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Methodenartikel

Spermiengewinnung differenzielle Qualität mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

20.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/58833

⸱

29. November 2018

 ,  , 
1Department of Poultry Science, University of Georgia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Beitrag wollen wir die Leistung der Dichte-Gradienten-Zentrifugierung-Technik und deren Anwendung in Sperma-Physiologie-Forschung beschreiben.

Zusammenfassung

Bei der sexuellen Fortpflanzung eines männlichen Gameten oder Samenzelle verschmilzt mit einer weiblichen Gameten Befruchtung herbeizuführen. Jedoch müssen eine große Anzahl von Spermien mit Düngung Fähigkeit zur Interaktion mit einem weiblichen Gameten zur Befruchtung zu gewährleisten. Als solche ist die befruchtende Fähigkeit der einzelnen Spermien entscheidend für die erfolgreiche Reproduktion. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung ist seit mehreren Jahrzehnten als reproduzierbare, schnell, effizient, effektiv und extrem anpassungsfähig Methode, nur qualitativ hochwertige Spermien in assistierten Reproduktionstechnik zu verwendenden sammeln verwendet worden. Die Protokolle, die wir hier beschriebenen konzentrieren sich auf die Nutzung der diskontinuierlichen Percoll Dichte Gradienten Zentrifugation (PDGC) Technik, drei verschiedene Populationen von Hahn Spermien durch ihre Qualität zu isolieren. Wir waren in der Lage, nieder-, Mittel- und qualitativ hochwertige Spermien zu sammeln. Wir beschreiben auch reproduzierbare Protokolle, die bestimmende Fruchtbarkeit Potenzial der Spermien zur Folge haben, durch die Bewertung ihrer Lebensfähigkeit, Mobilität und Durchlässigkeit. Sammlung von Spermien durch ihre Qualität mit PDGC Technik würde nützlich sein, um präzise und gründlich charakterisieren Spermien mit potenziellen differenzielle Fruchtbarkeit.

Einleitung

Bei Wirbeltieren männlichen Gameten intensiven Selektionsdruck zu unterziehen; von einem männlichen reproduktiven Fitness ist daher ausschlaggebend für eine erfolgreiche Befruchtung zu erreichen. Männer bestimmten Wirbeltierarten muss Samenzellen in großen Mengen und von ausreichender Qualität zu produzieren, um den Bedürfnissen der Befruchtung. Spermien haben eine Spermien-Kopf und eine Geissel, sind die meisten polarisierten Zellen im Körper. Sie sind auch in der Qualität der Spermien sehr heterogen (Leben und tot, morphologisch normal und abnormal und unbeweglich, niedrigen mobile und hohe mobile), die offenbart sich durch die breite Vielfalt in reproduktive Effizienz der Männchen. Je größer der Anteil der qualitativ hochwertigen Spermien, desto weniger die Anzahl der Paarungen erforderlich, um erfolgreich die Eizelle zu befruchten. Um Fruchtbarkeit zu erreichen, setzen morphologisch normale Spermien jedoch auf treibenden Kräfte von ihren Flagellen, den Ort der Befruchtung sowie hinsichtlich der Zona Pellucida1 eindringen erreichen (ZP; bei Säugetieren) oder innere Perivitelline Layer2 (IPVL; bei Vögel und Reptilien) der Eizelle nach natürliche Paarung oder künstliche Befruchtung (AI). Bestimmung der Spermien Qualität ist notwendig für den Einsatz in Techniken der assistierten Reproduktion3 (Kunst) und Auswahl der Zuchtrüden in AI zu verwendenden Programme4. Auf der anderen Seite stützt sich der Erfolg der Kunst einzig und allein auf die genaue Bewertung der Spermienqualität. Eine Reihe von Labortests wurden entwickelt, um die funktionellen Eigenschaften der Samenzellen zu bestimmen. Die wichtigsten Parameter sind Spermien Morphologie, Rentabilität, Mobilität, Rechtsfähigkeit (aviäre Spermien erfordern keine Rechtsfähigkeit5), Akrosom Reaktion (AR; Exozytose und Freisetzung von einem proteolytischen Enzym aus dem Akrosom der Spermien-Kopf), Sperma Eindringen von ZP oder IPVL und Düngung6,7,8,9,10,11. Maßnahmen der Fruchtbarkeit allein bieten keine genaue Bewertung der befruchtende Fähigkeit der Spermien Bevölkerung11. Maßnahmen der Befruchtung einer Eizelle im Vorfeld mehrere Ereignisse ermöglichen eine angemessene Vertretung der Leistung des einzelnen Spermatozyten7.

Die Methodik zur Messung der Spermienfunktion ist in erster Linie artspezifisch. Beispielsweise sind in Vogelgrippe Spermien, Nachhaltigkeit, Mobilität und Eindringen von IPVL die am häufigsten verwendeten Parameter zur Beurteilung der Spermien Qualität8,11,12. Die Anzahl der Leben Spermien im Ejakulat spielt eine entscheidende Rolle für das Überleben der Spermien, da die Anwesenheit einer großen Anzahl von Toten Spermien in der Samenflüssigkeit die Qualität des Spermas beeinflusst. Dies fördert die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in der Samenflüssigkeit und verursacht oxidativen Schäden an live Sperma13. Sperma Mobilität, die Fähigkeit zur flagellar Beweglichkeit der Vogelgrippe Spermien gegen Widerstand bei Körpertemperatur, ist bekanntermaßen eine direkte Rolle bei der Befruchtung8herbeizuführen. Es ist allgemein bekannt, dass Mobilität positiv mit der Fruchtbarkeit korreliert ist und daher eine primäre Determinante der Fruchtbarkeit8 ist. Eine mobile Spermien müssen jedoch auch die Fähigkeit zu unterziehen ein AR und dringen in die IPVL11. IPVL Penetration Tests berücksichtigen für jeden Samenzellen, die in den Prozess der Befruchtung11beteiligt ist.

Bei der Anwendung der Kunst Ejakulat wird in der Regel verarbeitet, um die Konzentration von qualitativ hochwertigen Spermien maximieren und minimieren Konzentration von minderwertige Spermien. Nach der Entnahme des Samens kann der Anteil an qualitativ hochwertigen Spermien durch Spermien Trennverfahren in Industrie und Forschung Praxis gebräuchliche angereichert werden. Viele dieser Verfahren wurden entwickelt, alle mit jeweiligen vor- und Nachteile, aber alle nutzen die Heterogenität der Spermien nur die Spermien mit hohen befruchtende Fähigkeit zu sammeln. Diese Verfahren umfassen Sperma Migrationsmethoden, Einhaltung der Spalte Filtration und Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. unter den verfügbaren Techniken, DGC hat sich als sehr einfache, wiederholbare, kostengünstige und effiziente isolieren die maximale Menge an qualitativ hochwertigen Spermien für den Einsatz in der Kunst mit dem Ziel der Maximierung der Wahrscheinlichkeit der Befruchtung14 , 15. Darüber hinaus DGC ist nicht schädlich für die Spermien Zellmembran. Im Gegensatz dazu Sperma Migrationsmethoden sammeln nur schrittweise mobile Spermien18,19, aber die Menge der Spermien gesammelt ist sehr niedrig, so dass es ineffizient sammeln große Mengen an Sperma18, 20. Einhaltung der Spalte Filtration ist sehr effizient bei der Filterung hochmobile Sperma Sperma17; Allerdings ist es eher schädlich für Spermien Membranen20,21.

In der DGC-Technik ist das am häufigsten verwendete Substrat für die Generierung der Dichtegradient Percoll, bestehend aus kolloidale Silica-Partikel in Polyvinylpryrolidone beschichtet. Percoll Dichte-Gradienten-Zentrifugierung (PDGC) kann entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich, sondern ein diskontinuierlicher Verlauf wird am häufigsten für die high-Yield Isolierung von hochmobile Sperma13,16,20. Bei einem unterbrochenen Farbverlauf schwebt niedrigerere Dichte Medien über höhere Dichte Medien, erstellen einen Farbverlauf, der in der Dichte von oben nach unten aus einem konischen Rohr erhöht. Dies schafft Grenzen an der Schnittstelle zwischen den beiden Medien unterschiedlicher Dichte. Die Effizienz der PDGC ergibt sich aus zwei Faktoren: (1) die treibenden Fähigkeit der einzelnen Samenzellen und (2) die Tendenz der Spermien mit hoher Standsicherheit, haben eine erhöhte Dichte. Spermien mit höherer Mobilität können besser zu überqueren, von geringer Dichte Medien und dringen in eine höhere Dichte Medien. Geringere Mobilität Spermien sind eher an der Grenze erstellt durch die Schnittstelle zwischen Medien unterschiedlicher Dichte eingeklemmt werden. Spermien mit hohen Strukturintegrität und Mobilität haben tendenziell eine höhere Dichte als tot, abnorme oder niedrigen mobile Spermien. Wenn Fliehkraft in PDGC angewendet wird, erleichtert dies die Beweglichkeit der Spermien mit unterschiedlicher Dichte an ihren jeweiligen Platz im Verlauf.

In der allgemeinen Praxis nachdem PDGC durchgeführt wurde, das weiche Pellet der Spermien mit potenziellen am unteren Rand das konische Rohr hohe Fruchtbarkeit gesammelt und der Rest wird verworfen. Ein nicht ausgelasteter Vorteil dieser Technik ist jedoch seine Fähigkeit, Spermien in mehrere Gruppen auf die Qualitätsunterschiede zu trennen. Für Forschungszwecke ermöglicht die Trennung von Spermien durch Maß an Qualität unter Verwendung der PDGC-Technik für die Untersuchung der Spermienqualität physiologische, Metabolomic und Proteomic Unterschiede betrifft. Hier wollen wir ausführlich, wie diese Technik verwendet werden kann, trennen Sie Spermien durch Qualität, als auch zeigen diese Unterschiede in der Qualität, unter Verwendung der zuvor festgelegten Eosin-Nigrosin lebenswichtigen Färbung für Rentabilität, Accudenz Assay für Mobilität und Sperma-IPVL Interaktion-Assay für Durchlässigkeit.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Georgia genehmigt.

1. Waschen mit traditionellen Zentrifugation

  1. Phosphat-Pufferlösung (PBS) vorzubereiten. 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 bis 800 mL destilliertem Wasser (dH2O) zugeben. Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 0,1 N HCl und bringen die Lösung 1 L mit dH2O.
  2. Motilität Puffer vorzubereiten. Fügen Sie 6,5 g NaCl, 4,5 g Glukose, 0,444 g CaCl2 und N - Tris-[macht] 11,5 g Methyl-2-amino-Ethanesulfonic Säure (VES), 800 mL dH2O. anpassen den pH-Wert 7,4 mit 1 M NaOH und bringen die Lösung 1 L mit dH2O.
  3. Pipette 0,5 mL des Samens zu einem Polypropylen Microcentrifuge Schlauch. 1,0 mL PBS hinzugeben und vorsichtig mischen.
  4. Zentrifugieren bei 1.500 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und den Überstand verwerfen. Das Sperma Pellet mit PBS Aufschwemmen bis 1,5 mL.
  5. Zentrifuge bei 1.500 x g für 10 min bei RT Aufschwemmen mit Motilität der Spermien pellet Puffer bis zu 0,5 mL.

2. Durchführung der PDGC-Technik

Hinweis: Führen Sie den gesamten Prozess der PDGC bei Raumtemperatur.

  1. Machen Sie 3,0 mL 1,08 g/mL und 1,07 g/mL Percoll-Lösungen in zwei separate Röhren.
    1. Fügen Sie in einem sauberen Reagenzglas 1,712 mL 1,13 g/mL original Percoll bis 0,3 mL 1,5 M NaCl-Lösung. 0,988 mL dH2O und mischen durch sanfte Umkehrung 3,0 mL von 1,08 g/mL Dichte Lösung machen.
    2. Fügen Sie in einem sauberen Reagenzglas 1,482 mL 1,13 g/mL original Percoll bis 0,3 mL 1,5 M NaCl-Lösung. 1,218 mL dH2O und mischen durch sanfte Umkehrung 3,0 mL von 1,07 g/mL Dichte Lösung machen.
  2. In einem sauberen Reagenzglas zu verdünnen Sie 1,0 mL Sperma Probe 1:2 mit 2,0 mL PBS. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren.
  3. 3,0 mL der 1,07 g/mL Dichte Lösung in ein steriles 15 mL konische Röhrchen pipettieren. Pipettieren Sie sorgfältig 3,0 mL der 1,08 g/mL Dichte Lösung unter die 1,07 g/mL Dichte Lösung. Stellen Sie sicher, dass die beiden Schichten nicht mischen. Eine Langform (9 Zoll) Pasteurpipette kann diesen Schritt erleichtern.
  4. Pipettieren 3,0 mL verdünnten Samenprobe überragen die PDG. Um sicherzustellen, dass die Spermaprobe sich nicht mit der PDG vermischt, kippen Sie leicht das konische Rohr mit der PDG in einem Winkel von 45°. Pipettieren der Probe an der Wand des Rohres entlang und lassen Sie es fließen durch die Röhre und über die PDG.
  5. Bereiten Sie eine leere Röhre um die Masse der PDG mit überlagerten Probe entsprechen. Zentrifugieren Sie beide Rohre bei 1500 X g, für 20 min. zu den diskontinuierlichen Verlauf während der Übertragung die Rohre von der Bank an das Gleichgewicht und dann an der Zentrifuge vorsichtig sein.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht die Bremse am Ende der Zentrifugation.
  6. Die Ergebnisse zu beobachten. Sicherstellen Sie, dass drei verschiedene Samen Schichten in der Röhre gebildet haben, wie in Abbildung 1zu sehen.
  7. Isolierte Samen Schichten mit einer Pipette abzusaugen. Sammeln zunächst die oberste Schicht des Samens, der Mitte zweite Schicht und zuletzt die harte Pellets an der Unterseite des Rohres. Übertragen jeweils eine saubere und sterile PolypropylenMicrocentrifuge Schlauch.
  8. Verdünnen Sie jede Probe bis 1,5 mL mit PBS. 1500 X g für 10 min zentrifugieren.
  9. Der Überstand abgießen. Rekonstruieren Sie Sperma Pellet mit Motilität Puffer durch sanfte pipettieren.
    Hinweis: Alternative dichten können verwendet werden, um Ermittler Bedürfnisse anzupassen. Bestimmen Sie Mengen an Zutaten verwendet, mit der folgenden Gleichung, wo V0 Volumen der Besatzdichte Lösung verwendet, V Endvolumen von Lösung gewünscht, p ist Dichte der endgültigen Dichte Lösung gewünscht ist und p0 ist die Dichte der Besatzdichte Lösung:
    Geschwindigkeitskorrekturgleichung, \(v_0 = v \times \frac{p - 1.0058}{p_0 - 1}\), wissenschaftliche Formel.
    Verwenden Sie immer 0,3 mL 1,5 M NaCl in Vorbereitung der Dichte Lösungen entsprechend die NaCl-Konzentration von physiologischer Kochsalzlösung.

3. Bestimmung der Qualität der Spermien

  1. Berechnen Sie die Samenzellenkonzentration22wie zuvor beschrieben.
  2. Durchführen Sie Eosin-Nigrosin lebenswichtigen Färbung als zuvor beschriebenen12 mit den folgenden Änderungen:
    1. Bereiten Sie 100 µL der Sperma-Lösung mit einer Konzentration von 1 x 108 Zellen/mL.
    2. Pipettieren 50 µL der Sperma-Lösung in einem Polypropylen Microcentrifuge Schlauch enthält ein gleiches Volumen der Eosin-Nigrosin Fleck. Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Platz 20 µL gefärbten Spermaprobe an einem Ende einen Objektträger Tropfen und schmieren einheitlich in gewissem Sinne ähnlich wie Blut verschmiert. Trocknen Sie die verschmierten Folien bei Raumtemperatur für 3-5 min an der Luft.
    4. Der Abstrich unter dem Mikroskop zu beobachten. Die Anzahl der live Sperma (kein Fleck) und Tote Spermien (rosa gefärbt) und berechnen den Prozentsatz der live Sperma.
  3. Führen Sie die Accudenz-Assay, wie zuvor für das Huhn-Sperma, Sperma Mobilität8 mit den folgenden Änderungen objektiv beurteilen validiert:
    1. Pipettieren 1,0 mL der Probe 6 % Lösung in Polystyrol Küvetten, wie in Abbildung 2dargestellt. Auf 41 ° c inkubieren
      Hinweis: 41 ° C wird verwendet, um die Innentemperatur einer Henne entsprechen. Die Inkubationstemperatur sollte der weiblichen Fortpflanzungsorgane der untersuchten Spezies entsprechen.
    2. Die vorgewärmten Assay-Lösung mit 100 µL der Samenprobe in einer Konzentration von 5 x 108 Zellen/mL zu überlagern.
    3. Ort der Küvette mit überlagert Spermaprobe im Spektralphotometer. Nehmen Sie den Wert der Extinktion bei 550 nm.
  4. Führen Sie IPVL-Penetration Test wie oben beschrieben11 mit folgenden Änderungen:
    1. Schneiden Sie ein Stück (0,5 x 0,5 cm) nicht germinal Disc Region von intakten IPVL.
    2. Passen Sie die Samenzellenkonzentration bis 4 x 106 Zellen/mL
    3. Inkubieren Sie Sperma in Motilität Puffer mit IPVL in einem kleinen Glas-Fläschchen für 15 min bei 37 ° C, wie in Abbildung 3dargestellt.
    4. Tauchen Sie das IPVL Stück in 3 % NaCl, die Interaktion zwischen IPVL und Sperma zu stoppen.
    5. Montieren Sie das IPVL Stück auf einem Objektträger und Fleck mit Schiff's Reagenz für 10 min nach Fixierung mit 10 % Formalin für 20 s.
    6. Beobachten der IPVL unter dem Mikroskop für erfolgreiche Sperma Löcher eindringen und die Anzahl der alle sichtbaren Löcher pro 0,25 mm2 bei 40 X Vergrößerung.

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Ergebnisse

Die PDGC-Technik führte zu deutliche Trennung der drei Schichten der Spermien durch Maß an Qualität über alle Parameter. Sperma trennt in eine qualitativ hochwertige Schicht unterhalb der höheren Dichte Lösung, ein mittlerer Qualität Schicht zwischen der höheren und niedrigeren Dichte Lösung und eine minderwertige Schicht über der niedrigeren Dichte Lösung. Diese Unterschiede in der Qualität sind deutliche Unterschiede in der Lebensfähigkeit (Abbildung 4), Mo...

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Diskussion

Fruchtbarkeit die Rentabilität der tierischen Erzeugung bestimmt nicht nur, sondern dient auch als ein Mittel der natürlichen Selektion Arten für die Existenz. Die ultimative Funktion einer Samenzelle ist um eine Eizelle zu befruchten. Die Eileiter einer Frau wählt nur die fittesten Spermien zur Befruchtung der Eizelle23,24zu gewährleisten. In-vitro- Untersuchungen ergaben auch eine enge Korrelation zwischen qualitativen Sperma Züge und Befruchtung Erfol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccudenzAccurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USAAN7050
Percoll Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAP7828
Schiff' s ReagenzSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA3952016
TESSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAT1375
Eosin YSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAE4009
NigrosinSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA198285
ST 40R Zentrifuge Thermo Scientific, Waltham, MA, USA75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis SpektralphotometerBeckman Coulter, Brea, CA, USAKein Katalog gefunden
Olympus IX 71 Inverses Fluoreszenz- und PhasenkontrastmikroskopOlympus America Inc., PA, USAKein Katalog gefunden

Referenzen

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