Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Md A. Hakim; Erik J. Behringer

doi:10.3791/58832

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Methodenartikel

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

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DOI:

10.3791/58832

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20. Januar 2019

Md A. Hakim¹ , Erik J. Behringer¹

¹Department of Basic Sciences, Loma Linda University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Zusammenfassung

Zerebralen Arterien und ihre jeweiligen Mikrozirkulation liefern Sauerstoff und Nährstoffe an das Gehirn über Blut Durchflussregulierung. Endothelzellen säumen das Lumen der Blutgefäße und Befehl Änderungen im vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen. Primäre Endothel-abhängige Signalwege der Hyperpolarisation des Membranpotentials (V_m) und Stickoxid-arbeiten in der Regel parallel zur Vermittlung Vasodilatation und steigern somit die Durchblutung. Obwohl integrale zur Koordinierung der Vasodilatation über mehrere Millimeter der vaskulären Länge wurden Bestandteile der Endothel-derived Hyperpolarisation (EDH) historisch schwierig zu messen. Diese Komponenten des EDH beinhalten intrazellulären Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_ich erhöht und anschließende Aktivierung von klein - und Mittelstufe Leitwert Ca^{2 +}-aktiviert K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) Kanäle.

Hier präsentieren wir Ihnen eine vereinfachte Darstellung der Isolation des frischen Endothel von Maus zerebralen Arterien; gleichzeitige Messung von Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ichund V_m mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.; und eine kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Hintere Hirnarterien aus dem Kreis von Willis entfernt die hinteren kommunizieren und die Kameraausrüstung Arterien frei. Enzymatische Verdauung von gereinigten hinteren zerebralen arteriellen Segmente und anschließenden Verreibung erleichtert die Entfernung der Adventitia, perivaskuläre Nerven und glatten Muskelzellen. Resultierende hintere zerebrale arterielle Endothelzellen "Röhren" sind dann unter dem Mikroskop gesichert und mit einer Kamera, Photomultiplier Tube, und ein bis zwei Stromzähler unter kontinuierlicher Superfusion untersucht. Gemeinsam kann diese Methode gleichzeitig Änderungen in Endothelzellen [Ca^{2 +}]_ich und V_m in diskreten zellulären lagen, neben der Verbreitung des EDH durch Lücke Kreuzungen bis zu Millimeter Abstand entlang der intakten messen Endothel. Diese Methode wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zugrunde liegenden Blut fließen Regulationsmechanismen im normalen und kranken Gehirn endothelialen Gehirnfunktionen ergeben.

Einleitung

Blutfluss im Gehirn wird durch die Koordination der Vasodilatation bei zerebralen Arterien und Arteriolen in vaskulären Netzwerken¹geregelt. Endothelzellen Futter zerebralen Arterien Befehl Widerstandsänderungen vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen¹^,²^,³. Insbesondere während der Endothel-derived Hyperpolarisation (allgemein bekannt als EDH) intrazelluläre Ca^{2 +}([Ca^{2 +}]_ich) und elektrische Signalisierung in Endothelzellen koordinieren Vasodilatation unter den Endothelzellen u....