Summary
이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.
Abstract
Microelectrode 배열 (MEAs) 널리 신경 기능에 생체 외에서연구 하는 데 사용 됩니다. 이 소자 들은 오랜 기간 동안 동시 비-침략 적 기록/자극 electrophysiological 활동의 허용. 그러나, 모든 microelectrode 주위 모든 소스 로부터 신호를 감지의 통신을 이해 하 고 신경 회로에 전파 신호를 하려고 할 때 불리 될 수 있다. 신경 네트워크에서 여러 뉴런 동시에 활성화 될 수 있다 하 고 차별 하 고 신호 전파를 추적 하 고 어려운 겹치는 활동 전위를 생성할 수 있습니다. 이 한계를 고려 하면 우리는 생체 외에서 설치 electrophysiological 통신, 격리 및 높은 공간 및 시간적 해상도 axonal 신호를 증폭 할 수 있는 평가에 초점을 맞춘을 설립 했다. 미세 장치 및 MEAs 인터페이스, 우리 신경 축 삭과 microelectrodes의 잘 제어 맞춤 문화 분류 수 있습니다. 이 설치는 몇 주에 걸쳐 높은 신호 대 잡음 비율 스파이크 전파의 녹음을 수 있습니다. 함께 전문된 데이터 분석 알고리즘, 그것 제공 합니다 여러 통신의 상세한 정량화 관련 전파 속도, 전도 장애, 발사 속도, 참가자 스파이크, 속성 및 메커니즘을 코딩.
이 프로토콜 기판 통합 MEAs에 compartmentalized 신경 문화 설치를 만드는 방법을,이 설정에서 뉴런 문화 하는 방법 및 성공적으로 기록, 분석 하 고, 같은 실험에서 결과 해석 하는 방법을 보여 줍니다. 여기, 우리가 설립된 설치 신경 통신 및 axonal 신호 전파의 이해를 단순화 하는 방법을 보여줍니다. 이러한 플랫폼 설계 하 고 관리할 수 있는 신경 네트워크 topographies와 새로운 생체 외에서 모델에 대 한 방법을 포장. 그들은 균질 신경 문화, 또는 공동 문화 구성, 예를 들어 감각 신경 세포와 다른 세포 유형 간의 통신은 모니터링 및 평가 컨텍스트에서 사용할 수 있습니다. 이 설치 매우 흥미로운 조건을 연구, 예를 들어 neurodevelopment, 신경 회로, 코딩, neurodegeneration 및 neuroregeneration 접근 하는 정보를 제공 합니다.
Introduction
신경 회로에 전기 통신 이해 정상적인 기능을 공개 하 고 역 기능을 해결 하기 위해 치료 전략을 고안 하는 기본 단계입니다. 신경 통합, 계산 및 활동 전위 (APs) 얇은 그들의 축 삭을 따라 전파를 릴레이. 전통적인 electrophysiological 기법 (예를 들어, 패치 클램프) 강력한 기술을 신경 활동을 공부 하지만 종종 soma 또는 모 수석 같은 큰 셀룰러 구조 제한. 높은 공간 해상도, axonal 신호를 공부 하는 대안을 제공 하는 이미징 기술을 하지만 그들은 기술적으로 어려운 수행 하 고 장기적인 측정1을 허용 하지 않습니다. 이러한 맥락에서 microelectrode 배열 (MEAs) 및 마이크로의 조합 공개 생체 외에서신경 네트워크2 내 neuron´s 활동 및 신호 전송의 기본적인 속성에 강력한 기여를 할 수 있습니다. , 3.
MEA 기술은 신경 문화의 extracellular 녹음에 의존합니다. 이 electrophysiological 방법론의 주요 장점은 장기, 동시 자극 및 기록 및 비-침략 적 방법3에 여러 사이트에서 지원 하는 기능입니다. MEAs 생체, 높은 전도성과 부식 방지 microelectrodes 유리 웨이퍼 기판에 만들어집니다. 그들은 기존의 셀 문화 바이오 코팅, 어떤 세포 접착을 크게 홍보 하 여 기판 및 셀3,4사이 봉인 저항 증가와 호환 됩니다. 또한, 그들은 디자인에서 다재 다능 한 그리고 microelectrodes 크기, 형상 및 밀도에 따라 달라질 수 있습니다. 전반적으로, MEAs 허용 동시 라이브 이미징 및 electrophysiological 녹음/자극의 장점과 함께 기존의 셀 문화 혈관으로 작동 합니다.
MEA 기술 사용 하 여 신경망5의 중요 한 특징의 연구에 기여 했다. 그러나, 통신 및 신경 회로에 Ap 전파 공부 MEAs의 성능을 제한 하는 고유의 기능이 있습니다. MEAs 단 세포와 축 삭, 같은 심지어 subcellular 구조에서 녹음 있지만 somal 신호에 비해, axonal 신호는 매우 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)6. 또한, 모든 microelectrode 주위 모든 소스에서 세포 외 필드 전위를 감지의 특성에는 신경 회로에 신호 전파의 추적 지장을 초래할 수 있습니다.
그러나 최근 학문은 설명 했다,, 더 나은 녹음 상태는 축 삭이 성장할 수 있는 좁은 microchannels 내 맞춤 microelectrodes 함으로써 달성 될 수 있다. 이러한 구성을 통해 SNR에 상당한 증가 쉽게 수 axonal 신호 전파 감지7,,89,10,11,12, 13. MEA 기술을 미세 장치를 점 락의 전략 axonal 신호11증폭에 적합 한 전기적으로 절연된 microenvironment를 만듭니다. 또한,는 microgroove 따라 여러 감지 microelectrodes의 존재 검출 및 axonal 신호 전파의 특성에 대 한 근본 이다.
높은 제어 신경 네트워크 topographies와 플랫폼 생체 외에서 이러한 많은 연구 질문14에 적용할 수 있습니다. 이러한 플랫폼 신경 문화의 맥락에서 사용 되 게 적당 하지만 공동 문화 구성, 신경 세포와 다른 세포 유형 간의 통신 감시 되 고 평가 될 수 있습니다 어디를 확장 될 수 있다. 이 설치는 따라서 매우 흥미로운 조건을 neurodevelopment, 신경 회로, 정보 코딩, neurodegeneration, neuroregeneration 등 신경 관련 연구의 여러 탐험을 제공 합니다. 또한, 인간 유도 만능 줄기 세포15,16 의 신흥 모델 조합 신 경계에 영향을 주는 인간의 질병을 위한 잠재적인 치료의 개발에 새로운 길을 열 수 있습니다.
우리의 실험실 셀룰러 및 네트워크 수준 및 물리 치료사 및 pathologic 신 경계에 그들의 암시에 신경 프로세스를 이해 하 마이크로 (µEF)와 microelectrodes을 결합 하는이 플랫폼을 사용 하는. 신경 과학의 분야에서 이러한 플랫폼의 가치를 감안할 때,이 프로토콜의 목적은 기판 통합 MEAs 전면 compartmentalized 신경 문화를 창조 하는 방법을 보여 주는 문화 신경이이 플랫폼에 성공적으로 기록 하는 방법 하는 방법 분석 하 고 이러한 실험에서 결과 해석. 이 프로토콜은 신경 통신의 연구에서 신경 문화에 대 한 실험 도구 상자 풍부 하 게 확실히 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 유럽 연합 (EU) 지침 2010/63/유럽 ( Decreto Lei 113/2013에 의해 포르투갈 법안 transposed)에 따라 수행 했다. 실험 프로토콜 (0421/000/000/2017) 모두 포르투갈어 공식 권위의 동물 복지 및 실험 (Direção Geral 드 음식 e Veterinária-DGAV)와의 호스트 기관 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 문화 미디어 및 다른 솔루션의 준비
참고: 사용 당일 갓 코팅 솔루션을 준비 합니다. 사용 하지 않는 코팅 솔루션 및 문화 미디어는-20 ° C에 4 ° C 아래로 저장할 수 있습니다.
- 0.05% (v/v) Poly(ethylene imine) (페이) 작업 솔루션의 10 mL를 준비 합니다.
- 순화 페이 용 해 하 여 0.25% (w/v) 페이 재고 솔루션의 20 mL를 준비 ( 재료의 표참조) 살 균 물에.
- 8 mL의 멸 균 증류수에 0.25% (w/v) 페이 재고 솔루션의 2 개 mL를 희석. 잘 혼합 하 고 사용 합니다. 사용 하지 않는 솔루션 4 ° c.에 저장 될 수 있다
- 5 µ g/mL laminin 솔루션의 1 mL를 준비 합니다.
- 기저 매체의 995 µ L에서 1mg/mL laminin 재고 솔루션의 5 µ L를 희석 ( 재료의 표참조). 잘 혼합 하 고 사용 합니다. 사용 하지 않는 솔루션은 최대 1-2 주 동안-20 ° C에서 냉동 저장할 수 있습니다.
- HEPES 버퍼링 행 크의 균형된 소금물 (HBSS H) 1 리터를 준비 합니다.
- 초순의 50 mL에 HEPES 가루 11.9 g을 용 해 하 여 1 M HEPES 솔루션을 준비 합니다. PH 7.2 조정 합니다.
- 5.33 m m 염화 칼륨, 0.44 mM 칼륨 인산 이수소, 138 m m 염화 나트륨, 인산 염기 나트륨 0.3 m m 및 초순 물 800 mL 포도 당 5.6 m m를 용 해 하 여 (칼슘, 마그네슘) 없이 H HBSS 솔루션을 준비 합니다.
- 1 M HEPES 솔루션 (15 m m의 최종 농도)의 15 mL를 추가 합니다.
- 0.2-0.3 pH 조정 원하는 pH 7.4 1를 사용 하 여 아래 단위 N HCl 또는 1 N NaOH. 최종 솔루션 볼륨을 구성 하는 초순 물을 추가 합니다.
참고 산도 여과 하는 동안 상승 해 경향이 있다. - 0.22 μ m 다공성 poly(ether sulfone) (PES) 멤브레인을 사용 하 여 여과 하 여 소독.
- 10 mL를 준비 H HBSS의 10%에 포함 된 열-비활성화 소 태아 혈 청 (hiFBS).
- H-HBSS 9 mL에 hiFBS의 1 mL를 희석. 잘 혼합 하 고 사용 합니다. 사용 하지 않는 솔루션 4 ° C에서 3-4 주 동안 저장할 수 있습니다.
- 5 mL 1.5 mg/mL의 트립 신 솔루션을 준비 합니다.
- 즉시 사용 하기 전에, H HBSS의 5 ml에서 trypsin의 7.5 mg을 디졸브. 0.22 μ m 다공성 PES 멤브레인을 사용 하 여 여과 하 여 소독.
- 보충된 매체의 50 mL를 준비 합니다.
- 50 mL 원뿔 튜브 혼합 기저 매체의 48.5 mL ( 재료의 표참조), 2% (v/v) B-27 보충, 0.5 m m L-글루타민 및 1% 펜/Strep (10000 U/mL 페니실린 및 10000 µ g/mL 스). 3-4 주 4 ° C에서 보충된 매체를 저장할 수 있습니다.
2. 미세 및 MEA 장치 준비
참고: 셀 뿌리기 전에 하루에 2.1 2.11 단계를 수행 합니다.
- 미세 소자 제작 및 비닐 테이프를 사용 하 여 다른 파편 제거를 청소. 부드럽게 장치의 모든 영역을 장치에 대 한 테이프를 누릅니다.
- 공기 플라즈마 청소 표면 청소 하 고 더 친 하 게 3 분 (0.3 mbar) MEA.
- 짧게 잠수함 70% 에탄올에 미세 장치 하 고 층 류 두건 내부 건조 하도록 허용.
- 각 MEA를 살 균 90 mm 페 트리 접시에에서 놓고 15 분의 자외선 (UV) 빛의 노출에 의해 소독 합니다.
- MEA 중앙 면적 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 0.05% (v/v) 페이 솔루션의 500 µ L로 배양 하 여 코트
참고:17다른 사람에 의해 설명, 페이 코팅 MEAs의 클러스터링 poly(lysine) 코팅을 사용 하 여 보다 적은 셀에 발생 합니다. - MEA 표면에서 페이 코팅 솔루션을 발음 하 고 씻어 MEAs 4 x 1 mL의 멸 균 증류수. 이 전극을 손상 시킬 수 있는 단계를 세척 하는 동안 MEA 표면을 만지지를 주의 해야 합니다.
- 층 류 두건 내부 stereomicroscope에 의해 유도, MEA 칩 센터 고 MEA의 중앙 지역에 살 균 물의 1 mL을 추가.
- MEA 표면 위에 미세 장치를 놓습니다.
- 신중 하 게 미세 소자의 microgrooves는 MEA의 microelectrode 그리드와 맞춥니다.
- 정확 하 게 맞춰질 때는 MEA 미세 장치를 건드리지 않고 신중 하 게 초과 하는 물을 발음.
- 하룻밤 건조 하 고 완전 한 첨부 파일을 허용 37 ° C에서 µEFs를 품 어. 첨부 파일을 용이 하 게, 부드럽게 미세 장치는 MEA에 대 한 누릅니다.
참고: 셀 시드 당일 단계 2.12를 수행 합니다. - µEFs는 완전히 건조 되 면 5 µ g/mL laminin 코팅 솔루션의 150 µ L 미세 우물을 로드 하 고 셀 뿌리기 전에 적어도 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
주: laminin 솔루션 µEF를 로드할 때 확인 솔루션은 microgrooves를 채웁니다. microgrooves 내에서 있을 수 있는 모든 기포를 제거 하는 진공을 사용 합니다.
3. 전 두 엽 피 질 절 개
- 배아 제거에 대 한 해 부 영역을 준비 합니다.
- 작업 표면 및 70% 에탄올과 수술 기구를 소독.
참고: 비록이 해 부는 살 균 절차, 소독의 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. - 깨끗 한 일회용 기저귀를 사용 하 여 해 부 영역을 제한 하 고 배아 제거를 위한 수술 기구 배치.
- 가득 찬 H HBSS 4 90 m m 접시를 준비 하 고 해 부 지역 근처 얼음 쟁반에 그들을 배치.
- 작업 표면 및 70% 에탄올과 수술 기구를 소독.
- 이산화탄소 (CO2) 흡입에 의해 E-18 시간 임신 Wistar 쥐를 안락사.
- 완료 되 면 절차, CO2 약 실에서 동물을 제거 하 고 안락사, exsanguination 등의 보조 방법으로 죽음을 확인 합니다.
- 동물 복 부 측을 일회용 기저귀에, 아랫 70% 에탄올 스프레이 놓고, 집게와가 위의 도움으로 U 자형 잘라 피부 노출 자 궁을 통해 확인 합니다.
- 조심 스럽게 어떤 결합 조직 멀리 절단 하 여 자 궁에서 태아를 제거 하 고 차가운 H HBSS로 페 트리 요리 중 하나에 그들을 배치.
- 그것의 미 발달 sac에서 각 배아를 제거 하 고, 도움으로 집게와가 위, 태아 목을 벨.
- 두 번째 페 트리 접시에 전송 embryo´s 머리 감기 H HBSS 가득합니다.
- 각 태아 단계 3.6 3.7 반복 합니다.
- 전 두 엽 피 질을 해 부.
- 세 번째 페 트리 접시에 embryo´s 머리를 전송 합니다.
- 집게의 쌍을 사용 하 여 뇌를 노출.
- 그것의 구멍에서 두뇌를 제거 하 고 차가운 H HBSS로 그것을 커버.
- 있으면, 제거 하 고 삭제 후 각 전구. 전 두 엽 피 질을 해 부하 고 meninges 제거 합니다.
- 전 두 엽 피 질 조각 4 페 트리 접시 가득 찬 H HBSS 전송.
- 3.9.1-3.9.5 각 태아에 대 한 단계를 반복 합니다.
4. 대뇌 피 질의 신경 분리와 µEF에 문화
참고: 다음 절차 되었습니다 수행 층 류 두건 내부 자외선 살 균의 주기는 15 분 후. 표면적으로 후드 안에 배치 하는 모든 자료를 작업 70% 에탄올과 이전 소독 되어야 한다.
- 1.5 단계에 설명 된 대로 이전 가중치 trypsin H HBSS의 5 mL에 녹이 고 필터링 솔루션.
- 이전 H HBSS의 5 mL의 총에서 해 부 피 질 조각 수집 합니다. 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
- 피 질 조각이 들어 있는 튜브에 갓된 1.5 mg/mL trypsin 솔루션의 2.3 mL를 추가 합니다.
- 현 탁 액을 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어 (짧게 선동 매 5 분).
- 조직 소화를 중지 하 고 트립 신에 밖으로 씻어.
- 포함 하는 트립 신 상쾌한을 삭제 합니다. 나머지 트립 신; 비활성화를 H HBSS 포함 10 %hiFBS 5 mL을 추가 부드럽게 교 반 하십시오.
- 피 질 조각 정착 하 고는 상쾌한 다음 삭제 하자.
- H-HBSS hiFBS 잔류물을 제거 하 5 mL를 추가 합니다. 피 질 조각 아래로 침전 하 고는 상쾌한을 삭제 하자.
- H-HBSS의 5 mL와 함께 피 질 조각 다시 씻는 다.
- 피 질 조각 아래로 침전 하 고는 상쾌한을 삭제 하자. 보충된 신경 매체의 5 mL를 추가 합니다.
- 기계적으로 천천히 아래로에 pipetting으로 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 피 질 조각 해리 10-15 회. 필요한 경우 작은 구경 피 펫을 사용 하 여 동질적인 셀 정지 될 때까지 절차를 반복 합니다.
- 셀 서 스 펜 션 물 40 µ m 셀 스 트레이너를 필터링 하 여 나머지 undissociated 조직 삭제 합니다.
- 실행 가능한 세포를 계산 하 고 셀 밀도 결정 합니다.
- microtube에 0.4% (w/v) Trypan 파랑 20 µ L 세포 현 탁 액을의 20 µ L를 추가 합니다. 솔루션 homogenate을 잘 혼합 하 고 챔버 세 Neubauer 10 µ L 전송.
- 실행 가능한 셀 고 가능한 셀의 셀 밀도 결정 합니다.
- 107 셀/mL x 3.6으로 세포 밀도 조정 (필요한 경우, 원심 세포 현 탁 액).
- 셀 시드, 직전에 µEF의 모든 우물에서 laminin 코팅을 제거 합니다. µEF axonal 구획의 각 잘 보충된 매체의 50 µ L 플라스틱
- µEF somal 구획에 세포 현 탁 액의 5 µ L 씨 세포 부착 기판에 수 있도록 1 h, 37 ° C에서 품 어.
- 각 채우기 부드럽게 잘 데워 진된 보충된 매체와 µEF의. 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C에서 가습기 인큐베이터에 있는 µEF를 전송 합니다.
참고: 빠른 문화 매체 증발을 방지 하는 µEF를 들고 페 트리 접시 안에 물이 가득한 열린된 microtube 장소. - 문화 초 3 매일 문화 매체의 50%를 대체 하 여 필요한 기간에 대 한 문화를 유지 합니다.
참고: 실험, 후에 마이크로 수 수 분리 MEAs에서 하룻밤 물에 µEF를 immersing 하 여. 필요한 경우, 집게의 도움으로 마이크로 껍질을 부드럽게. MEAs 1% (v/v) 상업 효소 세제로 야간 보육에 의해 청소 될 수 있다 ( 재료의 표참조).
5. 자연 신경 활동을 기록
최대한 빨리 7 일 체 외 (DIV), 그러나 포획 2-3 주 (14-21 DIV) 성숙 하 고 전시에 안정적인 활동 참고: MEAs에 배아 대뇌 피 질의 뉴런 문화는 일반적으로 자발적인 활동 전시. 그것은 연구의 목적에 따라 electrophysiological 측정을 시작을 결정 하는 실험입니다. 이 프로토콜에서 µEF에서 신경 활동의 기록 상업 기록 시스템을 사용 하 여 설명 된다 (하드웨어 세부 사항에 대 한 재료의 표 참조), 난방 모듈 통합. 녹음을 수행 하는 데 사용 하는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 (소프트웨어 정보에 대 한 재료의 표 참조).
- MEA 녹음 시스템 및 온도 컨트롤러 설정 하 고 37 ° c.를 도달 하는 프리 앰프의 온수 베이스 플레이트를 허용
참고: 장기 기록에 대 한 (> 30 분 한 번에) 하나 있어야 CO2 분위기를 유지 하는 시스템. - 프리 앰프 (headstage)에 µEF를 놓습니다.
주: 확인 MEA 칩을 가장자리를 왼쪽 위에서 참조 번호를 올바르게 맞춰집니다. 우리가 사용 하는 MEA 칩은 회전 대칭, 하지만이 정렬 전극 및 하드웨어 Id의 핀 레이아웃의 올바른 방향과 일치. - 닫고 래치 프리 앰프 뚜껑.
- 를 녹음 하려면 녹음 소프트웨어 열고 녹음 매개 변수 및 기록된 데이터 스트림 (기록 체계를 설정 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 소프트웨어 설명서를 참조)의 경로 정의 합니다.
참고: 20 kHz의 샘플링 속도 수집 충분히 일반적으로 대부분의 응용 프로그램은. 높은 샘플링 주파수 더 정밀 스파이크 타이밍에 필요로 하는 경우에 적당 하다.입니다. 하나 하고자만 기록 스파이크, 낮은 주파수 성분의 신호를 감쇠 300 Hz에서 하이 패스 필터 설정. 원시 및 필터링 된 데이터는 동시에 기록 하는 경우 이것은 크게 데이터 파일 크기를 증가. 그것은 항상 원시 데이터의 오프 라인 필터링 할 수 있습니다. 데이터를 줄이기 위해 파일 크기는 기록 (예: microgrooves 내의 유일한 microelectrodes)에 있는 microelectrodes를 제한할 수도 있습니다. - 데이터 수집을 시작 하려면 DAQ 시작 을 클릭 합니다. 디스플레이 표시 활동 및 시작 기록의 실행 흔적을 확인 하십시오.
참고: 소음 레벨은 일반적으로 해당 하는 microgrooves microelectrodes에서 약간 더 높은. 소음 수준이 너무 높은 경우 (피크 대 피크 진폭 > 50 µ V) 또는 여러 microelectrodes에서 불안정, 그것은 좋은 핀 패드 접촉을 방해 하는 먼지 때문일 수 있었다. 이 문제는 일반적으로 부드럽게 MEA 접촉 패드 70% 에탄올을 적신 면봉을 사용 하 여 프리 앰프 핀 청소에 의해 해결 된다. - 분석 소프트웨어에서 녹화 된 파일을 엽니다 ( 테이블의 자료참조)를 신속 하 게 데이터를 탐험.
6. 데이터 분석
참고: 다음 단계는 µSpikeHunter 소프트웨어, µEF와 함께 기록 된 데이터를 분석 하 (자유롭게 사용할 수 있는 pauloaguiar@ineb.up.pt에 이메일 요청에 따라), Aguiar의 연구소에서 개발 된 계산 도구를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 2)는 데이터를 로드, 전파 스파이크 파도 식별, 그들의 방향을 결정 하는 데 사용 됩니다 (참가자 또는 역행) 전파 속도 추정 하는 고. µSpikeHunter 60-120 / 256-전극 MEAs와 함께에서 사용 될 수 있는 MEA2100 가족 시스템을 사용 하 여 얻은 녹음에서 생성 된 HDF5 파일와 호환 됩니다. 멀티 채널 실험을 사용 하 여 얻은 녹음 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여 HDF5 파일을 쉽게 변환할 수 있습니다 ( 재료의 표참조).
- 녹음 파일을 선택 하려면 찾아보기 를 클릭 합니다. 다음, 샘플링 속도, 녹음 기간으로 기록 된 데이터 스트림 (예를 들어, 원시 데이터, 필터링 된 데이터)의 목록이 목록 파일 정보 단추를 클릭 합니다.
참고: 사실 전파 속도 의견, 그것 것이 좋습니다 분석에 대 한 원시 데이터 스트림을 선택 하려면. - 분석을 위한 microelectrodes (단일 행 또는 열 microgroove와 관련 된)을 선택 하 고 신호 잡음의 표준 편차 (SD) x 6에서 스파이크 감지 임계값 값 (양수 또는 음수 단계)를 설정 합니다. 데이터 읽기 이벤트 검출기를 적용 하 고 확인 된 전파 시퀀스를 얻을를 클릭 합니다.
참고: 조건이 충족 하는 경우 검색된 전파 시퀀스 목록 분석 패널을 채울 것 이다. 사용자 다음 보기 고 전압 추적, 간 microelectrode 간 상관 관계, 단일 시퀀스 전파 속도, kymograph, 및 오디오 재생 도구를 포함 하 여 전파 시퀀스에 대 한 여러 가지 분석 도구와 상호 작용 수 있습니다. 모든 쌍에 대 한 견적의 평균 또는 microelectrodes의 어떤 쌍 든 지에 대 한 전파 속도 추정을 얻을 수 있습니다, 하지만이 추정 먼 쌍을 선택 하는 경우 더욱 안정적입니다. - 관심의 microelectrode 집합에 대해 이전 단계를 반복 합니다. 때마다 CSV 파일에 모든 전파 식별 된 시퀀스에 대 한 시간 및 스파이크의 진폭 (각는 microelectrodes)에 저장 하 모든 이벤트 저장 을 클릭 합니다.
- (예를 들어, 발사 속도, 간 스파이크 간격) 문화 활동의 패턴의 추가 분석을 위해 데이터 분석 환경에 CSV 파일을 가져옵니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, µEF에 시드 E-18 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 개발 하 고 한 달 이상에 대 한 이러한 문화 조건에서 건강 하 게 유지 수 있습니다. 3 ~ 5 일에 문화, 곧 대뇌 피 질의 뉴런 µEF (그림 1)의 axonal 구획으로 microgrooves 통해 그들의 축 삭 성장. 15 일 후에 문화, µEF에 경작 하는 대뇌 피 질의 뉴런 활동의 꾸준한 수준을 전시 하 것으로 예상 된다 고는 microgrooves 따라 활동 전위의 전파는 있습니다. 오래 된 문화 (> 14 DIV) 기존의 MEA 녹음18,19로 활동 금지에 의해 지배 하는 경향이 있다.
녹음 및 데이터 분석
µSpikeHunter (그림 2)와 원시 데이터 분석 탐지 및 전파 (microgrooves) 이내 4 microelectrodes의 세트에 따라 스파이크 파도의 추출 허용. 그림 3 은 이러한 이벤트 중 하나가 표시 됩니다. µSpikeHunter microelectrodes (시간 지연 제공)의 선택 된 쌍의 전압 파형 및 관련된 알려진된 전극 간 거리 사이 간 상관 관계에 따라 전파 속도의 추정에 대 한 허용.
추출 된 데이터 추가 사용자 지정 설계 된 코드를 사용 하 여 MATLAB에서 분석 했다. 전파의 대표 래스터 줄거리 스파이크 (16) 중 11 따라 파도 microgrooves 그림 4a에 표시 됩니다. 높은-및 낮은 활동 microgroove 순간 발사 속도 그림 4b에 표시 됩니다.
µEF 녹음 microelectrode 당 활동의 다양 한 레벨을 전시 한다. 자주, 몇 가지 microelectrodes somal 구획에는 "자동"입니다. 그러나, microgrooves 내에서 대부분 microelectrodes 활성화 될 하는 경향이 있다 (그림 5a). microgrooves 신호 증폭기8기능을 잘 설명 합니다. 기록 된 신호 진폭이 소스 전류의 크기에서 뿐만 아니라 주변 미디어의 저항력에 따라 달라 집니다. microgroove 따라 저항을 크게 somal 구획 (그림 5b)에 microelectrodes의 비교 측정 된 신호 진폭을 증가 특히 높은입니다.
그림 1 . 미 발달 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 µEF에 경작입니다. (a) µEF의 사진. 눈금 막대: 1 cm. 경작 하는 µEF에 5 일 동안 보여주는 여러 축 삭 건너는 microgrooves 및 axonal 구획 (화살표)를 도달 하는 대뇌 피 질의 뉴런의 이미지 (b) 대표. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . µSpikeHunter 주요 그래픽 사용자 인터페이스의 화면 캡처. 사용자 수 µEF와 기록 데이터를 로드, 전파 스파이크 파도 식별, 그들의 방향을 결정 (참가자 또는 역행) 전파 속도 추정 하는 고. Kymograph 도구를 사용 하면 수동으로 전파 속도 kymograph에 그려진 라인에 따라 추정 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 참가자 전파 스파이크 웨이브는 microgroove 내 4 microelectrodes (E8-E11)에 의해 감지. 각 추적 대표 한 microelectrode 원시 녹음 3 씨에 대 한 µSpikeHunter 분석 후, 먼 microelectrodes (E8 및 e 11) 사이의 교차 상관 0.52 m의 전파 속도의 계산을 허용/s. 여기를 클릭 하십시오 이 그림의 확대 이미지 보기.
그림 4 . 는 microgrooves 통해 정보 사격. (a) 자발적인 활동의 2 분의 대표 래스터 줄거리 기록 11 microgrooves 따라. 각 도트는 전파 스파이크 파를 (단위) 4 microelectrodes에 의해 감지 되 고 µSpikeHunter 분석을 통해 식별을 나타냅니다. 높은-및 낮은 활동 microgroove 각각 노란색과 빨간색으로 강조 됩니다. (b) 10 분을 따라 두 강조 표시 된 microgrooves에 대 한 (속도-코딩)로 순간 발사 속도의 진화. 유일한 전파 단위는 발사 속도의 계산을 위해 고려 되었다. 참고 작업 동기화 다른도 불구 하 고 발사 속도 수준. 즉각적인 발사 속도 100 양의 표준 편차와 가우스 커널 스파이크 이벤트 컨볼루션 계산 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . µEF에 extracellular 녹음의 품질입니다. (a) µEF 기록 ( 생체 외에서15 일에 쥐 대뇌 피 질의 뉴런) 20 kHz와 300 Hz. 전극 행 somal 구획 및 행 8-11은 microgrooves에 해당 하는 1-7에서 하이 패스 필터의 샘플링 속도 시간 창 (1 초). (b) 지정 된 행 (총 녹화 시간 10 분)에서 (스파이크 메서드를 사용 하는 임계값, 부정적인 단계, 6 x 표준 편차 설정 감지)를 추출 하는 스파이크 진폭의 전체 범위의 상자와 수염 음모. 스파이크의 진폭은 somal 구획 (행 1-7; 16 활성 microelectrodes)의 microelectrodes에 비해 (행 8-11; 16 microgrooves), microgrooves에서 microelectrodes에 상당히 큽니다. 일방통행 ANOVA, 던의 여러 비교 테스트, * * *p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 미세 장치 및 표준 상용 디자인, MEA의 구성 하는 µEF를 조립 하는 방법 및 기록된 데이터를 분석 하는 방법을 보여 줍니다.
실험을 설계할 때 연구 해야 고려 생체 외에서 모델 microgroove 준비 구속 MEA 고정된 격자에 의해 제한 됩니다. 특정 미세 또는 MEA 디자인을 사용 하 여 특정 실험적인 요구에 따라 달라 집니다 하지만, 일반적으로, 동일한 절차 단계 다른 µEF 구성에 적용 한다.
전에 µEF 어셈블리 사용자 조립된 µEF를 나중에 다시 사용 하고자 하는 여부는 중요 한 결정 실험. 두 표면에 산소 플라즈마 치료 covalently MEAs20미세 장치를 결합 할 수 있습니다. 그러나,이 씰링 자주 만드는 MEA 칩 추가 실험을 위해 사용할 수 없게 패 시 베이 션 레이어를 손상 돌이킬 미세 장치를 분리. 이 문제를 회피, 연구 그룹 재사용 가능한 단점 (예를 들어, 이전 실험에서 파편)에 불구 하 고 탑재 된 µEF 경향이 있다. 신중 하 게 수행 하 여 실험, 한 수 안전 하 게 실험에서이 프로토콜에서 설명 하는 단계는 연결 하 고 미세 장치는 MEA를 손상 없이 분리.
µEF를 사용 하 여 집합에 microgrooves 내의 축 삭의 수 있습니다. 건너는 microgrooves 축 삭의 합리적인 수에 필요한 시간은 크게 절차, 즉 시드 셀 밀도 시드 셀에 따라 달라 집니다. 신경 교차 하는 3 ~ 5 이내 전체 microgroove 데이 프로토콜에 지정 된 밀도 사용 하 여 사업부
문화 환경 (즉, 인큐베이터 및 습도 수준)에 따라 미디어 문화 2 ~ 3 일 마다 교체 필요할 수 있습니다. 미디어를 갱신 하는 경우 주요 채널 내에서 미디어를 유지 하면서 µEF 우물에서 미디어를 제거 합니다. 그런 다음 부드럽게 천천히 최종 미디어 볼륨 우물을 작성 하기 전에 주요 채널을 통해 흐름을 허용 하는 µEF 웰 스에 미디어를 추가 합니다. 이러한 권장 사항에 따라 우리는 적어도 한 달에 대 한 건강 한 조건에서 이러한 문화를 유지 하기 위해 수 있습니다.
이 플랫폼의 주요 장점은 격리, 측정 axonal 신호를 추적 하는 기능입니다. µEF 녹음 간단 하지만 생성 될 수 있는 데이터의 큰 금액을 처리 하는 성가신 이며 데이터 분석의 좋은 지식이 필요 합니다. 여기에 사용 되는 분석 소프트웨어, µSpikeHunter21은 고급 아직 여러 상세한 정량화에 대 한 수 있는 직관적인 계산 도구 관련 측정값 (예: 전파 이벤트, 전파 속도 등)에 몇 가지 단계입니다. 데이터 분석은 아니지만이 프로토콜의 초점, 여기 이미 제공 하는 정보는 µEF 기록에서 의미 있는 데이터를 추출 수 있습니다. 그러나, 그것은 microgroove 당 단일 축 삭의 신뢰할 수 있는 격리로 실행 불가능 했던 유지 하는 것이 중요입니다. 따라서, (여러 축 삭은 microgroove 통과) 때문에 매우 복잡 한 스파이크 파형 발생 하 고 스파이크 타이밍 및 전파 속도 계산에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 제한 수 수 감쇠 (5 µ m) 아래 매우 좁은 microgrooves13 를 사용 하 여 및 정렬 기술21, 스파이크를 통해 어떤 다른 신호 소스를 구분할 수 있도록.
생체 외에서 문화 전체 vivo에서 복잡 정리 수 없습니다, 비록 그들의 µEF와 있습니다 잘 제어 상향식 연구 접근을. 우리는이 프로토콜 모두 초보자와 능숙 MEA 사용자 신경 회로에 electrophysiological 통신 공부를 위한 새롭고 신뢰할 수 있는 모델을 수립 하는 데 도움이 됩니다 바랍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 페더-경쟁 2020을 통해 푼도 최고 드 Desenvolvimento 지역 자금에 의해 융자 되었다-체제 프로그램 경쟁력 및 국제화 (POCI), 포르투갈 2020 그리고 포르투갈어에 의해 자금 FCT-Fundação 통해 파라 과학 전자는 기술 / Ministério 다 과학, 기술 전자 Ensino 우수한 PTDC/CTM-할머니/3146/2014 (POCI-01-0145-페더-016623) 프로젝트의 프레임 워크에서. 호세 C Mateus FCT (PD/BD/135491/2018)에 의해 지원 되었다. 파울로 Aguiar 과학적 고용의 프로그램이 과학-프로그램이 체제 Potencial Humano (POPH)-승진, ESF와 MCTES 및 프로그램 Investigador FCT, POPH 및 푼도 사회 최고에 의해 지원 되었다. 미세 소자 주앙 페드로 콘 데과 버지니아 추의 감독 아래 INESC-마이크로 및 나노기술, 포르투갈에서 조작 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
