Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Abstract

Lipid Bilayer bieten eine einzigartige experimentelle Plattform für funktionelle Studien der Ionenkanäle, so dass die Prüfung des Kanal-Membran Interaktionen unter verschiedenen Membran Lipid-Kompositionen. Unter anderem hat die Tröpfchen Schnittstelle Bilayer Popularität gewonnen; die große Membran Größe behindert jedoch die Aufzeichnung der elektrischen geringes Grundrauschen. Wir haben festgestellt, dass ein Kontakt Blase Bilayer (CBB)-Methode, die die Vorteile der planaren Lipid Bilayer verbindet und Patch-Clamp-Methoden, wie die Fähigkeit der Lipidzusammensetzung variieren und die Mechanik Bilayer bzw. zu manipulieren. Mit dem Setup für herkömmlichen Patch-Clamp-Experimenten, können CBB-basierten Experimente leicht durchgeführt werden. Kurz gesagt, eine Elektrolyt-Lösung in einer Glaspipette wird in einem organischen Lösungsmittel-Phase (Hexadecan) geblasen, und die Pipette Druck beibehalten wird, um eine stabile Blasengröße zu erhalten. Die Blase ist spontan eine Lipid-Monolayer (reine Lipide oder gemischte Lipide), gesäumt von Liposomen in den Bläschen vorsah. Als nächstes werden die beiden Monolage gesäumten Bläschen (~ 50 µm im Durchmesser) an der Spitze der Glaspipetten für Bilayer Bildung angedockt. Einführung von Kanal rekonstituiert Liposomen in die Blase führt zu die Einbeziehung der Kanäle in der Bilayer, zulassend Einkanal-aktuelle Aufnahme mit einem Signal-Rausch-Verhältnis des Patch-Clamp-Aufnahmen vergleichbar. CBBs mit einem asymmetrischen Lipidzusammensetzung sind leicht gebildet. Der CBB ist wiederholt durch Ausblasen der früheren Bläschen und bilden neue erneuert. Verschiedene chemische und physikalische Störungen (z.B., Membran-Perfusion und Bilayer Spannung) auf die CBBs. hierin auferlegt werden können, präsentieren wir Ihnen das grundlegende Verfahren für CBB Bildung.

Introduction

Für Ionenkanäle ist die Zellmembran nicht einfach ein unterstützendes Material, sondern als Partner für die Erzeugung des Ionen-Fluss. Funktional, die Membran ist ein elektrischer Isolator, in welche, den Ionen Kanäle eingebettet sind, und aller Zellmembranen sind mit einem ruhenden Membranpotential vermittelt. Konventionell, wurde eine willkürliche Membranpotential aus einem Außenkreis verhängt mit dem elektrischer Strom durch die Kanäle gemessen wurde. Diese quantitative Auswertung der Ionen-Fluss an verschiedenen Membran Potenziale offenbart die molekularen Eigenschaften dieser Kanäle, wie ihre ionenselektive Permeation und gating Funktionen¹

Protocol

1. bereiten Sie Liposomen

1. Phospholipide (z.B. 10 mg Pulver) im Chloroform bei einer gewünschten Konzentration (z.B. 10 mg/mL) auflösen.
2. Verdunsten Sie Chloroform.
   1. Ort der Phospholipid-Lösung in ein Rundboden Kolben und es auf einen Drehverdampfer (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gasflasche N₂ verbunden. Drehen Sie die Flasche unter N₂ fließen bei Raumtemperatur bis ein dünne Phospholipid-Film (nach ~ 30 min) erscheint.
   2. Legen Sie die offene Flasche in den Exsikkator gestellt, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Mit der Vakuumpumpe, aspirieren Sie die Innensei....

Results

Eine typische CBB hatte einen Durchmesser von 50 µm (Abbildung 56) und die spezielle Membran-Kapazität im Hexadecan war 0,65 µF/cm². Die Blasengröße wurde willkürlich durch die Intra-Blase Druck gesteuert. Wenn Bläschen für rauscharme Aufnahmen notwendig sind, sollte der Kopfkreis entsprechend klein sein. Beispielsweise sollte der Kopfkreis für eine Blasengröße von 50 µm im Durchmesser, 30 µm.

Discussion

Die CBB-Methode von Lipid Bilayer Bildung basiert auf dem Prinzip eines Wasser-in-Öl-Tropfens, gesäumt von einem monomolekularen Film²⁰. Technisch sind die Verfahren zur Bildung von CBBs einfach, vor allem für Patch-Clamp-Forscher, die Manipulation von Glas Mikropipetten beherrschen. Die elektrophysiologische Setup für die Patch-Clamp ist leicht in der CBB verwendet, wenn zwei Pipette Manipulatoren mit Microinjectors verfügbar sind. Auf der anderen Seite, weil der CBB ein Nachfolger der herkömmlic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholin, Typ IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D-Wandler	Molekulare Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl-Elektrode	Warner Instruments	64-1317
Bad-Ultraschallgerät	Branson	M1800H-J
Kamera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glas Kapillare	Harvard Apparatur	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Loch Gleitglas	Matsunami Glas	S339929
Inverses Mikroskop	Olympus	IX73
Isolationstisch	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Mikromanipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Mikropipettenhalter
n-Hexadecan	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Verstärker	HEKA	EPC800
Pipettenabzieher	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin)	Avanti Polare Lipide	850457
POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin )	Avanti Polare Lipide	850757
POPG (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polare Lipide	840457
Kaliumchlorid	Nacalai	28514-75
Rotationsverdampfer	Iwaki	REN-1000
Bernsteinsäure	Nacalai	32402-05
Vakuumpumpe	Büchi	V-100