Name: Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse regulatorischer T-Zell-Teilmengen in murinem Thymus, Pankreas, Lymphknoten und Milz. Diese kostengünstige manuelle Methode ermöglicht präzise Untersuchungen immunologischer Prozesse.

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Die vorliegende Studie wurde von der schwedischen Forschungsrat, EXODIAB, der schwedischen Diabetes Foundation, schwedische Kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden und O.E Och Edla Johanssons Vetenskapliga Stiftelse finanziell unterstützt. Autoren möchten Dank pro-Ola Carlsson und Stellan Sandler für ihre Unterstützung und Diskussionen.

Die lokalen Tier Ethikkommission an der Universität Uppsala genehmigt die Tierversuche.
1. Ernte Organe von Tieren
<ol><li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation zu opfern.</li>
	<li>Zebrafischembryonen Drüsen zu platzieren und Milz in 20 mL funkeln Fläschchen oder 15 mL konische Röhrchen gefüllt mit 5 mL Hanks´ ausgewogenen Salzlösung (HBSS). Ort PDLNs in 1,5 mL Mikro Tuben gefüllt mit 1 mL RPMI 1640. Verwenden Sie die gesamte Thymus und Milz und der PDLNs. Hinweis: Organe auf dem Eis während des Verfahrens aufbewahrt werden und die Ermittler sollten versuchen, schnell zu sein, während der Vorbereitung einzelner Zellsuspensionen, vor allem, wenn Zebrafischembryonen Gewebe zu behandeln, da Zebrafischembryonen Immunzellen bei hohen Temperaturen schnell abgebaut werden können.</li>
</ol>(2) einzelne Zelle isoliert von Thymus und Milz
<ol><li>Drücken Sie gründlich die Thymusdrüse und Milz mit einer Pinzette die Immunzellen zu veröffentlichen. Die restlichen Zebrafischembryonen und Milz Kapsel zu verwerfen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C, eine Kugel zu bilden. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Um die Erythrozyten zu lysieren, die Zellsuspension in 5 mL 0,2 M NH4Cl Aufschwemmen und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. invertieren die Rohre auf den Kopf sanft alle 2 min. hinzufügen 5 mL von HBSS am Ende der Inkubationszeit, die Zerstörung zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in etwa 5 mL HBSS aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit HBSS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in etwa 5 mL HBSS aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit HBSS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in HBSS für Thymus 5 mL und 10 mL für Milz aufzuwirbeln.</li>
	<li>Transfer 1 mL der Suspension Zebrafischembryonen Zelle und die Milz Zellsuspension auf 5 mL 500 µL Rundrohr unten mit Zelle Sieb Kappen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die Zelle Sieb Kappen. Hinweis: Die Kappe ist ein 35 µm-Nylon-Mesh integriert. Etwa 5 Millionen Zellen wurden in jedem Röhrchen gesammelt.</li>
</ol>3. einzelne Zelle isoliert von PDLN
<ol><li>Legen Sie eine sterile 250 µm Metallgitter über eine 15 mL konische Rohr in einem Rack. Spülen Sie das Netz mit 1 mL RPMI.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lymphknoten auf das Metallgitter und Schleifen sie durch das Gitter mit der Pinzette. Tragen Sie 1 mL RPMI auf das Metallgitter, die Zellen in das Rohr zu spülen. 3 weitere Male wiederholen und das Netz zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets in etwa 5 mL RPMI aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit RPMI.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets in etwa 5 mL RPMI aufzuwirbeln. Füllen Sie die Rohre mit RPMI.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in 2 mL RPMI aufzuwirbeln. Übertragung der Zellsuspension 2 mL bis 5 mL unten Rundrohr mit Zelle Sieb Kappen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die Zelle Sieb Kappen.</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Zentrifugieren der Zellsuspensionen von PDLN, Thymus und Milz bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit den folgenden Oberfläche Antikörper in 100 µL der Durchflusszytometrie Fleckenbildung Puffer (FACS-Puffer): 0,75 µg/100 µL CD4 FITC-konjugierten Antikörpern, 0,60 µg/100 µL APC-H7 konjugiert CD8 Antikörper, 0,30 µg/100 µL PE konjugiert CD25 Antikörper, 5 µL (01:20) APC-konjugiert Nrp1 Antikörper. Inkubieren Sie die Rohre für 40 min auf Eis.</li>
	<li>Jedes Rohr 200 µL Puffer FACS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie noch einmal.</li>
	<li>Fix und permeabilize der Zellen durch resuspending der Zelle Pellet in 500 µL der Permeabilisierung Fixierung Puffer (PFB). Hinweis: PFB ist bereit, durch das Mischen von 1 Teil der Fixierung/Permeabilisierung mit 3 Teile Verdünnungsmittel Fixierung/Permeabilisierung konzentrieren.</li>
	<li>Halten Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. Hinweis: Eine 1 h Inkubation funktioniert auch.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL der Permeabilisierung waschen Puffer (PWB). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Hinweis: PWB wird vorbereitet durch Verdünnung Permeabilisierung Puffer (10 X) um 01:10 in destilliertem Wasser.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit den folgenden intrazellulären Antikörper in 100 µL PWB: 0,30 µg/100 µL Foxp3 PE-Cy7-konjugierten Antikörpern, 4 µL (01:25) Helios PacificBlue konjugierten Antikörper. Inkubieren Sie die Rohre auf Eis für 1 h.</li>
	<li>Jedes Rohr 500 µL PWB hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in 500 µL PWB aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 X g für 5 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Die Zelle Pellet in 300 µL Puffer FACS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer.</li>
	<li>Die einzelnen Zellen basierend auf Side Scatter-Area, Höhe und Breite, und Forward Scatter-Fläche, Höhe und breite Tor. Führen Sie 1 Million Ereignisse für die Analyse.</li>
	<li>Die FCS-Exportdateien von Experimenten und analysieren sie mit Hilfe einer Flow-Zytometrie-Analyzer-Software.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie wir isolierte Einzelzellen aus Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz von Mäusen, NICKEN, und untersucht den Ausdruck von Helios und Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg Zellen mittels Durchflusszytometrie. In der vorliegenden Studie wurden NOD Mäuse verwendet, das heißt ein Mausmodell des Typ 1 Diabetes. In einer früheren Studie haben wir die Wildtyp-Maus-Stämmen CD-1 und C57BL/6 Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob Helios oder Nrp1 eine bessere Markierung ...

Regulatorische (Treg) T-Zellen sind entscheidend für die Homöostase des Immunsystems. Treg-Zellen werden durch die Expression von Oberflächenantigenen CD4 und CD25 und die Transkription Faktor Forkhead Box P3 (Foxp3)1,2,3definiert. Sakaguchi Et Al. zeigten erstmals, dass CD25 auf T-Suppressor-Zellen in Mäusen4konstitutiv exprimiert wird, die eine bahnbrechende Beobachtung für die Identifizierung des menschlichen Treg-Zellen zur Verfügung gestellt. Treg-Zellen spielen eine zentrale Rolle im Immuntoleranz durch gleichzeitiges eine unterdrückende Fähigkeit über eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Zytolyse durch die Sekretion von Granzymen induzieren Apoptose, Zytokin-Verbrauch und Hemmung durch den Ausdruck von zytotoxischen T-Lymphozyten Antigen 45. Darüber hinaus können sie hemmende Zytokine wie z. B. die Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β), Interleukin-10 (IL-10) und IL-355absondern. Treg Zellen natürlich abgeleitet werden aus dem Thymus, in diesem Fall sind sie Zebrafischembryonen abgeleitete Treg (tTreg) Zellen bezeichnet, oder in diesem Fall nennt man peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen in den peripheren Organen induziert werden.
Helios, ein Mitglied der Adelsfamilie Ikaros Transkription Faktor wurde berichtet, dass ein Marker für die Unterscheidung zwischen tTreg Zellen und pTreg Zellen6. Zwei andere Gruppen berichtete später, dass Neuropilin 1 (Nrp1), ein semaphorin-III-Rezeptor als Oberfläche Marker für tTreg Zellen unter bestimmten Bedingungen7,8dienen könnte. Dennoch haben Singh Et Al. gezeigt, dass Helios eine bessere Markierung in diesem Zusammenhang in naive Mäuse9.
Die Teilmengen von Treg-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems und den Schutz gegen Autoimmunität und Infektionen. Daher ist es wichtig, die Zahlen und Proportionen dieser Populationen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Gewebe zu bestimmen. Um dies zu erreichen, muss man sich einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen vorzubereiten. Eine Reihe von Protokollen wurden beschrieben oder in früheren Studien verwendet. Vor allem, wurden automatische Dissociators in zuvor veröffentlichten Berichte10,11verwendet. Mit automatischen Dissociators ist bequem und zeitsparend, aber es ist ein teures Verfahren. Daher haben wir eine manuelle Methode verwendet, um einzelne Zellsuspensionen von murinen Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten (PDLNs) und Milz von Normoglycemic nicht adipösen Diabetiker (NOD) Mäuse und isolierte Einzelzellen aus diesen Organen vorzubereiten. Mit dieser Methode in unserer früheren Studien und wir fanden, dass die manuelle Methode für die Zubereitung von einzelnen Zellsuspension so effizient wie automatische Dissociator Methode9,12,13,14. Darüber hinaus wir Durchflusszytometrie verwendet, um die Proportionen der CD4 bestimmen+CD8–CD25+Foxp3+ Treg Zellen und die Teilmengen von Treg-Zellen tTreg und pTreg Zellen. Die tTreg und pTreg Zellen wurden ausgezeichnet mit Helios und Nrp1 als Marker für tTreg Zelle. So zeigen unsere Ergebnisse, dass die manuelle Methode für die Vorbereitung der einzelnen Zellen effizient funktioniert und vorbereitete Einzelzelle Suspensionen können weiter verwendet werden, für Studien mit Durchflusszytometrie.

<table><tbody><tr><td>NOD-Mäuse</td><td></td><td></td><td>Hauseigene Panade</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Enthält Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat, Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel und Permeabilisierungspuffer (10x)</td></tr><tr><td>eBioscience Färbepuffer</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonaler Antikörper (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Monoklonaler Antikörper (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Ratte Anti-Maus CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Maus Neuropilin-1 APC-konjugierter Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 Monoklonaler Antikörper (FJK-16s), PE-Cyanin7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Anti-Maus/Mensch Helios Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb-Schnappkappe</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 & micro; m Nylonnetz ist in die Schnappkappe mit zwei Positionen eingearbeitet</td></tr><tr><td>Röhrchen 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Szintillationsfläschchen</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie-Analysesoftware</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

ermittlung der regulatorischen t zelle teilmengen in murinen thymus, pankreas, entwässerung, lymphknoten und milz mit durchflusszytometrie

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Unser Immunsystem besteht aus einer Zahl und Vielfalt der immunen Zellen einschließlich der regulatorische T-Zellen (Treg)-Zellen. Treg-Zellen können in zwei Untergruppen, Zebrafischembryonen abgeleiteten Treg (tTreg) und peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen unterteilt werden. Sie befinden sich in verschiedenen Organen unseres Körpers und durch spezifische Marker, wie Helios und Neuropilin 1 unterschieden werden können. Es wurde berichtet, dass tTreg Zellen funktionell mehr suppressive als pTreg Zellen sind. Daher ist es wichtig, den Anteil der tTreg und pTreg Zellen zu bestimmen, bei der Untersuchung von heterogenen Zellpopulationen. Hier sammelten wir Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten und Milz von Normoglycemic nicht adipösen diabetischen Mäusen tTreg Zellen aus pTreg Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Wir vorbereitet manuell einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen. Fluorochrom konjugiert Oberfläche CD4, CD8, CD25 und Neuropilin-1 Antikörper wurden verwendet, um die Zellen zu beflecken. Sie waren über Nacht im Kühlschrank aufbewahren. Am nächsten Tag waren die Zellen mit intrazellulären Foxp3 und Helios Antikörper konjugiert Fluorochrom befleckt. Diese Markierungen wurden verwendet, um die zwei Teilmengen von Treg-Zellen zu kennzeichnen. Dieses Protokoll zeigt eine einfache aber praktische Möglichkeit, einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz vorbereiten und verwenden Sie sie für spätere durchflusszytometrischen Analyse.

Um den Ausdruck von Nrp1 und Helios auf tTreg und pTreg Zellen zu untersuchen, wir einzelne Zellen von Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz Normoglycemic NOD Mäuse vorbereitet und mit der Treg Zelle Marker CD4 und CD25, Foxp3, Helios Nrp1 für Durchfluss durchflusszytometrischen befleckt Analyse. Die Ergebnisse wurden analysiert, wie gezeigt, in der Vertreter gating Strategien (Abbildung 1). Wir fanden, dass den Anteil der Helios+ Zellen unter...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Dieses Protokoll hilft bei der Untersuchung der Rolle von Immunzellen in bestimmten Organen in Gesundheit und Pathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dies eine kostengünstige Technik ist, da es sich um eine manuelle Technik handelt. Demonstriert wird das Verfahren von Zhengkang Luo, einem Doktoranden aus meinem Labor.Zunächst sollten die Thymiandrüsen und Milz von zuvor eingeschläferten Mäusen in 20 ml Szintillationsphiale oder 15 ml konische Röhrchen, gefüllt mit 5 ml Hanks ausgewogener Salzlösung, gegeben werden. Die Pankreas-Entwässerungs-Lymphknoten in 1,5 ml Mikroröhrchen geben, die mit 1 ml RPMI-1640 gefüllt sind. Achten Sie darauf, den gesamten Thymus und die Milz sowie alle PDLNs zu verwenden.Halten Sie die Organe während des gesamten Verfahrens auf Eis. Mit einer Schere, gründlich drücken Sie den Thymus und Milz, um die Immunzellen zu befreien. Entsorgen Sie die restlichen thymischen und milden Kapseln.Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifugieren Sie bei 433 mal g und bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten, und werfen Sie den Überstand. Um die roten Blutkörperchen zu lysieren, setzen Sie die Zellsuspension in 5 ml 0,2 Molammoniumchlorid wieder auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur zehn Minuten lang.Alle zwei Minuten die Rohre sanft umkehren. Am Ende der Inkubation 5 ml HBSS hinzufügen, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in ca. 5 ml HBSS wieder auf. Füllen Sie dann die Rohre mit HBSS. Wiederholen Sie diesen Vorgang, vom Zentrifugieren der Proben bis zum einmaligen Befüllen des Rohres mit HBSS.Zentrifugieren Sie die Rohre noch einmal bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in HBSS erneut aus. Erhalten Sie 5 ml Rundbodenröhrchen mit Zell-Siebkappen.1 ml der thymischen Zellsuspension und 500 Mikroliter der Milzzellsuspension auf die Röhrchen übertragen, indem Sie die Suspension auf die Zellsiebkappen auftragen. Legen Sie zunächst eine 15 ml konische Röhre in ein Rack. Legen Sie ein steriles 250 Mikrometer Metallgitter über das Rohr.Spülen Sie das Netz mit 1 ml RPMI. Als nächstes übertragen Sie die Lymphknoten auf das Metallnetz und verwenden Sie eine Pinzette, um sie durch das Netz zu schleifen. Tragen Sie 1 ml RPMI auf das Netz auf, um die Zellen in die Röhre zu spülen.Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Schleifens der Lymphknoten dreimal für jede Probe, und entfernen Sie dann das Netz. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in ca. 5 ml RPMI wieder auf.Füllen Sie dann die Rohre mit RPMI. Wiederholen Sie diesen Vorgang, vom Zentrifugieren der Proben bis zum einmaligen Befüllen des Rohres mit RPMI. Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 2 ml RPMI wieder auf. 2 ml der Zellsuspension in 5 ml Rundbodenrtuben mit Zellsiebkappen übertragen. Zunächst zentrifugieren Sie die Zellsuspension aus den Thymus-, Milz- und PDLN-Proben bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand. Färben Sie die Zellen mit Oberflächenantikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben, und inkubieren Sie die Rohre 40 Minuten lang auf Eis. Als Nächstes fügen Sie 200 Mikroliter FACS-Puffer zu jedem Rohr hinzu.Zentrifugieren Sie bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, und werfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, fügen Sie den Puffer hinzu, zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand einmal. Setzen Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter Permeabilisationsfixierungspuffer wieder aus, um die Zellen zu fixieren und zu permeabilisieren.Übertragen Sie die Schläuche über Nacht bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank. Am nächsten Tag zentrieren Sie die Rohre bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter Permeabilisationswaschpuffer wieder auf.Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Färben Sie die Zellen mit intrazellulären Antikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Rohre 1 Stunde auf Eis bebrüten.Danach 500 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer zu jedem Rohr hinzufügen. Zentrifuge bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Permeabilisationswaschpuffer wieder auf.Zentrifugieren Sie noch einmal bei 433 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 300 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Analysieren Sie dann die Zellen auf einem Durchflusszytometer, wie im Textprotokoll beschrieben.In dieser Studie werden einzelne Zellen aus thymischen Drüsen, PDLNs und Milz normaler glykämischer NOD-Mäuse isoliert und mit Treg-Zellmarkern, CD4, CD25, Foxp3, Helios und Neuropilin-1 für die zytometrische Analyse des Durchflusses gefärbt. Die Ergebnisse werden analysiert und hier als repräsentative Gating-Strategien dargestellt. Der Anteil der Helios-positiven Zellen unter den CD4-positiven, CD8-negativen, CD25-positiven, Foxp3-positiven Treg-Zellen ist in allen drei Organen höher als der der Nrp1-positiven Zellen.Mehr als 80% der Treg-Zellen im Thymus sind als Ausdruck helios, das höher als in der PDLN ist, und die Milz. Der Anteil der NrP1-positiven Zellen unter Helios-positiven Treg-Zellen ist in der PDLN höher als in der Thymus- oder Milz. Die Mehrheit der Nrp1-positiven Treg-Zellen drückt auch Helios aus, und der Anteil der Helios-positiven Zellen unter den Nrp1-positiven Treg-Zellen ist im Thymus und milden höher als in der PDLN.Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Helios ein besserer Marker ist, um T Treg-Zellen zu erkennen als Nrp1. Lymphknoten sind klein, aber einige intrazelluläre Marker benötigen eine große Anzahl von Zellen, um ein gutes Signal in der Durchflusszytometrie zu geben. Andere Methoden können nach diesem Verfahren nicht ausgeführt werden, da die Zellen bereits befleckt und tot sind.Aber die vier Zellmarker des Tieres können ersetzt werden, um andere Arten von Immunzellen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde...

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

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Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einzelner Zellen aus murinen pankreasdrainierenden Lymphknoten (PDLNs) und die Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus der Einzelzellpopulation mittels Durchflusszytometrie. Die Tregs werden basierend auf der positiven Expression der Zelloberflächenmarker CD4, CD25 und Nrp1 sowie der nukleären Transkriptionsfaktoren Foxp3 und Helios identifiziert.

Identifizierung regulatorischer T-Zell-Untergruppen aus murinen pankreasdrainierenden Lymphknoten

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Dieses Protokoll bietet eine In-vitro-Kokulturstrategie zur Untersuchung der Auswirkungen regulatorischer T-Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Effektor-T-Zellen.

In vitro Funktionelle Analyse regulatorischer T-Zellen: Fokus auf Proliferation und Differenzierung

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse regulatorischer T-Zell-Teilmengen in murinem Thymus, Pankreas, Lymphknoten und Milz. Diese kostengünstige manuelle Methode ermöglicht präzise Untersuchungen immunologischer Prozesse.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

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