Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Unser Immunsystem besteht aus einer Zahl und Vielfalt der immunen Zellen einschließlich der regulatorische T-Zellen (Treg)-Zellen. Treg-Zellen können in zwei Untergruppen, Zebrafischembryonen abgeleiteten Treg (tTreg) und peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen unterteilt werden. Sie befinden sich in verschiedenen Organen unseres Körpers und durch spezifische Marker, wie Helios und Neuropilin 1 unterschieden werden können. Es wurde berichtet, dass tTreg Zellen funktionell mehr suppressive als pTreg Zellen sind. Daher ist es wichtig, den Anteil der tTreg und pTreg Zellen zu bestimmen, bei der Untersuchung von heterogenen Zellpopulationen. Hier sammelten wir Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten und Milz von Normoglycemic nicht adipösen diabetischen Mäusen tTreg Zellen aus pTreg Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Wir vorbereitet manuell einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen. Fluorochrom konjugiert Oberfläche CD4, CD8, CD25 und Neuropilin-1 Antikörper wurden verwendet, um die Zellen zu beflecken. Sie waren über Nacht im Kühlschrank aufbewahren. Am nächsten Tag waren die Zellen mit intrazellulären Foxp3 und Helios Antikörper konjugiert Fluorochrom befleckt. Diese Markierungen wurden verwendet, um die zwei Teilmengen von Treg-Zellen zu kennzeichnen. Dieses Protokoll zeigt eine einfache aber praktische Möglichkeit, einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz vorbereiten und verwenden Sie sie für spätere durchflusszytometrischen Analyse.

Einleitung

Regulatorische (Treg) T-Zellen sind entscheidend für die Homöostase des Immunsystems. Treg-Zellen werden durch die Expression von Oberflächenantigenen CD4 und CD25 und die Transkription Faktor Forkhead Box P3 (Foxp3)^1,2,3definiert. Sakaguchi Et Al. zeigten erstmals, dass CD25 auf T-Suppressor-Zellen in Mäusen⁴konstitutiv exprimiert wird, die eine bahnbrechende Beobachtung für die Identifizierung des menschlichen Treg-Zellen zur Verfügung gestellt. Treg-Zellen spielen eine zentrale Rolle im Immuntoleranz durch gleichzeitiges eine unterdrückende Fähigkei....

Protokoll

Die lokalen Tier Ethikkommission an der Universität Uppsala genehmigt die Tierversuche.

1. Ernte Organe von Tieren

1. Die Mäuse durch zervikale Dislokation zu opfern.
2. Zebrafischembryonen Drüsen zu platzieren und Milz in 20 mL funkeln Fläschchen oder 15 mL konische Röhrchen gefüllt mit 5 mL Hanks´ ausgewogenen Salzlösung (HBSS). Ort PDLNs in 1,5 mL Mikro Tuben gefüllt mit 1 mL RPMI 1640. Verwenden Sie die gesamte Thymus und Milz und der PDLNs.
   Hinweis: Organe auf dem Eis während des Verfahrens aufbewahrt werden und die Ermittler sollten versuchen, schnell zu sein, während der Vorbereitung einzelner Zellsu....

Ergebnisse

Um den Ausdruck von Nrp1 und Helios auf tTreg und pTreg Zellen zu untersuchen, wir einzelne Zellen von Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz Normoglycemic NOD Mäuse vorbereitet und mit der Treg Zelle Marker CD4 und CD25, Foxp3, Helios Nrp1 für Durchfluss durchflusszytometrischen befleckt Analyse. Die Ergebnisse wurden analysiert, wie gezeigt, in der Vertreter gating Strategien (Abbildung 1). Wir fanden, dass den Anteil der Helios⁺ Zellen unter.......

Diskussion

In dieser Studie wir isolierte Einzelzellen aus Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz von Mäusen, NICKEN, und untersucht den Ausdruck von Helios und Nrp1 in CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg Zellen mittels Durchflusszytometrie. In der vorliegenden Studie wurden NOD Mäuse verwendet, das heißt ein Mausmodell des Typ 1 Diabetes. In einer früheren Studie haben wir die Wildtyp-Maus-Stämmen CD-1 und C57BL/6 Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob Helios oder Nrp1 eine bessere Markierung .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NOD-Mäuse			Hauseigene Panade
HBSS	Statens veterinä rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set	ThermoFisher	00-5523-00	Enthält Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat, Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel und Permeabilisierungspuffer (10x)
eBioscience Färbepuffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoklonaler Antikörper (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoklonaler Antikörper (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 Ratte Anti-Maus CD8a	BD Biosciences	560182
Maus Neuropilin-1 APC-konjugierter Antikörper	R& D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoklonaler Antikörper (FJK-16s), PE-Cyanin7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue Anti-Maus/Mensch Helios Antikörper	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb-Schnappkappe	CORNING	352235	A 35 & micro; m Nylonnetz ist in die Schnappkappe mit zwei Positionen eingearbeitet
Röhrchen 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Mikroröhrchen 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Einweg-Szintillationsfläschchen	WHEATON
Durchflusszytometrie	BD
Durchflusszytometrie-Analysesoftware	Inivai Technologies	Flowlogic