Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E¹³ Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Zusammenfassung

Neurale Stammzellen (NSCs) multipotent sind und kann die drei wichtigsten Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen. In-vitro- Kultur und den Ausbau der NSCs bieten eine geeignete Quelle von Zellen für Neurologen, die Funktion von Neuronen zu studieren und Gliazellen zusammen mit ihren Interaktionen. Es gibt verschiedene gemeldeten Techniken für die Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Säugetier-Gehirne. Während der mikrochirurgischen Operation, NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS zu isolieren ist es sehr wichtig, den Schaden zu reduzieren, die Gehirnzellen, das höchste Verhältnis von Live- und erweiterbare Stammzellen zu erhalten. Eine mögliche Technik zum Stressabbau während Isolierung dieser Zellen aus dem Gehirn der Maus-Embryo ist die Reduzierung von OP-Dauer. Hier zeigen wir eine entwickelte Technik für schnelle Isolierung dieser Zellen aus der E¹³ Maus Embryo ganglionic Eminenz. Chirurgische Eingriffe sind Ernte E¹³ -Maus-Embryonen aus der Gebärmutter, schneiden die vordere Fontanelle des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, extrahieren das Gehirn aus dem Schädel, Mikrodissektion von isolierten Gehirn ganglionic Eminenz zu ernten, Dissoziation des geernteten Gewebes im NSC Medium um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewinnen und schließlich Beschichtung Zellen in Suspensionskultur, Neurosphären zu generieren.

Einleitung

Neurale Stammzellen (NSCs) befinden sich in verschiedenen Regionen des Gehirns Erwachsener und Embryo und sie haben eine Tendenz, verschiedene Arten von Neuronen und Gliazelle¹zu generieren. Die subventricular Zonen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren² und ganglionic Eminenz im Embryo Gehirn sind NSC reichen Regionen³. In das sich entwickelnde Gehirn liefert die ganglionic Eminenz die meisten kortikale Interneurone und insbesondere GABAergen Interneuronen³. Es gibt auch weniger invasiven Methoden zur Erzeugung von neuronalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen (WSR) o....

Protokoll

Alle Operationen und Prozeduren auf Tier stimmten mit der Tierethik-Ausschuss des Instituts Royan, Teheran, Iran.

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Wasch-Puffer (HEPES-MEM), Zellkulturmedien und Kultur Zellplatten

1. Chirurgische Instrumente (Schere, Skalpell Klinge Griff und Zange) durch Autoklavieren sie basierend auf den routinemäßigen Sterilisation Leitlinien zu sterilisieren.
2. Bereiten Sie eine angemessene Menge HEPES-MEM-Puffer (etwa 100 mL ist ausreichend für jede Schwangere Mäuse). Hohe Konzentrationen von Antibiotika (Penicillin/Streptomycin 10 %) in den Puffer HEPES-MEM hinzufügen. Diese Konzentration....

Ergebnisse

Micro-Dissektion, Zelle Isolation und Kultur Neurosphäre. Hier präsentierten wir eine schnelle und effiziente Methode zur Maus E¹³ Gehirn Mikrochirurgie und Isolierung von neuralen Stammzellen. Dieser Artikel zeigt, dass es möglich ist, das ganze Gehirn von einem E¹³ Maus Embryo Schädel durch einen feinen Bruch im vorderen Fontanelle zu entfernen. Mit dieser Methode wird das Gehirn erträgt weniger Schaden und es ist möglich, Zellen aus verschiedenen .......

Diskussion

Mit einer geeigneten Bezugsquelle von neuralen Stammzellen ist sehr wichtig für die Neurowissenschaftler. Neurale Stammzellen könnten aus verschiedenen Bereichen des Gehirns Embryo geerntet werden und sie können bestimmte Typen von Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt mehrere Methoden für die Induktion der Differenzierung der neuralen Stammzellen induzieren sie Reifen Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt zahlreiche Berichte, wonach unter bestimmten Kulturbedingungen und trophischen Faktor Regimenter, .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Röhrchen	Falcon	352097
50 mL Röhrchen	Falcon	352235
Adson Pinzette, 12 cm, gerade	WPI	14226
B27	Gibco	17504-44
bFGF	Sigma	F0291
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A2153
Schale 10cm	Falcon	353003
Verbandzange, 12,5 cm, gerade	WPI	15908
Dumont Pinzette, 11 cm, gerade	WPI	500342
EGF	Sigma	E9644
Ethanol	Merck	100983
Glutamat	Sigma	G3291
Glutamax	Gibco	35050061
Ziegen Anti Kaninchen FITC konjugierter Sekundärantikörper	Sigma	AP307F
Ziegenserum	Sigma	G9023
Heparin	Sigma	h3149
HEPES	Sigma	83264
HEPES	Sigma	90909C
Insulinspritze mit 25-27 Gauge Nadel	SUPA medical	A1SNL127
Laminin	sigma	L2020
MEM	Sigma	M2279
N2 Ergänzung	Gibco	17502048
NB Medium	Gibco	21103-31
Nicht-essentielle Aminosäure (NEAA)	Gibco	11140050
PBS ohne Ca und Mg	Gibco	20012050
Penicilin/ Streptomycin	Gibco	5140122
Poly-L-Ornithin	Sigma	P4957
Kaninchen Anti-Maus Beta Tubulin-III Antikörper	Sigma	T2200
Kaninchen Anti Maus GFAP Antikörper	Sigma	G4546
Kaninchen Anti Maus Nestin Antikörper	Sigma	N5413
Skalpellgriff #3	WPI	500236
Schere Kurve	WPI	14396
Schere scharf gerade	WPI	14192
Sojabohnen-Trypsin-Hemmer	Roche	10109886001
Gewebekulturflaschen, T25	BD	353014
Gewebekulturflaschen, T75	BD	353024
Tween 20	Sigma	P1379
Vannas Schere, 8 cm, gerade	WPI	14003
β-Mercaptoethanol	Sigma	M6250