Tage bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf.
    Hinweis: Gießen Sie das Medium gemischt mit Agar vom Rand des Brunnens.
13. Fügen Sie 1 mL der 0,015 % neutrale rote Lösung verdünnt mit 1 X PBS in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf. Entfernen des Farbstoffs nach 3 h und 1 Tag bei 37 ° C und 5 % CO₂ unter der gesättigte Dampf inkubieren.
14. Am nächsten Tag, die Anzahl der Tafeln in jede Vertiefung und berechnen der Pfu/mL. Überprüfen Sie sorgfältig die Zelle Zusammenfluss vor der Plaque-Assay um die Plakette Zahlen zu gewährleisten.

(4) Zelle-Bindung-Assay

Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der Gilling Bericht¹³.

1. Fügen Sie 1 µg/µL Trypsin aus Schweinen Bauchspeicheldrüse zu 1 mL des Virus Aussetzung (endgültige Trypsin Konzentration ist 4 µg/mL) und dann Wirbel hinzu (auf die gleiche Weise wie in 2.1). Verdünnen Sie die Virus-Suspension mit einem serumfreien Medium MOI 1 Pfu/Zelle anpassen.
2. Dann waschen Sie die MA104 Zellen zweimal auf 24-Well-Platte mit 1 ml Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS; 2,53 g/L Tris-base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0,046 g/l Na₂HPO₄ , 1 L mit destilliertem Wasser zu erreichen).
3. 100 µL der verdünnten Virus Aussetzung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Zellen zu impfen, und bei 4 ° C für 90 min, mit sanft schütteln alle 15 min inkubieren.
4. Das Inokulum Virus zu entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 1 mL TBS. Um die doppelsträngige RNA (ds) das Rotavirus zu extrahieren, hinzufügen, 140 µL 1 x PBS und 560 µL RNA-Extraktionspuffer (siehe Tabelle der Materialien) in jede Vertiefung. Mischen Sie angemessen mit einer Pipette (über 10 X oder bis der Dunst oder Verunreinigungen der Zellen in den Puffer nicht gesehen werden kann).
5. Legen Sie nach der Genesung der doppelte gestrandeten RNS (DsRNA) laut Protokoll des Herstellers die 1,5 mL Röhrchen mit der DsRNA-Extrakt auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min zu denaturieren DsRNA, und dann sofort die Rohre auf Eis legen und inkubieren Sie für mehr als 2 min.
6. Synthese die cDNA mithilfe einer reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien). Ein PCR-Röhrchen mit 16 µl Gemisch (Tabelle 1) 4 µL denaturierten virale RNA-Lösung hinzu und mischen Sie es sorgfältig mit einer Pipette um nicht Bläschen zu erzeugen. Spin-down der Rohre.
7. Durchführen der reversen Transkription mit einem Thermocycler unter der Bedingung, die in Tabelle 2dargestellt. Wenn die cDNA nicht sofort verwendet wird, speichern Sie die PCR-Röhrchen mit der cDNA bei-20 ° C bis zu 1 Jahr.
8. Für quantitative PCR Primer verwenden (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3")¹⁴ und einer Sonde einfügen einen Quencher (qPCR Sonden; 5'- / FAM/ATGAGCACA/Durstlöscher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/3"), targeting der 963 – 1049 Region NSP3 Genomabschnitt Rotavirus (ST3 Stamm, GenBank: X81436).
   Hinweis: Quencher ist in der Sonde, entworfen von Zeng Et Al.¹⁴ eingefügt.
9. Verdünnen Sie das standard Plasmid seriell (10¹ bis 10⁶ Kopien/mL) mit PCR grade Wasser der qPCR-Mischung (Tabelle 3) und den master-Mix (20 µL/Probe) für qPCR nach Tabelle 4zu machen.
10. Der Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte 20 µL des master Mix hinzu, und mischen Sie dann 5 µL cDNA Proben oder 5 µL des standard Plasmids durch Pipettieren 10 Mal. Starten Sie die Reaktion der qPCR-System gemäß den Bedingungen, die in Tabelle 4dargestellt.
11. Zur Berechnung des Rotavirus Genoms gebunden an die Zelloberfläche MA104 durchführen Sie linearen Regression zwischen Ct-Werte und die bekannten Genom ein standard Plasmid und schätzen Sie die Probennummer Genom. Dann berechnen Sie das Verhältnis von Virion Zahlen Bindung an Zellen (G-_t) mit denen in der ersten Inokulum (G₀).

Ein Überblick über zwei Protokolle zu den spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindung Assay Plaque-gereinigte RRV Stämme zeigt in Figur 1A und 2A.

In der Probe für die spezifischen Wachstumsrate erreicht die endgültige Virustiter mehr als 107 Pfu/mL auf den T75 Kolben zu propagieren. Wenn die maximale Konzentration niedriger als 107 Pfu/mL ist, kann die MA104 Zelle nicht konfluierende geworden oder RRV war nicht gut von Trypsin aktiviert. Einige Modelle stehen zur Abschätzung der spezifischen Wachstumsrate über die infektiöse Gerätedaten. In diesem Protokoll wird die modifizierte Gompertz Modell12 als Beispiel verwendet;

wo N0 (104 Pfu/mL in dieser Studie) und Nt (104 108 Pfu/ml) sind die infektiösen Virustiter (Pfu/mL) bei 0 und t (Beispiel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) Hpi, bzw. A ist der asymptotischen Wert [Log (N∞/n0 )] (Beispiel: 3 bis 4), µ ist der spezifischen Wachstumsrate [1/h] und e ist die Napier konstante λ beträgt die Verzögerung [h]. Modellparameter ergeben sich durch die Solver-Funktion der Analyse-Software, die die Summe der Quadrate der Differenz zwischen den beobachteten und modellierten Werten minimiert. Im Beispiel in Abbildung 1 bder spezifischen Wachstumsrate (µ) wird auf geschätzt [1/h] 0.197 und die Verzögerung (λ) beträgt 6,61 [h] mit der zuletzt quadratische Methode um ein modifiziertes Gompertz-Modell und die relative Virustiter über die stationäre Phase nach der ursprünglichen Titer ( Log-Skala) (A) ist 3.15 [Log (N∞/n0)]. Wir haben insgesamt 6 Rotaviren Klone getestet, und die geschätzten Werte der spezifischen Wachstumsrate reichte von 0,19 bis 0,27 [1/h]. Diese geschätzten Werte verlässlich sind, da der Koeffizient der Entschlossenheit Werte in der Modell-Armatur mehr als nur 0,98 ist.

RRV Virionen binden an Zelloberflächen waren ca. 103 Kopien/mL (verbindliche Effizienz war ca. 1 %) bei der Verwendung einer 24-Well-Platte für die Zelle-Bindung-Assay (Abb. 2 b). Der Test erfolgt in der Regel drei Mal für jede Probe, und einige Probleme wie über Wasch- und unzureichende Aktivierung des RRV von Trypsin können auftreten, wenn eine große Varianz in der Kopienzahl in einer Probe beobachtet wird. Der Ct-Wert von mehr als ca. 36,0 qPCR ist nicht besser und wird betrachtet, um unter einer Nachweisgrenze in unserem qPCR-Zustand.

Tabelle 1: Meister Mischen Zusammensetzung für die cDNA-Synthese des Rotavirus Genoms.

Tabelle 2: Reaktion Zustand für die cDNA-Synthese des Rotavirus Genoms.

Tabelle 3: Master Mischen Zusammensetzung für die quantitative PCR Rotavirus ein Genom.

Tabelle 4: Reaktion Bedingung für die quantitative PCR Rotavirus ein Genom.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Schätzung der Rotavirus-Wachstum und die Wachstumskurve Rotavirus. (A) die infektiöse Einheit Rotavirus ist mit dem Plaque-Assay gemessen. (B) die Kurve (blaue Linie) wurde durch die veränderte Gompertz-Modell basierend auf Beobachtungsdaten in unserem Labor (weißer Kreis) angenähert. Die spezifischen Wachstumsrate [µ]; [h-1], 0.197 lag Periode (λ); 6,61 [h], die relative Virustiter über die stationäre Phase nach der anfänglichen Titer (Log-Skala) (A); 3.15 [Log (N∞/n0)]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Schematische Übersicht und repräsentatives Ergebnis der Zelle-Bindung-Assay fünf RRV Stämme von Plaketten in unserem Labor gereinigt. (A) A Kultur Zellplatte mit Rotaviren geimpft wird bei 4 ° C für die Hemmung der Virus-Invasion in Zellen inkubiert. Nach Inkubation und entfernen die ungebundenen Viruspartikel auf Zellen die Anzahl der Genome aus gebundenen Viruspartikel an der Zelloberfläche mit RT-qPCR zu quantifizieren. (B) das Ergebnis der Zelle-Bindung-Assay wurde als verbindliche Wirkungsgrad (%), die das Verhältnis von gebundenen Viruspartikel an die Anwesenden in das Inokulum wurde angezeigt. Mutige Bar: Median, Ende der Boxen: Quartil Abweichung, Zeilenende: maximale und minimale. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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